王正云 劉子瀟 展躍平

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇 泰州 225300)

2021年,全國淡水產(chǎn)品產(chǎn)量3 303.05萬t,同比增長2.11%,其中淡水魚占絕大多數(shù),在淡水魚加工過程中魚頭、魚皮、魚骨及魚內(nèi)臟常常被丟棄,造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[1-2]。草魚是最常見的淡水魚之一,據(jù)統(tǒng)計(jì),每加工100 t草魚大約會(huì)產(chǎn)生30～50 t副產(chǎn)物,其內(nèi)臟含有豐富的油脂,含油率可達(dá)20%以上。魚油中富含多種對人體健康有利的功能性成分,包括二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等多不飽和脂肪酸,具有非常高的營養(yǎng)價(jià)值,可調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防老年癡呆、提高記憶力、提高機(jī)體免疫力等[3-5]。

目前,魚油的提取方法主要包括蒸煮法、隔水蒸煮法、熱水提取法、低溫提油法、酶法等。酶解法提取魚油是在魚或魚的加工副產(chǎn)物水解過程中加入蛋白酶,破壞蛋白質(zhì)與脂肪之間關(guān)系,使脂肪游離出來,從而實(shí)現(xiàn)對魚油的提取,相對于蒸煮法、熱水提取法等傳統(tǒng)水解法,酶解法不僅提取效率較高,而且酶解反應(yīng)條件溫和、對魚油中的功能性成分破壞小,可大大提高魚制品的附加值[6-7]。

趙保堂等[8]以虹鱒魚內(nèi)臟為原料,采用超聲波輔助法提取虹鱒魚油,提取率可達(dá)95.10%;汪學(xué)榮等[9]利用超聲波輔助提取三文魚油,提取率達(dá)92.60%;曹璇等[10]以金鯧魚骨為原料,采用超聲波輔助稀堿水解法提取金鯧魚骨油,提取率為80.51%。而利用超聲波輔助酶法提取草魚內(nèi)臟中魚油的研究尚未見報(bào)道。研究擬采用超聲波輔助酶法對草魚內(nèi)臟魚油提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并通過氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法測定草魚內(nèi)臟魚油中的脂肪酸組成,以期為提高草魚下腳料的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

草魚:市售;

中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶:1 000 U/g,上海伯奧生物科技有限公司;

37種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品:美國Sigma公司;

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋:SSW-420-2S型,蘇州江東精密儀器有限公司;

組織搗碎機(jī):DS-1型,上海精密儀器儀表有限公司;

酸度計(jì):EL20K型,梅特勒—托利多儀器有限公司;

電子天平:AL204型,梅特勒—托利多儀器有限公司;

超聲波設(shè)備:KQ-300VSM型,昆山超聲儀器有限公司;

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:RE-52D型,蘇州江東精密儀器有限公司;

高速大容量離心機(jī):Centrifuge 5810R型,德國艾本德公司;

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀:Trace1310 ISQ型,德國Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚內(nèi)臟處理 剛宰殺的草魚內(nèi)臟,去除魚膽、魚腸等殘留物,使用蒸餾水清洗干凈,并用紗布將水分瀝干,搗碎,攪拌均勻后放置于保鮮袋內(nèi),于0～4 ℃冷藏備用[7-9]。

1.3.2 草魚內(nèi)臟魚油提取工藝 稱取50 g草魚內(nèi)臟樣品于200 mL耐高溫密封袋中,按固液比(m樣品∶m蒸餾水)為1∶1加入無CO2蒸餾水,使用緩沖溶液將pH調(diào)至7.0,加入2.5%蛋白酶,混勻,酶解溫度為45 ℃,超聲處理功率為50 W,超聲處理時(shí)間為30 min[10-11]。超聲處理后,將樣品取出并于45 ℃保溫酶解2 h(每10 min搖勻一次)。100 ℃水浴滅酶處理,4 000 r/min離心15 min,用膠頭滴管吸取離心管內(nèi)上層油脂相,得到草魚內(nèi)臟粗制魚油[12]。

