任宇晴,唐 堂,李 穎,段應(yīng)鈴,李 寧,代睿欣,范 輝,蘭 天

(1. 廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院、廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心、糖脂代謝病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2. 廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院,3. 代睿欣中醫(yī)診所,廣東 廣州 510006)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是全球增長(zhǎng)最快的疾病之一,預(yù)計(jì)到2045年將影響6.93億成年人,其微血管并發(fā)癥(如糖尿病腎病(diabetes kidney disease, DKD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變等)將會(huì)導(dǎo)致DM患者死亡率增加、腎功能衰竭和總體生活質(zhì)量下降[1]。糖尿病腎病(diabetes kidney disease, DKD)是DM的一種嚴(yán)重且高發(fā)的并發(fā)癥,臨床表現(xiàn)為腎小球結(jié)節(jié)樣病變、持續(xù)白蛋白尿和腎小球?yàn)V過(guò)率逐漸下降[2],病理特征是腎小球和腎小管細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)的積累、肥大和纖維化[3]。我國(guó)臨床上DKD發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì),有統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,目前全球范圍內(nèi)DKD發(fā)病人數(shù)約為4億人,且預(yù)計(jì)2035年約增至5.92億,在全球人口中占8%～10%[4]。約有30%～40%的DM患者發(fā)展為DKD,其中50% 可進(jìn)展為終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)[5-6]。DKD的發(fā)生發(fā)展與腎臟纖維化進(jìn)展息息相關(guān),且腎臟纖維化是各種慢性腎臟疾病的重要病理特征和最終病理結(jié)果。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是介導(dǎo)腎臟纖維化的關(guān)鍵因子,Smads 是 TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中下游主要效應(yīng)分子[7]。研究表明當(dāng)TGF-β1/Smad 信號(hào)通路被激活時(shí),機(jī)體的生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮因子表達(dá)增多,使得細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)不斷沉積,進(jìn)而促進(jìn)腎臟纖維化,影響腎功能[8],細(xì)胞外基質(zhì)中存在纖維黏連蛋白(fibronectin, FN)及膠原蛋白(collagen),此二者大量分泌時(shí),將促進(jìn)腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展[9]。目前,臨床上常通過(guò)降低血糖、抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)及降低血壓等綜合措施干預(yù)DKD[10],但易出現(xiàn)低血糖等并發(fā)癥。因此,開發(fā)治療DKD的新型靶向藥物一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。降糖丸(jiangtang Wan,JTW)是廣東省中醫(yī)院代睿欣副主任醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)得出的簡(jiǎn)便效廉的方劑,由黃芪、人參、白術(shù)、石斛、黃連、葛根、玉竹、天花粉、生地黃等15味中藥組成,具有益氣健脾、滋陰降火之功效,主治DKD中氣陰兩虛、脾腎陽(yáng)虛等辯證。本研究旨在評(píng)價(jià)降糖丸在鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)合并高脂飲食誘導(dǎo)的DKD小鼠中的治療作用,并探討降糖丸改善DKD腎損傷及腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物32只C57BL6/J小鼠,♂,8周齡,質(zhì)量(20～26) g,SPF級(jí)。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2021-0057,購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心。在廣東藥科大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)已經(jīng)廣東藥科大學(xué)(中國(guó)廣州)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理委員會(huì)論證(動(dòng)物倫理號(hào):No.gdpulacspf2017619)。

