王學(xué)虎 ,袁 敏

(1.江蘇省公安廳 物證鑒定中心,南京 210012;2.南京海關(guān) 工業(yè)產(chǎn)品檢測中心,南京 210019)

草銨膦是非選擇性、內(nèi)吸附型轉(zhuǎn)基因耐除草劑作物,已被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[1]。法庭科學(xué)中最常見的是利用草銨膦故意破壞莊稼、植物案件,也有草銨膦投毒案件,因其毒性一般,死亡者大多是服毒自殺。由于草銨膦具有較強(qiáng)的極性和水溶性,含磷酸基團(tuán)和氨基酸基團(tuán),以及缺乏發(fā)色基團(tuán)等特性,氣相色譜-質(zhì)譜法[2]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]測定其含量時均需要衍生步驟,操作復(fù)雜,重復(fù)性差;非衍生化測定方法有離子色譜法[4]、離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]以及液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[6-7]。最為普遍的還是采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-15]測定環(huán)境樣品或食品中草銨膦原體及其代謝物的含量。對于基質(zhì)復(fù)雜的法庭科學(xué)樣品如人血,主要側(cè)重于草銨膦原體檢驗(yàn)[4],將原體與代謝物同時檢驗(yàn)的文獻(xiàn)較少[16],而這些方法大多需要經(jīng)過固相萃取小柱凈化,步驟繁瑣,并且所用的色譜柱價(jià)格昂貴,檢測成本高。

聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)農(nóng)藥殘留聯(lián)席會議(JMPR)報(bào)告顯示,山羊、蛋雞飼喂含草銨膦的飼料后,羊奶、雞蛋及其組織和排泄物中的主要?dú)埩舫煞譃椴蒌@膦游離酸,還有草銨膦游離酸代謝物3-甲基膦基-丙酸和少量的草銨膦-N-乙酰、2-甲基膦基-乙酸[17],但未見對中毒死者血液中草銨膦及其代謝物的報(bào)道。本工作通過兩例草銨膦中毒致人死亡案例,研究了死者血液中草銨膦原體及其代謝物,明確了草銨膦中毒死者血液中具有檢驗(yàn)價(jià)值的目標(biāo)物;并優(yōu)化血液前處理方法,采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草銨膦及其代謝物的含量,以實(shí)現(xiàn)人血中草銨膦及其代謝物的快速篩查檢驗(yàn)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LCMS-8050 型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;KQ3200DB數(shù)控型超聲儀;Centrifuge 5430型離心機(jī);XW-80A 型渦旋混合器。

草銨膦、3-甲基膦基-丙酸、草銨膦-N-乙酰單標(biāo)準(zhǔn)溶液:100.0 mg·L—1。

草銨膦和3-甲基膦基-丙酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:取適量的草銨膦、3-甲基膦基-丙酸單標(biāo)準(zhǔn)溶液,用水稀釋,配制成草銨膦、3-甲基膦基-丙酸質(zhì)量濃度均為20.0 mg·L—1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。使用時,用水稀釋至所需質(zhì)量濃度。

乙腈、氨水、乙酸銨均為色譜純;二氯甲烷為分析純;試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Dikma Polyamino HILIC 色譜柱(150 mm×2.0 mm,5 μm);柱溫40 ℃;流動相A 為含5 mmol·L—1乙酸銨的1.25%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨水溶液,B 為乙腈;流量0.6 mL·min—1;進(jìn)樣量2μL。梯度洗脫程序:0～2.0 min 時,A 為20%;2.0～6.0 min時,A 由20%升至95%,保持2.0 min;8.0～8.1 min 時,A 由95%跳轉(zhuǎn)至20%,保持1.9 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,負(fù)離子(ESI—)模式;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;碰撞氣為氬氣;霧化氣為氮?dú)?流量3 L·min—1;加熱氣為氮?dú)?流量10 L·min—1;干燥氣為氮?dú)?流量10 L·min—1;接口溫度300 ℃,加熱塊溫度400 ℃,脫溶劑管溫度250 ℃。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”代表定量離子;因未購置到2-甲基膦基-乙酸標(biāo)準(zhǔn)品,參照文獻(xiàn)[10]設(shè)置2-甲基膦基-乙酸的質(zhì)譜參數(shù)。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

取血樣0.4 mL于具蓋離心管中,加入0.2 mL水和1.2 mL乙腈,渦旋1 min,超聲10 min,于不小于4 000 r·min—1的轉(zhuǎn)速離心5 min;取上清液,加入1.2 mL 二氯甲烷,渦旋1 min,于不小于4 000 r·min—1的轉(zhuǎn)速離心5 min;取上層水相,經(jīng)0.22μm 水相濾膜過濾,濾液按照儀器工作條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

