賀舒雯朱豪杰韓鵬薇楊賽杰崔 波程云輝, 李虹輝文 李

(1. 長沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,湖南 長沙 410114;2. 齊魯工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 濟(jì)南 250353)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦,是淡水經(jīng)濟(jì)蝦類,其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美且營養(yǎng)價(jià)值高廣受人們的喜愛。中國作為世界上最大的克氏原螯蝦生產(chǎn)和消費(fèi)國,每年產(chǎn)生數(shù)百萬噸蝦殼等副產(chǎn)物,絕大部分副產(chǎn)物被直接丟棄[1]。研究[2-4]表明,蝦殼中富含蛋白質(zhì)和各種礦物元素,酶解克氏原螯蝦殼蛋白制備的生物活性肽含有豐富的氨基酸,可為機(jī)體提供所需的營養(yǎng)和能量。此外,蝦殼活性肽在體外具有較強(qiáng)的自由基清除能力和還原能力,被證明具有較好的抗氧化潛力。但是,當(dāng)前關(guān)于克氏原螯蝦蝦殼肽的研究主要集中在體外抗氧化活性評(píng)價(jià),而對(duì)機(jī)體內(nèi)抗氧化應(yīng)激作用及機(jī)制研究鮮有報(bào)道。

生物活性肽(Bioactive peptides,BP)是由氨基酸通過肽鍵共價(jià)連接形成的有機(jī)物質(zhì),是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物,兼具氨基酸與蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能,在機(jī)體健康中發(fā)揮著重要作用[5]。已有研究報(bào)道,生物活性肽具有營養(yǎng)、促消化、抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等功能特性[6-7];生物活性肽可有效清除體內(nèi)過剩的活性氧自由基,保護(hù)細(xì)胞和線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能,還可促進(jìn)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性,以及降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛含量,在保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷中起著重要作用[8-10]。氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)一種有害的氧化還原失衡狀態(tài),過多的活性氧自由基會(huì)對(duì)核酸、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)等生物大分子造成氧化損害,影響細(xì)胞的功能甚至存活,是導(dǎo)致組織損傷和疾病發(fā)生的重要因素之一[11-12]。

研究[13]發(fā)現(xiàn),酶解牙鲆肌肉蛋白制備的生物活性肽對(duì)AAPH誘導(dǎo)的Vero腎成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。紅鰭笛鯛魚鱗肽可保護(hù)果蠅免受H2O2、百草枯和紫外線照射引起的氧化損傷[14]。來源于金烏賊中的抗氧化肽能提高超氧化物歧化酶活性,降低氧化損傷秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧和丙二醛含量,具有激活抗氧化防御、抑制自由基和脂質(zhì)過氧化的作用[15]。王際英等[16]在飼料中添加適量的鱈魚小肽顯著提高了星斑川鰈幼魚的消化酶活性和抗氧化能力,促進(jìn)機(jī)體生長,并在一定程度上提升肌肉品質(zhì)。Liu等[17]發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽可增強(qiáng)中華絨螯蟹抗氧化能力,對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肝胰臟損傷和細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。課題組[18]前期研究發(fā)現(xiàn),日糧添加蝦殼蛋白酶解物能顯著促進(jìn)斑馬魚生長,提升其抗氧化能力及核心生物中相關(guān)基因表達(dá),有益于機(jī)體健康。研究擬利用酶解法制備蝦殼活性肽,測定其體外抗氧化活性,并分析日糧添加蝦殼活性肽對(duì)禁食脅迫下斑馬魚的生長性能、肌肉氨基酸含量、肌纖維組織形態(tài)及抗氧化功能的影響,以期為防治氧化應(yīng)激損傷的相關(guān)疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

克氏原螯蝦殼粉:湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所;

斑馬魚:360尾,初始平均體重為(0.46±0.02) g,長沙學(xué)院水生動(dòng)物營養(yǎng)與品質(zhì)調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;

斑馬魚飼料:安徽新彩虹飼料科技有限公司;

堿性蛋白酶:20萬U/g,北京索萊寶科技有限公司;