1.2 藥物及試劑降糖丸(黃芪、人參、白術(shù)、石斛、黃連、葛根、玉竹、天花粉、生地黃等15味中藥),飲片購(gòu)自代睿欣中醫(yī)診所,批號(hào)為20220608,按比例稱取上述飲片制成丸劑;陽(yáng)性藥鹽酸二甲雙胍片(規(guī)格:0.5 g,批號(hào):ACA5354,中美上海施貴寶制藥有限公司);羧甲基纖維素鈉(批號(hào):20190304,生工生物工程有限公司);葡萄糖(批號(hào):20210901,天津市大茂化學(xué)試劑有限公司);STZ(批號(hào):WXBD0304V,美國(guó)Sigma公司);Schiff試劑(貨號(hào):DG0004,北京雷根生物技術(shù)有限公司),0.5%過(guò)碘酸溶液(貨號(hào):DG0001,北京雷根生物技術(shù)有限公司)、血肌酐(批號(hào):20210915,南京建成生物技術(shù)研究所)和尿蛋白(批號(hào):20210730,南京建成生物技術(shù)研究所)檢測(cè)試劑盒;高脂飲食(蛋白質(zhì)19%,脂肪18%,碳水化物50%,廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);FN抗體(Boster,貨號(hào):BA1772,批號(hào):153188),GAPDH抗體(Transgen,貨號(hào):HC307,批號(hào):Q10301),Smad 3抗體(CST, 貨號(hào):9523T,批號(hào):5),p-Smad 3抗體(佰嘉,貨號(hào):IPH2281),辣根酶標(biāo)記山羊抗兔lgG(H+L)(中杉金橋,貨號(hào):ZB-2301,批號(hào):229760111),DAB顯色液(Thermo Scientific,貨號(hào):1856090,批號(hào):UD283195),HRP標(biāo)記兔二抗(Promega,貨號(hào):W01B,批號(hào):0000497927),HRP標(biāo)記鼠二抗(Promega,貨號(hào):W402B,批號(hào):0000502814)。

1.3 儀器One-Touch Ultra型血糖儀(型號(hào):One-Touch Ultra Vue,美國(guó)強(qiáng)生);低溫高速離心機(jī)(型號(hào):cf1524r,美國(guó)SCILOGEX)奧林巴斯熒光顯微鏡(型號(hào):BX51,日本Olympus);多功能酶標(biāo)儀(型號(hào):1510,美國(guó)Thermo Fisher Scientific) ;微型蛋白電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(型號(hào):Power Pac Basic,美國(guó)BioRad)。

2 方法

2.1 建立動(dòng)物模型[11-12]所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,取32只雄性小鼠隨機(jī)分為4組,每組8只,即為正常對(duì)照組、模型組、二甲雙胍組(陽(yáng)性藥,200 mg·kg-1)、降糖丸組(1 250 mg·kg-1)。除正常組外,其余小鼠禁食12 h,持續(xù)4 d同一時(shí)間腹腔注射STZ,50 mg·kg-1,7 d后使用血糖儀檢測(cè)小鼠空腹血糖,當(dāng)小鼠空腹血糖值>11.1 mmol·L-1,表示DM模型建立成功,后續(xù)用高脂飲食喂養(yǎng)8周,以誘導(dǎo)DKD模型。降糖丸和二甲雙胍混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)中,每日固定時(shí)間灌胃給藥,給藥劑量如上所述。同時(shí),正常對(duì)照組和模型組給予等量等濃度 CMC-Na。持續(xù)給藥8 周后,小鼠禁食不禁水,于代謝籠中收集24 h尿液。最后一次給藥后24 h麻醉后眼眶取血,全血在室溫條件下靜置30 min,以3 000 r·min-1離心15 min得到小鼠血清樣本。脫頸椎處死小鼠,取單側(cè)腎臟的一半固定在福爾馬林溶液中,4 ℃固定24 h后,以乙醇梯度脫水后包埋在石蠟中,剩余腎臟組織用PBS沖洗,放入液氮速凍后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中。

2.2 生化檢測(cè)收集小鼠24 h尿液并記錄尿液體積。根據(jù)試劑盒的說(shuō)明,檢測(cè)24 h尿蛋白及血清中血肌酐、TC、TG水平。

2.3 腎臟組織病理學(xué)觀察取各組腎組織石蠟包埋后,切片厚度為4 μm。隨后進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色、馬松(masson)染色、糖原(periodic acid-schiff, PAS)染色,使用光學(xué)顯微鏡觀察腎臟結(jié)構(gòu)病理改變、腎間質(zhì)纖維化、腎組織糖原堆積情況并進(jìn)行組織學(xué)分析。