草銨膦及其代謝物大多為陰離子結(jié)構(gòu),直接檢驗(yàn)時一般普通反相色譜柱難以保留或者峰形太差[8,11],因此通常采用衍生化方式先將目標(biāo)物衍生成中性分子,然后再進(jìn)行檢測[3]。非衍生化直接檢驗(yàn)時一般需要使用強(qiáng)堿性流動相,并且要求色譜柱具有較強(qiáng)的耐堿性[6-7,9-16,18]。本工作選用酸度耐受范圍為pH 0～13,且價(jià)格低廉的Dikma Polyamino HILIC色譜柱(150 mm×2.0 mm,5μm),對流動相體系進(jìn)行考察。對于HILIC色譜柱,通常使用乙腈作為有機(jī)相。當(dāng)以1.25%氨水溶液為水相時(不添加乙酸銨),草銨膦及其代謝物3-甲基膦基-丙酸、草銨膦-N-乙酰出峰太早,均無法被保留;當(dāng)在其中添加1 mmol·L—1乙酸銨時,3種目標(biāo)物峰形均不好;當(dāng)添加5 mmol·L—1乙酸銨時,草銨膦、3-甲基膦基-丙酸和草銨膦-N-乙酰的峰形較好;當(dāng)水相中乙酸銨濃度達(dá)10 mmol·L—1時,草銨膦、3-甲基膦基-丙酸和草銨膦-N-乙酰的峰面積均下降,這是由于在ESI—掃描模式下,乙酸銨會起到抑制離子化作用。綜合目標(biāo)物峰形和實(shí)際檢測效果,試驗(yàn)選擇的流動相體系為含5 mmol·L—1乙酸銨的1.25%氨水溶液-乙腈。

2.2 草銨膦中毒死者血液中目標(biāo)物的確定

為研究草銨膦中毒死者血液中的原體和代謝物,取1份空白心血和兩份口服草銨膦中毒死者的心血,按照血液、水、乙腈的體積比為1∶1∶3對其進(jìn)行處理,目的是確保草銨膦及其代謝物都能進(jìn)入上清液。結(jié)果顯示:空白心血中無干擾[圖1(a)],兩份中毒死者心血中除了檢出草銨膦原體,還檢出兩種代謝物3-甲基膦基-丙酸和草銨膦-N-乙酰,未檢出代謝物2-甲基膦基-乙酸[圖1(b)],與JMPR報(bào)告不一致[17],但代謝物草銨膦-N-乙酰的信號強(qiáng)度很低。原因可能是WHO 描述的食品中毒死者的“暴露”毒物時間長,而口服草銨膦中毒死者的心血“暴露”毒物時間短,草銨膦部分脫氨基,代謝為3-甲基膦基-丙酸,少量草銨膦乙酰化,代謝為草銨膦-N-乙酰,而極少3-甲基膦基-丙酸脫亞甲基,代謝為2-甲基膦基-乙酸,或者中毒者因死亡停止新陳代謝,導(dǎo)致3-甲基膦基-丙酸的代謝尚未完成。因此,草銨膦中毒死者心血中主要以原體草銨膦和代謝物3-甲基膦基-丙酸為主,并含有少量草銨膦-N-乙酰。由于死者心血中草銨膦-N-乙酰含量極低,在檢驗(yàn)上無價(jià)值,因此對于草銨膦中毒死者的血液等體內(nèi)生物檢材,應(yīng)側(cè)重于草銨膦原體和代謝物3-甲基膦基-丙酸的檢測。

圖1 空白心血和口服草銨膦中毒死者心血中草銨膦及其代謝物的MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of glufosinate-ammonium and its metabolites in the blank heart blood and heart blood of poisoning decedents caused by oral glufosinate-ammonium

