杜春妍,趙云麗,阮徐莉,王新春,曹文疆

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院,2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,新疆 石河子 832008)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)被認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病,炎癥是AS發(fā)生發(fā)展過程中主要的生理和病理變化的標(biāo)志[1]。在AS發(fā)展早期階段,多種刺激因素誘導(dǎo)脂質(zhì)聚集在動脈血管壁部位,誘發(fā)的炎癥反應(yīng),引起細(xì)胞黏附,生成脂質(zhì)斑塊,引起平滑肌增殖、遷移,引發(fā)巨噬細(xì)胞泡沫化,致使細(xì)胞破裂死亡,細(xì)胞因子釋放,炎癥反應(yīng)發(fā)生的同時也影響脂質(zhì)代謝[2-3]。在AS發(fā)生發(fā)展中,高水平的氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)可以募集單核細(xì)胞,從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞上黏附分子的表達(dá)隨后單核細(xì)胞與內(nèi)膜的黏附,形成AS斑塊[4]。核因子κB (nuclear factor κB, NF-κB)和NOD樣受體家族3(NOD-like receptors 3,NLRP3)炎癥小體是AS發(fā)病機理中炎癥和細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5],因此,抑制巨噬細(xì)胞中NF-κB的活化可減少泡沫細(xì)胞的形成,并且抑制細(xì)胞凋亡及炎癥的產(chǎn)生[6]。

香青蘭(DracocephalummoldavicaL.)是青蘭屬(Dracocephalum)是唇形科(Lamiaceae)植物的重要成員,新疆地產(chǎn)維吾爾藥,資源豐富,維吾爾名為巴迪然吉布亞(Badiranjbuya),主要用于治療心血管類疾病;香青蘭總黃酮(total flavonoids ofDracocephalummoldavicaL.,TFDM)為香青蘭植物中提取的多種黃酮類成分的混合物,課題組前期研究證明[7],香青蘭中的黃酮成分可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,減少炎癥介質(zhì)的生成,達(dá)到抑制炎癥的發(fā)生或減輕炎癥程度,在抗炎,抗氧化,降血脂方面有明顯效果,可增加斑塊的穩(wěn)定性,從而起到保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用。因此本研究基于NF-κB和NLRP3炎癥信號通路,探究TFDM調(diào)控炎癥信號通路抗AS的機制,為預(yù)防治療AS提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞購自于武漢普諾賽公司(CL-0190)。TFDM(新疆自治區(qū)藥物研究所自知),純度為57%;辛伐他汀(北京Solarbio公司,批號IS0170),HPLC≥98%。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Thermo Fisher SCIENTIFIC公司,批號為8119446、26010074);ox-LDL廣州奕源生物有限公司,批號20190521);CCK-8試劑盒(北仁化學(xué)科技有限公司,批號CK04);IκB α 、NF-κB p65、NLRP3、IL-18、IL-1β 抗體(美國Abcam,貨號分別為ab32518、ab16502、ab214185、ab207323、ab234437);GAPDH、β-actin、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京中杉金橋,貨號分別為19F00411、201050827、140193、141987);TNF-α 、IL-10 ELISA 試劑盒(聯(lián)科生物有限公司,貨號分別為EK282/3-01、EK210/4-03)