2.4 免疫組化(Immunocytochemistry,IHC)檢測(cè)小鼠腎組織中FN的表達(dá)將小鼠腎臟石蠟切片經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟后,使用檸檬酸鹽緩沖液在高溫高壓下進(jìn)行修復(fù),滴加3%過(guò)氧化氫室溫孵育以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。滴加1% BSA封閉1 h,滴加一抗FN(1 ∶200),4 ℃過(guò)夜,室溫孵育二抗1.5 h,PBS涮洗后進(jìn)行DAB顯色,蘇木素復(fù)染,將組織脫水后用中性樹脂封片,于顯微鏡下觀察小鼠腎組織中FN蛋白的表達(dá)。

2.5 熒光定量PCR檢測(cè)腎臟FN、TGF-β1及Ⅳ型膠原蛋白(Collagen Ⅳ)mRNA表達(dá)情況每只小鼠取20 mg腎組織研磨后提取總RNA。隨后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行熒光定量PCR并測(cè)定Ct值。擴(kuò)增條件:95 ℃反應(yīng)5 min, 95 ℃反應(yīng)10 s,60 ℃反應(yīng)15 s, 72 ℃反應(yīng)20 s。進(jìn)行40個(gè)周期的循環(huán)。結(jié)果以β-actin為內(nèi)參,根據(jù)各樣本Ct值,使用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量(△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)。引物序列詳見(jiàn)Tab 1。

2.6 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)小鼠腎組織中FN的蛋白表達(dá)量剪取小鼠腎臟組織后,加入RIPA裂解液后研磨,離心后收集上清,測(cè)定蛋白含量后將總蛋白定量至同一水平。在蛋白樣品中加入5× 蛋白上樣緩沖液,煮沸變性10 min,冷卻至室溫后上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。濕法轉(zhuǎn)膜后封閉,加入一抗、二抗孵育,最后以GAPDH為內(nèi)參,測(cè)定蛋白的相對(duì)含量,使用ImageJ 軟件分析條帶的灰度值。

Tab 1 Primer sequences

3 結(jié)果

3.1 降糖丸對(duì)DKD小鼠體質(zhì)量、空腹血糖、腎指數(shù)的影響模型組小鼠較正常對(duì)照組小鼠體質(zhì)量明顯降低,血糖明顯升高。與模型對(duì)照組相比,降糖丸組和二甲雙胍組小鼠血糖明顯下降,并能夠明顯降低STZ合并高脂飲食引起的腎指數(shù)升高(P<0.05)。給藥8 周后,降糖丸明顯降低DKD小鼠空腹血糖(P<0.01)。以上結(jié)果說(shuō)明,降糖丸能夠明顯改善STZ合并高脂飲食誘發(fā)的DKD小鼠腎指數(shù)及血糖升高,具有明顯的降血糖作用。

Fig 1 Effect of Jiangtang Wan on body weight of DKD mice n=6)

3.2 降糖丸對(duì)DKD小鼠的24 h尿量、24 h尿蛋白、血肌酐、血清TC、TG的影響與正常組相比,模型組小鼠24 h尿蛋白量明顯上升(P<0.01),血肌酐明顯上升(P<0.01),血清中TC、TG含量也明顯增加(P<0.01)。給藥降糖丸后,DKD小鼠的腎功能明顯改善,與模型組小鼠相比,降糖丸組小鼠的24 h尿蛋白量明顯降低(P<0.05),血肌酐值明顯降低(P<0.01),血清中TC含量明顯降低(P<0.01),血清中TG含量明顯降低(P<0.01)。這表明降糖丸給藥后能明顯保護(hù)DKD小鼠腎功能,并調(diào)節(jié)DKD小鼠的脂代謝紊亂,從而發(fā)揮對(duì)DKD的治療作用。

Tab 2 Effect of Jiangtang Wan on fasting blood glucose, kidney/body weight of DKD mice n=6)