2.3 前處理方法的選擇

草銨膦及其代謝物3-甲基膦基-丙酸均屬于強(qiáng)極性有機(jī)物,無法使用有機(jī)溶劑萃取、凈化和濃縮,對于血液樣品,優(yōu)先選用乙腈沉淀蛋白。取0.4 mL草銨膦中毒死者心血,按照血液、水、乙腈的體積比分別為1∶0∶3,1∶0.5∶3,1∶1∶3,1∶1∶4,1∶1∶5,1∶1.5∶5,1∶2∶5加入一定量的水和乙腈,考察了血液、水、乙腈的體積比對蛋白沉淀效果和草銨膦、3-甲基膦基-丙酸峰面積的影響。結(jié)果表明:當(dāng)水的比例較小時,血液會凝聚成團(tuán),影響上機(jī)檢測,但繼續(xù)增大水的比例,會出現(xiàn)懸浮的紅細(xì)胞,導(dǎo)致過濾困難和色譜柱堵塞;當(dāng)血液、水、乙腈的體積比為1∶0.5∶3時,蛋白沉淀效果較好,且草銨膦和3-甲基膦基-丙酸峰面積均較大,信噪比高。乙腈加水沉淀蛋白本質(zhì)上屬于稀釋,可能會增加目標(biāo)物在低濃度水平下漏檢的風(fēng)險(xiǎn),且不同來源血液的基質(zhì)效應(yīng)對定量分析影響較大。因草銨膦及其代謝物3-甲基膦基-丙酸易溶于水、難溶于有機(jī)溶劑,在蛋白沉淀后的上清液中添加一定量的二氯甲烷,可以使乙腈與二氯甲烷互溶并與水分層,從而有效去除非極性或弱極性雜質(zhì),使草銨膦及其代謝物保留在水相中。試驗(yàn)選擇加入與乙腈相同體積的二氯甲烷,結(jié)果發(fā)現(xiàn)草銨膦和3-甲基膦基-丙酸的峰面積和信噪比均比不加二氯甲烷時的大。綜上分析,試驗(yàn)選擇以血液、水、乙腈、二氯甲烷的體積比為1∶0.5∶3∶3進(jìn)行前處理。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

用水稀釋草銨膦和3-甲基膦基-丙酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,配制成質(zhì)量濃度為0.4,2.0,8.0 mg·L—1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照儀器工作條件進(jìn)行測定,記錄草銨膦和3-甲基膦基-丙酸的峰面積;按照試驗(yàn)方法對空白心血進(jìn)行處理,然后在獲得的空白提取液中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成0.4,2.0,8.0 mg·L—1的基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個濃度水平制備6組平行樣,按照儀器工作條件進(jìn)行測定,記錄草銨膦和3-甲基膦基-丙酸的平均峰面積。以相同濃度水平目標(biāo)物在基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和在水配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的峰面積百分比計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示:3 個濃度水平下,草銨膦的基質(zhì)效應(yīng)為71.7%～84.4%,表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng);3-甲基膦基-丙酸的基質(zhì)效應(yīng)為85.5%～95.5%,表現(xiàn)為輕度基質(zhì)抑制效應(yīng)。為減小基質(zhì)效應(yīng)的影響,試驗(yàn)選擇采用基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列建立工作曲線。

2.5 工作曲線、檢出限和測定下限

取空白心血0.4 mL,加入0.1,0.2,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0,4.0,8.0,12.0,16.0,20.0 mg·L—1的草銨膦和3-甲基膦基-丙酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.2 mL,配制成目標(biāo)物質(zhì)量濃度為0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mg·L—1的基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按照1.3節(jié)試驗(yàn)方法進(jìn)行處理(去除添加0.2 mL 水的步驟)和測定。以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算。結(jié)果顯示:草銨膦和3-甲基膦基-丙酸工作曲線的線性范圍均為0.2～10.0 mg·L—1,線性回歸方程分別為y＝7.783×103x—3.794×102和y＝6.807×104x—5.119×103,相關(guān)系數(shù)分別為0.999 6和0.996 2。

采用空白樣品加標(biāo)的方法,參考GA/T 1900—2021《法庭科學(xué) 生物檢材中毒物毒品定性定量檢驗(yàn)方法通用要求》,結(jié)果顯示,草銨膦和3-甲基膦基-丙酸的檢出限均為0.1 mg·L—1,測定下限均為0.2 mg·L—1。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

在空白心血中加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,得到質(zhì)量濃度為0.4,2.0,8.0 mg·L—1的基質(zhì)匹配加標(biāo)血樣,每個濃度水平制備6個平行樣,按照試驗(yàn)方法進(jìn)行處理和測定,計(jì)算回收率;然后在1 d內(nèi)6個不同時間點(diǎn)對其進(jìn)行測定,并在同一時間連續(xù)測定6 d,計(jì)算草銨膦及其代謝物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.7 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對兩份實(shí)際案例獲取的草銨膦中毒死者的心血進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:樣品中草銨膦質(zhì)量濃度分別為5.8 mg·L—1和7.5 mg·L—1,代謝物3-甲基膦基-丙酸質(zhì)量濃度分別為5.3 mg·L—1和5.8 mg·L—1,草銨膦中毒死者心血中草銨膦原體和代謝物-3-甲基膦基-丙酸含量均相對較高[4,8],容易檢出。

本工作明確了草銨膦中毒死者血液中草銨膦原體的主要代謝物為3-甲基膦基-丙酸,提出了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草銨膦和3-甲基膦基-丙酸含量的方法。該方法所需檢材量少,前處理簡單、快速,為探索強(qiáng)水溶性的毒物萃取開辟了新的途徑,對除草劑草銨膦中毒的快速篩查檢驗(yàn)具有很好的參考價(jià)值。