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼:98%,北京百靈威有限公司;

十水四硼酸鈉:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

總超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、還原型谷胱甘肽、丙二醛、蛋白質(zhì)羰基等測定試劑盒:南京建成生物工程研究所;

RNA抽提試劑、SYBR Green qPCR Mix:莫納生物科技有限公司;

熒光定量PCR引物:鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蝦殼活性肽制備及體外抗氧化活性分析 采用堿提酸沉法提取克氏原螯蝦殼蛋白(PCSP),并測定其蛋白質(zhì)含量。在pH 9.0,37 ℃條件下,按m蝦殼蛋白∶V水=1∶20 (g/mL)將蝦殼蛋白與水混合,堿性蛋白酶添加量為4 000 U/g,水解3 h。將水解產(chǎn)物置于沸水浴中處理10 min使酶失活,收集上清液,置于-20 ℃預(yù)凍12 h后進(jìn)行真空冷凍干燥,具體參數(shù)為:冷阱溫度-60 ℃,真空度10 Pa左右,干燥48 h,獲得蝦殼活性肽(PCSBP)凍干粉,并評(píng)估其體外抗氧化活性。通過測定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)和羥自由基(·OH)清除能力,分析其體外抗氧化活性,并使用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定蝦殼活性肽序列。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理 選取360尾健康、性成熟且規(guī)格大小相一致的野生型斑馬魚,初始平均體重為(0.46±0.02) g,將其隨機(jī)分為正常組(ND)、禁食組(FA)、禁食后恢復(fù)投喂基礎(chǔ)日糧組(FR-ND)和禁食后恢復(fù)投喂蝦殼活性肽日糧組(FR-PCSBP)4個(gè)組,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)30尾魚。斑馬魚在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中飼養(yǎng),水溫保持在24～26 ℃,采取定時(shí)投喂策略,試驗(yàn)周期為14 d。

1.2.3 斑馬魚生長指標(biāo)及肌肉氨基酸含量測定 試驗(yàn)結(jié)束后,分別對(duì)各組斑馬魚進(jìn)行稱重和測量,計(jì)算存活率、終末體重和終末體長等指標(biāo),分析蝦殼活性肽對(duì)禁食脅迫下斑馬魚生長性能的影響。稱取斑馬魚新鮮肌肉組織50～100 mg,利用氨基酸自動(dòng)分析儀測定氨基酸含量。

1.2.4 肌肉組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)特性 取新鮮肌肉組織用4%多聚甲醛固定液固定24 h后,制作石蠟切片并進(jìn)行蘇木素—伊紅(HE)染色,通過光學(xué)顯微鏡觀察肌肉組織形態(tài)變化。將1 mm3大小組織置于2.5%戊二醛固定液中固定,再用四氧化鋨固定后制作超薄切片,用乙醇脫水,再用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色,透射電鏡觀察肌肉超微結(jié)構(gòu)變化并采集圖像。

1.2.5 抗氧化物質(zhì)及氧化應(yīng)激指標(biāo)測定 稱取100 mg肌肉樣品,按m肌肉∶V生理鹽水=1∶9 (g/mL)比例加入生理鹽水,在冰浴條件下用勻漿儀進(jìn)行組織勻漿,4 ℃、4 000 r/min離心15 min,收集上清液待測。采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定肌肉超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性和谷胱甘肽(GSH)含量,以及氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛(MDA)和蛋白質(zhì)羰基(PC)含量。

1.2.6 抗氧化相關(guān)基因表達(dá)分析 稱取新鮮肌肉樣品50～100 mg,采用Trizol法提取總RNA,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green qPCR Mix試劑在Bio-Rad CFX96TM系統(tǒng)中進(jìn)行抗氧化相關(guān)基因(nrf2、keap1、sod1、sod2、cat、gpx1a、gpx1b、gpx2、gpx3、gsta1、gstm1、gstr、gstz1、gsr)表達(dá)分析,熒光定量PCR引物序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列?