1.2 儀器Forma 2 系列水套-三氣 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司);BCM-1000-生物凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);CKX53-倒置型電子顯微鏡(日本OLYMPUS公司)VE-180-垂直電泳及電轉(zhuǎn)儀(海天能科技有限公司);M200 PRO -多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司);Gel Doc EZ-Bio- Rad 凝膠成像系統(tǒng)(美國 Bio-Rad);LightCycler480 II-實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司);TGL-20M-臺式高速冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司);Axio Imager 2-蔡司全自動正置熒光顯微鏡(德國Zeiss公司);NanoDrop 2000c-微量分光光度計/核酸蛋白測定儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系來自武漢賽諾菲,細(xì)胞于 DEME完全培養(yǎng)基(含 10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素),并置于5% CO2、37 ℃ 、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.2泡沫細(xì)胞的建立 以25、50、100 mg·L-1ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞,CCK-8檢測細(xì)胞活力。同時將RAW264.7巨噬細(xì)胞均勻接種于6孔板內(nèi),給藥處理結(jié)束后吸去上清,用預(yù)冷的PBS多次洗滌細(xì)胞,在細(xì)胞表面加入固定液(甲醇或4%多聚甲醛),室溫下放置30 min后吸出固定液,用PBS洗2次,待爬片快干時加入提前配好的試劑進(jìn)行油紅O染色。

1.3.3CCK-8測定細(xì)胞毒性 將細(xì)胞隨機分為正常對照組(Normal):10 %的正常;模型對照組(Model):給予50 mg·L-1ox-LDL培養(yǎng)24 h;TFDM高、中、低劑量組(TFDM-H,TFDM-M組,TFDM-L):分別加100、50、25 mg·L-1TFDM 1 h后加入終濃度為 50 mg·L-1ox-LDL共同作用24 h;陽性對照組(Simvastatin組):加10 μmol辛伐他汀1 h后加入終濃度為50 mg·L-1ox-LDL共同作用24 h。處理結(jié)束后每孔加入100 μL稀釋的CCK-8溶液,繼續(xù)孵育2 h,檢測450 nm處的吸光度值。

1.3.4油紅O染色觀察TFDM對巨噬細(xì)胞泡沫化的影響 取對數(shù)生長期的的RAW264.7細(xì)胞,按照“2.3”項下進(jìn)行分組給藥處理后進(jìn)行油紅O染色,倒置顯微鏡下察看并拍照記錄,應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件計算染色面積。

1.3.5細(xì)胞活性氧的測定 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞,將細(xì)胞接種于24孔板中的細(xì)胞爬片上,按照分組進(jìn)行處理,于細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h后棄去細(xì)胞上清液,用PBS洗滌培養(yǎng)板中細(xì)胞2次,加入終濃度為10 μmol·L-1的DCFH-DA液1 mL,于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min,用無血清培養(yǎng)基洗3次以去除未結(jié)合的DCFH-DA,倒置熒光顯微鏡下拍照并觀察結(jié)果。使用Image-Pro Plus(IPP)軟件分析熒光拍照圖片,選擇相同測量面積(Area),以細(xì)胞內(nèi)ROS的Sum IOD值作為結(jié)果。

1.3.6ELISA法檢測巨噬細(xì)胞上清液TNF-α和IL-10的水平 根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作,檢測巨噬細(xì)胞上清液TNF-α和IL-10炎癥因子的表達(dá)。

1.3.7PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表達(dá) 按“2.3”項下方法處理細(xì)胞后分別提取各組細(xì)胞 RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR擴增,以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達(dá)量。引物序列及擴增產(chǎn)物長度見Tab 1。

Tab 1 Primer information table

1.3.8Western blot法檢測細(xì)胞中IκBα、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達(dá) 分組處理后分別提取細(xì)胞總蛋白、漿蛋白、核蛋白,采用BCA法測定其蛋白濃度。蛋白經(jīng)100 ℃變性處理10 min后,經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離,200 mA濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上;5%脫脂奶粉封閉1 h,分別加入一抗:IκBα(1 ∶1 000)、NF-κB p65(1 ∶1 000)、NLRP3(1 ∶500)、caspase-1(1 ∶1 000)、IL-18(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶1 000)、Histone H3(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶2 000),4 ℃孵育過夜,TBST 漂洗4次,每次5 min,然后加入二抗(稀釋比例1 ∶20 000),室溫孵育1 h,TBST清洗4次,每次5 min;ECL化學(xué)發(fā)光液法顯影,通過ImageJ 1.6.0軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 泡沫細(xì)胞模型的確定給予25、50、100 mg·L-1ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞24 h后,結(jié)果顯示ox-LDL濃度在50 mg·L-1時的細(xì)胞活力在80%以上;油紅O染色結(jié)果顯示,正常細(xì)胞內(nèi)未見脂滴;25 mg·L-1誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)少見脂滴;50 mg·L-1誘導(dǎo)的細(xì)胞脂滴明顯增多,環(huán)狀排列在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè);100 mg·L-1誘導(dǎo)的細(xì)胞大多已經(jīng)破裂凋亡,細(xì)胞核明顯,脂滴遍布分散。確定建立泡沫細(xì)胞模型的最佳刺激濃度為50 mg·L-1,此時細(xì)胞內(nèi)充滿橘紅色脂滴,細(xì)胞形態(tài)如同指環(huán),說明泡沫細(xì)胞造模成功。