1.3.3 草魚內(nèi)臟精制魚油制備 參照文獻(xiàn)[12-13]并修改。

(1) 脫膠:將草魚內(nèi)臟粗魚油于80 ℃水浴并不斷攪拌,按魚油質(zhì)量的1%加入80%磷酸,攪拌1 min,5 000 r/min離心10 min,用膠頭滴管吸取漂浮在上層的油狀液體,即脫膠魚油。

(2) 脫酸:50 ℃水浴加熱脫膠魚油,按魚油質(zhì)量的0.5%加入12% KOH溶液,攪拌均勻,70 ℃水浴20 min,離心,去除固體沉淀后用適量熱去離子水除去殘留皂,重復(fù)1次,4 000 r/min離心10 min,用膠頭滴管吸出上層淡黃色油狀液體,得脫酸魚油。

(3) 脫色:將脫酸魚油于70 ℃水浴,按魚油質(zhì)量的2%加入活性炭,用玻璃棒攪拌0.5 h,抽濾,重復(fù)3次,直至活性炭完全濾出,得脫色魚油。

(4) 脫臭:脫色魚油于50 ℃真空干燥箱,真空脫臭30 min。

1.3.4 魚油提取率計(jì)算 根據(jù)文獻(xiàn)[14],按式(1)計(jì)算魚油得率。

X=m2/m1×100%,

(1)

式中:

X——草魚內(nèi)臟魚油提取率,%;

m1——草魚內(nèi)臟質(zhì)量,g;

m2——提取的草魚內(nèi)臟魚油質(zhì)量,g。

1.3.5 蛋白酶的篩選 選用4種蛋白酶(中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶)、酶添加量占魚油質(zhì)量的2%、酶解時(shí)間2.0 h、按表1進(jìn)行酶解,篩選出最合適的蛋白酶。

表1 蛋白酶的酶解溫度和pH值

1.3.6 單因素試驗(yàn)

(1) 酶添加量:固定酶解溫度45 ℃,超聲波處理功率100 W,超聲波處理時(shí)間30 min,酶解時(shí)間2 h,考察酶添加量(0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,2.5%,3.0%)對魚油提取率的影響。

(2) 酶解時(shí)間:固定酶添加量2%,酶解溫度45 ℃,超聲波處理功率100 W,超聲波處理時(shí)間30 min,考察酶解時(shí)間(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 h)對魚油提取率的影響。

(3) 酶解溫度:固定酶添加量2%,超聲波處理功率100 W,超聲波處理時(shí)間30 min,酶解時(shí)間2 h,考察酶解溫度(35,40,45,50,55,60 ℃)對魚油提取率的影響。

(4) 超聲波處理時(shí)間:固定酶添加量2%,酶解溫度45 ℃,超聲波處理功率100 W,酶解時(shí)間2 h,考察超聲波處理時(shí)間(10,20,30,40,50,60 min)對魚油提取率的影響。

(5) 超聲波處理功率:固定酶添加量2%,酶解溫度45 ℃,超聲波處理時(shí)間30 min,酶解時(shí)間2 h,考察超聲波處理功率(50,100,150,200,250,300 W)對魚油提取率的影響。

1.3.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、超聲波處理功率進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.8 脂肪酸組成分析 向草魚內(nèi)臟魚油中加入2 mL 2%的氫氧化鈉—甲醇溶液,85 ℃水浴0.5 h,加入3 mL 14%的三氟化硼甲醇溶液,85 ℃水浴0.5 h,向離心管中加入1 mL正己烷,震蕩萃取2 min,靜置1 h。從分層后的離心管中吸取100 μL上層清液,用正己烷定容至1 mL,用0.45 μm濾膜過濾,供氣相色譜—質(zhì)譜測定。

1.3.9 脂肪酸的氣相色譜—質(zhì)譜分析

(1) 氣相色譜條件:HP-88色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm);進(jìn)樣口溫度240 ℃;程序升溫為100 ℃保持15 min,以15 ℃/min升溫至190 ℃保持25 min,以2.5 ℃/min升溫至235 ℃保持4 min;載氣流速1.0 mL/min,不分流,進(jìn)樣量1 μL。

(2) 質(zhì)譜條件:電離方式EI,電子能量70 eV;離子源溫度280 ℃;傳輸線溫度280 ℃;溶劑延遲時(shí)間5.00 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均平行3次,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,運(yùn)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶種類的選擇