3.3 降糖丸對(duì)DKD小鼠腎組織形態(tài)、糖原沉積、腎間質(zhì)纖維化的影響病理染色顯示,STZ組小鼠腎組織中腎小球基質(zhì)增生,系膜擴(kuò)張,球囊壁粘連,炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn);腎間質(zhì)出現(xiàn)大面積纖維化;腎小球及腎小管出現(xiàn)糖原大量堆積,腎小球基底膜增厚,腎小管基底膜增厚。降糖丸給藥后能明顯逆轉(zhuǎn)上述變化,尤其體現(xiàn)在改善腎間質(zhì)纖維化方面,表現(xiàn)類似出陽(yáng)性藥效果。以上結(jié)果表明,降糖丸能夠良好的改善DKD小鼠體內(nèi)腎臟病理?yè)p傷及腎間質(zhì)纖維化。

3.4 降糖丸對(duì)小鼠腎組織中FN表達(dá)的影響模型對(duì)照組小鼠腎組織中FN的陽(yáng)性著色程度明顯升高,較對(duì)照組差異明顯(P<0.01)。與模型組相比,陽(yáng)性藥組及降糖丸給藥組均可明顯減少小鼠腎臟中FN的陽(yáng)性表達(dá)(P<0.01),提示降糖丸可明顯抑制DKD小鼠腎組織中FN的表達(dá)。

3.5 降糖丸在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)DKD小鼠腎組織中FN、TGF-β1、Collagen Ⅳ的影響在mRNA水平上,與對(duì)照組相比,模型組FN表達(dá)明顯升高(P<0.01),TGF-β1明顯升高(P<0.01),給藥降糖丸后,DKD小鼠腎組織中FN,TGF-β1與Collagen Ⅳ在mRNA水平上均明顯下調(diào)(P<0.01,P<0.05),提示降糖丸可能是通過(guò)調(diào)節(jié)DKD小鼠腎組織中FN,TGF-β1與Collagen Ⅳ的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá),從而影響DKD小鼠的疾病發(fā)展。

3.6 降糖丸對(duì)DKD模型小鼠腎臟FN 、Smad 3及p-Smad 3蛋白表達(dá)的影響模型對(duì)照組小鼠腎臟中FN、Smad 3及p-Smad 3的蛋白表達(dá)明顯上調(diào),較正常組差異明顯(P<0.01或P<0.05);與模型組相比,降糖丸組和二甲雙胍組小鼠腎臟組織中FN、Smad 3及p-Smad 3蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01),見(jiàn)Fig 4、Tab 6。

Tab 3 Effect of Jiangtang Wan on 24-hour urine volume, 24-hour urinary protein quantity, serum creatinine, TC, TG of DKD mice n=6)

Fig 2 Effect of Jiangtang Wan on renal pathological changes in DKD mice (HE, 400×; PAS, 400×; Masson, 400×)

Fig 3 Effect of Jiangtang Wan on expression of FN in renal tissue of mice (IHC, 400×)

Tab 4 Effect of Jiangtang Wan on positive expression of FN in renal tissue of DKD mice

Tab 5 Effect of Jiangtang Wan on mRNA expression of FN, TGF-β1 and Col Ⅳ of DKD mice n=6)