Fig 1 A: Effects of different concentrations of ox-LDLon proliferation of RAW264.7 cells;B: Oil red O staining results(× 400)

2.2 CCK-8測定細(xì)胞活力結(jié)果如Fig 2,分組給藥處理后,Model組、TFDM-H組、TFDM-M組、TFDM-L組和Simvastatin組對細(xì)胞活力無影響(P>0.05),表明選擇的給藥濃度合適。

Fig 2 Effect of TFDM on viability of RWA264.7

2.3 TFDM對泡沫細(xì)胞的影響油紅O染色結(jié)果如Fig 3A,脂質(zhì)會被染成紅色,細(xì)胞核會被染成藍(lán)色。Normal組細(xì)胞內(nèi)無脂質(zhì)堆積;Model組細(xì)胞內(nèi)紅色明顯,大量脂質(zhì)堆積,巨噬細(xì)胞泡沫化明顯;TFDM組紅色減少,細(xì)胞核明顯,巨噬細(xì)胞泡沫化減輕;Simvastatin組細(xì)胞內(nèi)有少量脂質(zhì)被染成紅色。

與Normal組相比,Model組泡沫細(xì)胞脂質(zhì)明顯,染色面積相對明顯較大(P<0.05);與Model組相比,TFDM組脂質(zhì)染色面積減少(P<0.05);Simvastatin組脂質(zhì)染色面積減少(P<0.05)。結(jié)果表明TFDM可以減少巨噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬從而減輕巨噬細(xì)胞的泡沫化。

2.4 TFDM對巨噬細(xì)胞活性氧的影響與Normal組相比,Model組細(xì)胞內(nèi)ROS的含量明顯增加(綠色熒光增強),統(tǒng)計結(jié)果顯示差異具有顯著性(P<0.01);與Model組相比,TFDM-H組、TFDM-M組及TFDM-L組的細(xì)胞胞內(nèi)ROS的含量下降(綠色熒光明顯減弱),統(tǒng)計結(jié)果顯示差異具有顯著性(P<0.05);Simvastatin組細(xì)胞胞內(nèi)ROS的含量明顯下降(綠色熒光明顯減弱),統(tǒng)計結(jié)果顯示差異具有顯著性(P<0.01);TFDM組與Simvastatin組相比差異無顯著性(P>0.05)。實驗結(jié)果表明TFDM對泡沫化的巨噬細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生有明顯的抑制作用。

2.5 TFDM對巨噬細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α和IL-10的影響與Normal組比較,Model組中促炎因子TNF-α表達(dá)增加(P<0.001),抑炎因子IL-10表達(dá)減少(P<0.001);與Model組比較,TFDM-H組、TFDM-M組及TFDM-L組中促炎因子TNF-α表達(dá)均降低(P<0.05),抑炎因子IL-10表達(dá)均增加(P<0.05),且呈一定的濃度依賴性;Simvastatin組中TNF-α表達(dá)降低(P<0.05),抑炎因子IL-10表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 3 A: Oil red O staining result (× 400);B: Foam cell oil red O