由圖1可知,4種蛋白酶中草魚內(nèi)臟粗魚油提取率最高的是中性蛋白酶,其次為胰蛋白酶和堿性蛋白酶,木瓜蛋白酶的提取效果最差,因此選擇中性蛋白酶提取草魚內(nèi)臟魚油。

圖1 酶種類對內(nèi)臟魚油提取率的影響

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶添加量 由圖2可知,魚油提取率隨酶添加量的增加呈先高后低的變化趨勢,當(dāng)酶添加量為0.5%～2.0%時(shí),魚油提取率逐漸升高,可能是隨著酶添加量的增加,與底物的接觸越來越充分,釋放出的魚油也越來越多,酶解一定時(shí)間后,兩者之間完全結(jié)合,魚油提取率達(dá)到最高。當(dāng)酶添加量>2%時(shí),魚油提取率隨酶添加量的增加略有下降,可能是因?yàn)槊柑砑恿窟^多,對酶解本身具有負(fù)面影響,導(dǎo)致蛋白酶活性下降。綜合考慮,選擇酶添加量為2%。

圖2 酶添加量對內(nèi)臟魚油提取率的影響

2.2.2 酶解時(shí)間 由圖3可知,草魚內(nèi)臟粗魚油提取率隨酶解時(shí)間的延長不斷升高,當(dāng)酶解時(shí)間為2～3 h時(shí),草魚內(nèi)臟粗魚油的提取率變化較小。這主要是酶與底物的結(jié)合程度隨酶解時(shí)間的延長越來越充分,使得蛋白質(zhì)和脂肪之間的結(jié)合被打破得越來越徹底,脂肪進(jìn)入游離狀態(tài)[15-16]。但隨著酶解時(shí)間的延長,魚油顏色逐漸加深,可能是過長的酶解時(shí)間會(huì)加劇魚油中多不飽和脂肪酸的氧化,導(dǎo)致草魚內(nèi)臟魚油品質(zhì)下降,結(jié)合實(shí)際確定最佳酶解時(shí)間為2 h。

圖3 酶解時(shí)間對內(nèi)臟魚油提取率的影響

2.2.3 酶解溫度 由圖4可知,酶解溫度較低時(shí),草魚內(nèi)臟粗魚油提取率較低,酶解溫度升高后,蛋白酶能更有效地分解蛋白質(zhì),大量的魚油開始釋放出來,魚油提取率整體呈先上升后下降的趨勢,當(dāng)酶解溫度為45 ℃時(shí),魚油提取率最高。這是因?yàn)槊附鉁囟葘Σ蒴~內(nèi)臟魚油提取率具有雙方面的影響,酶解溫度的升高普遍加速了分子熱運(yùn)動(dòng),對提高草魚內(nèi)臟粗魚油提取率有積極作用,但一旦溫度超過酶解所能承受的范圍,酶蛋白就會(huì)發(fā)生變性,從而使酶活性大大降低,甚至失去活性。因此,較佳酶解溫度為45 ℃。

圖4 酶解溫度對內(nèi)臟魚油提取率的影響

2.2.4 超聲波處理時(shí)間 由圖5可知,當(dāng)超聲波處理時(shí)間為10～30 min時(shí),魚油提取率隨超聲波處理時(shí)間的延長不斷上升,當(dāng)超聲波處理時(shí)間為30 min時(shí),魚油提取率達(dá)到最大值。繼續(xù)進(jìn)行超聲波處理,魚油得率則隨處理時(shí)間的增加不斷下降,可能是因?yàn)槌暡ㄌ幚頃r(shí)間過短,不能使酶與底物充分接觸,導(dǎo)致酶解不充分,魚油提取率低;隨著超聲波處理時(shí)間的延長,酶與底物充分接觸,越來越有利于蛋白酶的酶解反應(yīng),魚油提取率逐步升高。但超聲波處理時(shí)間過長可能會(huì)導(dǎo)致蛋白酶的酶活性降低,使魚油提取率下降[17-18]。綜上,超聲波處理時(shí)間取30 min。