4 討論

DM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,但目前研究認(rèn)為高血糖在DKD的發(fā)病早期及晚期中都具有關(guān)鍵作用[13]。高血糖狀態(tài)可改變細(xì)胞內(nèi)的代謝,包括影響葡萄糖代謝、脂代謝、線粒體呼吸鏈功能和呼吸鏈蛋白的解耦連等。病理情況下,持續(xù)的高血糖狀態(tài)會(huì)明顯增加糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs),同時(shí),腎功能受損時(shí)對(duì)AGEs清除能力降低,最終導(dǎo)致AGEs大量蓄積。高血糖狀態(tài)同時(shí)將會(huì)激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中的主要活性產(chǎn)物血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ),活化的AngⅡ通過(guò)上調(diào)TGF-β1促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化[14],從而參與DKD的發(fā)生和發(fā)展。目前大量研究表明,DKD患者的治療應(yīng)注重嚴(yán)格的血糖控制及高血壓治療,已有報(bào)道強(qiáng)化血糖控制可預(yù)防2型DM患者發(fā)展為終末期腎病[15]。二甲雙胍是2型DM降血糖的首選藥物,其降血糖作用已經(jīng)臨床證實(shí),但當(dāng)患者腎功能不全時(shí),二甲雙胍的腎臟清除率下降,血漿中二甲雙胍濃度上升,增加乳酸性酸中毒風(fēng)險(xiǎn)[16]。臨床上,血管緊張素受體阻滯劑(angiotensin receptor blocker, ARB)及鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑(sodium glucose cotransporter 2 inhibitor, SGLT2i)也是DKD的常規(guī)治療藥物。ARB可發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用,延緩尿蛋白進(jìn)展,明顯改善腎臟功能,降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn),控制血壓,但對(duì)血糖并無(wú)影響。SGLT2i類藥物能夠通過(guò)影響線粒體功能明顯改善腎功能,延緩慢性腎病發(fā)展,同時(shí)能夠降低血糖,改善DKD患者的高血糖狀態(tài)[17]。在本研究中,降糖丸能夠明顯降低DKD小鼠的空腹血糖水平,并且在減少DKD小鼠尿量、降低小鼠24 h尿蛋白、降低小鼠血肌酐、降低TGF-β1表達(dá)方面略優(yōu)于二甲雙胍,但對(duì)于DKD小鼠血尿素氮并無(wú)明顯影響。

Fig 4 Effect of Jiangtang Wan on protein expression of FN, Smad 3 and p-Smad 3 of DKD mice

Tab 6 Effect of Jiangtang Wan on protein expression of FN, Smad 3 and p-Smad 3 of DKD mice n=3)

降糖丸由多味中藥組成,其中主要成分為黃芪、人參、白術(shù)、石斛、黃連、葛根、玉竹、天花粉、生地黃,本方組成特點(diǎn)在于兼顧陰虛的病機(jī)的同時(shí),尤其重視脾胃的功能,與傳統(tǒng)中醫(yī)所認(rèn)為的陰虛為主要病機(jī)有所區(qū)別。脾胃是升清降濁的樞紐,脾胃功能受損,氣血陰液無(wú)法充盛,則表現(xiàn)為陰虛。因此,在治療DKD時(shí),不僅要注重養(yǎng)陰清熱,還必須兼顧脾胃功能,故黃芪、人參、白術(shù)的應(yīng)用是該方的特殊之處;石斛、黃連、葛根、玉竹、天花粉則主要用于清除胃火,同時(shí)生地黃能夠補(bǔ)腎陰、降腎火。同時(shí),現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明上述藥物具有一定的降糖作用[18],可以保護(hù)腎臟。綜合而言,該方除清肺熱外,對(duì)清胃熱、治療腎陰虧虛均有兼顧,用以針對(duì)目前DM發(fā)現(xiàn)較早、肺陰虛表現(xiàn)不明顯的情況,顧護(hù)中焦,恢復(fù)脾胃的升清降濁功能則是本處方的特殊之處,也是對(duì)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論的創(chuàng)新和發(fā)展。

綜上所述,本研究證明降糖丸可以減輕病理狀態(tài)下腎間質(zhì)纖維化,進(jìn)而明顯延緩DKD的病理進(jìn)程,其機(jī)制可能與抑制TGF-β1與FN的表達(dá)有關(guān)。然而本研究存在一定的局限性,需要對(duì)降糖丸有效成分進(jìn)行分析,明確降糖丸對(duì)于DKD模型中腎臟系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用,設(shè)置多個(gè)劑量驗(yàn)證降糖丸的量效關(guān)系,探究降糖丸治療DKD的具體分子機(jī)制,使其在患者體內(nèi)發(fā)揮更精準(zhǔn)的治療作用。