2.6 TFDM對NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表達(dá)的影響與Normal組相比,Model組中的NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-18以及IL-1β mRNA的表達(dá)升高(P<0.01);與Model組相比,TFDM-H組、TFDM-M組及TFDM-L組的NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-18 和IL-1β mRNA的表達(dá)均降低(P<0.05),表明TFDM對泡沫化的巨噬細(xì)胞中NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表達(dá)有明顯的抑制作用;Simvastatin組的NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-18和IL-1β mRNA的表達(dá)降低(P<0.05);TFDM組與Simvastatin組相比差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 4 Effect of TFDM on relative fluorescence intensityof ROS in macrophages,Zeiss positive

Fig 5 Effect of TFDM on expression of TNF- α and IL-10

Fig 6 Effect of TFDM on expression of NF-KB p65, NLRP3,caspase-1, IL-1 β and IL-18

Fig 7 Effect of TFDM on expression of I κ Ba protein andNF- κB p65 in

2.7 TFDM對巨噬細(xì)胞中IκBα和NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響與Normal組比較,Model組的IκBα蛋白表達(dá)降低(P<0.01),胞質(zhì)中NF-κB p65蛋白表達(dá)降低(P<0.01),細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá)增加(P<0.05);與Model組比較,TFDM-H組、TFDM-M組及TFDM-L組的IκBα蛋白表達(dá)增加(P<0.05),胞質(zhì)中NF-κB p65蛋白表達(dá)增加(P<0.01),細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá)降低(P<0.05);Simvastatin組中的IκBα蛋白表達(dá)增加(P<0.05),胞質(zhì)中NF-κB p65蛋白表達(dá)增加(P<0.05),細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá)降低(P<0.05);TFDM組與Simvastatin組相比差異無顯著性(P>0.05)。

2.8 TFDM對NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達(dá)的影響與Normal組比較,Model組中NLRP3、caspase-1、IL-1β以及IL-18蛋白的表達(dá)蛋白表達(dá)增強(P<0.01);與Model組比較,TFDM-H組、TFDM-M組及TFDM-L組中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達(dá)蛋白表達(dá)降低(P<0.05),Simvastatin組中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達(dá)蛋白表達(dá)降低(P<0.05),TFDM組與Simvastatin組相比差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 8 Effect of TFDM on expression of NLRP3, caspase-1,

3 討論

在AS進(jìn)展中,巨噬細(xì)胞是第一個侵襲AS病變的炎癥細(xì)胞,并最終成為斑塊的主要組成部分[8]。巨噬細(xì)胞泡沫化及其死亡是AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),死亡的泡沫細(xì)胞會釋放大量的促炎細(xì)胞因子和介質(zhì),如IL-1β、IL-18和基質(zhì)金屬蛋白酶[9],這些促炎細(xì)胞因子和介質(zhì)進(jìn)一步觸發(fā)炎癥反應(yīng),炎癥因子及細(xì)胞因子可進(jìn)一步激活單核-巨噬細(xì)胞,此時的單核細(xì)胞收到信號被刺激分化為吞噬ox-LDL以及其他細(xì)胞分泌物的巨噬細(xì)胞,形成泡沫細(xì)胞,并在血管內(nèi)壁積聚,引起AS斑塊的形成[10]。因此,抑制炎癥在炎癥相關(guān)疾病治療中起關(guān)鍵作用。TFDM為新疆特種植物藥香青蘭植物中提取的多種黃酮類成分的混合物,而黃酮類化合物廣泛用于防治心腦血管類疾病,其能降低血管的脆性,改善血管的通透性、降低血脂和膽固醇[11-12]等。因此,在抗炎、抗氧化、降血脂方面有明顯效果。基于此,本研究選用ox-LDL誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型探討TFDM對巨噬細(xì)胞泡沫化及炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。