圖5 超聲波處理時(shí)間對內(nèi)臟魚油提取率的影響

2.2.5 超聲波處理功率 由圖6可知,當(dāng)超聲波處理功率為50～100 W時(shí),魚油提取率隨超聲波處理功率的增大而升高,當(dāng)超聲波處理功率為100 W時(shí),草魚內(nèi)臟魚油提取率可達(dá)64.8%,可能是因?yàn)槌暡芗訌?qiáng)細(xì)胞的空化作用,同時(shí)還可促進(jìn)魚油的擴(kuò)散,從而增加魚油的提取率。當(dāng)超聲波處理功率>100 W時(shí),草魚內(nèi)臟魚油提取率則隨超聲波處理功率的增加呈下降趨勢,可能是因?yàn)槌暡ㄌ幚砉β蕿?00 W時(shí),溶劑與產(chǎn)物的運(yùn)動(dòng)速度加快,濃度差發(fā)生變化,傳質(zhì)動(dòng)力增強(qiáng),而超聲波處理功率過高會(huì)改變酶的空間構(gòu)象而降低酶活性或使其失活,從而導(dǎo)致魚油提取率下降,因此最佳超聲功率為100 W。

圖6 超聲波處理功率對內(nèi)臟魚油提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、超聲波處理功率進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化草魚內(nèi)臟魚油提取工藝,試驗(yàn)因素水平見表2,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 正交分析設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3可知,各因素對魚油提取率的影響依次為酶解溫度>酶添加量>超聲波處理功率>酶解時(shí)間,最佳提取工藝為A3B2C2D1,即酶添加量2.5%、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度45 ℃、超聲波處理功率50 W。根據(jù)確定的最佳內(nèi)臟魚油提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到魚油提取率為68.4%(n=3)。

由表4可知,酶解溫度和酶加入量對草魚內(nèi)臟魚油提取率影響顯著(P<0.05),酶解時(shí)間和超聲波處理功率對草魚內(nèi)臟魚油提取率影響不顯著,與極差分析的結(jié)果基本相符。

表4 正交試驗(yàn)方差分析?

2.4 草魚內(nèi)臟魚油脂肪酸組成分析

由表5可知,草魚內(nèi)臟魚油中共有27種脂肪酸,主要為C12～C24脂肪酸,在草魚內(nèi)臟魚油中含量最多的依次為油酸、亞油酸和棕櫚酸,其中有10種是飽和脂肪酸,在總脂肪酸中含量占比為21.12%,主要為棕櫚酸和硬脂酸,而棕櫚酸含量最高,在總脂肪酸中含量占比為15.28%;單不飽和脂肪酸有7種,在總脂肪酸中含量占比為54.68%,主要為油酸、棕櫚油酸和二十碳一烯酸,而油酸含量最高,達(dá)到總脂肪酸含量的50.11%;多不飽和脂肪酸有10種,在總脂肪酸中含量占比為24.20%,主要為亞油酸,在總脂肪酸中含量占比為19.71%。這與郭休玉等[19]的結(jié)果相比,多了3種微量的二十二碳以上的長鏈脂肪酸,如二十三碳酸、二十二碳二烯酸和二十四碳一烯酸,原因可能是乙醇是極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑,而魚油極性較弱,提取不完全,同時(shí)試驗(yàn)環(huán)境、試驗(yàn)條件和脂肪酸混標(biāo)也不一樣。

表5 草魚內(nèi)臟魚油脂肪酸組成及相對含量

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明,超聲波輔助酶提取草魚內(nèi)臟魚油的最優(yōu)提取條件為采用中性蛋白酶,酶添加量為2.5%、酶解時(shí)間為2 h、酶解溫度為45 ℃、超聲波處理功率為50 W,超聲波處理時(shí)間為30 min,此條件下魚油提取率可達(dá)68.4%。草魚內(nèi)臟魚油中共含有27種脂肪酸,其中飽和脂肪酸10種,占總脂肪酸含量的21.12%,主要為棕櫚酸和硬脂酸;單不飽和脂肪酸7種,占總脂肪酸含量的54.68%,主要為油酸、棕櫚油酸和二十碳一烯酸;不飽和脂肪酸10種,占總脂肪酸含量的24.20%,主要為亞油酸。后續(xù)可對草魚內(nèi)臟魚油脫腥、保藏性能及新型內(nèi)臟魚油制品等進(jìn)行研究。