膽固醇代謝的失衡,特別是修飾過的低密度脂蛋白,會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞功能障礙,核受體激活改變,炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致AS[13]。巨噬細(xì)胞不僅組裝脂質(zhì),還釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細(xì)胞因子,進(jìn)一步刺激血管內(nèi)皮,促進(jìn)疾病進(jìn)展[14]。與此相一致,本研究發(fā)現(xiàn),在ox-LDL的作用下,RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)會儲存大量脂質(zhì),油紅O染色結(jié)果顯示,在50 mg·L-1ox-LDL的作用下可以成功將巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞;而給予TFDM干預(yù)后巨噬細(xì)胞的泡沫化明顯減輕,細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴減少;陽性藥辛伐他汀組干預(yù)后巨噬細(xì)胞泡沫化相較模型組也明顯減輕,而TFDM與辛伐他汀組差異無顯著性,說明TFDM可以減少巨噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬從而減輕巨噬細(xì)胞的泡沫化。ROS具有較強的毒性作用,會破壞細(xì)胞生物大分子成分及細(xì)胞器,ROS檢測結(jié)果顯示,巨噬細(xì)胞成為泡沫細(xì)胞時會有大量的ROS產(chǎn)生,而給予TFDM干預(yù)后巨噬細(xì)胞的ROS含量明顯降低,說明TFDM可以減輕ROS的生成。ox-LDL刺激泡沫細(xì)胞形成過程中會釋放炎性因子TNF-α,而在給予TFDM干預(yù)后,TNF-α的表達(dá)也明顯降低;此外,IL-10是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子,對炎癥有抑制作用,能抑制T細(xì)胞,單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化和效應(yīng)功能。而ox-LDL誘導(dǎo)使巨噬細(xì)胞中IL-10的表達(dá)明顯降低,在給予TFDM后,IL-10的表達(dá)明顯升高;表明TFDM對炎癥因子有一定的調(diào)節(jié)作用,且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

NF-κB是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的經(jīng)典途徑[15]?；罨腘F-κB進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮重要的作用,作為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和免疫的主要核轉(zhuǎn)錄因子[16]。有研究報道,TNF-α和IL-1β 等細(xì)胞因子的表達(dá)受到NF-κB調(diào)控,而其也可作為刺激因素,進(jìn)一步活化NF-κB,造成持續(xù)或放大的炎癥反應(yīng)[17]。本研究結(jié)果顯示,ox-LDL可促進(jìn)NF-κB入核,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用,導(dǎo)致NF-κB、NLRP3、IL-1β以及IL-18 mRNA表達(dá)上調(diào);并且在ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中,NF-κB/NLRP3炎癥信號通路的相關(guān)蛋白均被激活,而TFDM干預(yù)后,NF-κB p65核蛋白的表達(dá)被抑制,且NLRP3、caspase-1、IL-1β以及IL-18蛋白表達(dá)明顯被抑制,表明在AS的發(fā)生發(fā)展中NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路直接的參與了泡沫細(xì)胞的形成和巨噬的炎癥反應(yīng),而TFDM可以減輕這些炎癥蛋白的表達(dá)。此外,NF-κB在諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病和自身免疫性之類的炎性疾病中起著核心作用[18],抑制NF-κB 的活化可有效的抑制炎癥反應(yīng),在諸多疾病中有研究意義。

綜上所述,NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路的激活可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞死亡,發(fā)生炎癥反應(yīng),進(jìn)一步促進(jìn)AS的發(fā)生,而TFDM可以調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá),且對ROS的生成以及炎癥因子的生成有明顯的抑制作用,AS發(fā)生發(fā)展中,NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路會參與泡沫細(xì)胞的形成,因此可通過調(diào)節(jié)NF-κB/NLRP3炎癥小體的激活程度,來改善AS的進(jìn)展,這為AS新的防治策略以炎癥機制的不同環(huán)節(jié)為靶向研發(fā)新的抗炎藥物用于AS性疾病的治療提供了理論基礎(chǔ)。