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way-ANOVA)與顯著性檢驗(yàn),所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,Duncan法確定各組間的顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦殼活性肽體外抗氧化活性分析及肽序測定

利用堿性蛋白酶對(duì)蝦殼蛋白進(jìn)行水解后獲得蝦殼活性肽,并對(duì)其進(jìn)行體外抗氧化活性分析(圖1)及肽序測定(圖2)。結(jié)果顯示,酶解后獲得的蝦殼活性肽對(duì)DPPH自由基和羥自由基清除率為(46.35±1.32)%,(75.22±2.18)%,分別是谷胱甘肽的0.53倍和0.77倍,表現(xiàn)出潛在的抗氧化活性;采用LC-MS/MS法測定蝦殼活性肽序列,結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)2 769條匹配肽譜,其中肽序列為1 600條,蛋白質(zhì)組數(shù)量為122個(gè),具有特征肽段的蛋白質(zhì)140個(gè)。已有研究[3]表明,酶解克氏原螯蝦殼制備的生物活性肽含有豐富的氨基酸,并具有較強(qiáng)的還原能力和羥自由基清除能力。唐志紅等[4]利用克氏原螯蝦副產(chǎn)物分離蛋白為原料,以胰酶酶解制備肽混合物,并通過體外抗氧化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖2 肽譜匹配分?jǐn)?shù)分布及肽譜匹配的前體質(zhì)量誤差

2.2 蝦殼活性肽對(duì)斑馬魚生長性能的影響

通過測定蝦殼活性肽對(duì)禁食脅迫下斑馬魚生長性能的影響(表2)可知,各組之間斑馬魚存活率無顯著差異(P>0.05),禁食組中斑馬魚終末體重和終末體長均明顯下降(P<0.05);當(dāng)恢復(fù)正常飲食后斑馬魚生長性能有所改善,但低于正常組水平,而恢復(fù)含蝦殼活性肽飲食后斑馬魚生長性能逐漸恢復(fù)到正常組水平,說明日糧添加蝦殼活性肽能有效改善禁食脅迫下斑馬魚的生長性能。

2.3 蝦殼活性肽對(duì)斑馬魚肌肉氨基酸含量的影響

通過測定蝦殼活性肽對(duì)禁食脅迫下斑馬魚肌肉氨基酸含量的影響(表3)可知,與正常組相比,禁食組中斑馬魚肌肉氨基酸總量明顯下降,必需氨基酸和呈味氨基酸含量也呈下降趨勢,當(dāng)恢復(fù)正常飲食后肌肉氨基酸總量、必需氨基酸和呈味氨基酸含量均有所升高,但未達(dá)到正常組水平,而恢復(fù)含蝦殼活性肽飲食后斑馬魚肌肉氨基酸總量、必需氨基酸和呈味氨基酸含量均恢復(fù)到正常組水平,說明日糧添加蝦殼活性肽有助于氨基酸合成。

表3 蝦殼活性肽對(duì)禁食脅迫下斑馬魚肌肉氨基酸含量的影響

2.4 蝦殼活性肽對(duì)斑馬魚肌肉組織結(jié)構(gòu)的影響

通過觀察蝦殼活性肽對(duì)禁食脅迫下斑馬魚肌肉組織結(jié)構(gòu)的變化(圖3)可知,與正常組相比,禁食后可見斑馬魚肌細(xì)胞間隙增寬,肌纖維出現(xiàn)部分?jǐn)嗔熏F(xiàn)象,胞質(zhì)輕微水腫,有空泡形成,當(dāng)恢復(fù)正常飲食后肌纖維排列相對(duì)規(guī)則,細(xì)胞間隙減少,肌肉組織結(jié)構(gòu)有所恢復(fù),但肌纖維仍有少量斷裂現(xiàn)象,而在恢復(fù)含蝦殼活性肽飲食后肌肉組織排列整齊緊密,肌纖維未見明顯斷裂,Z線連續(xù),H帶結(jié)構(gòu)清晰,水腫程度降低,肌肉組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)到正常組水平。研究[19]發(fā)現(xiàn),正常斑馬魚胚胎在受精后24～120 h時(shí),肌原纖維超微結(jié)構(gòu)正常,排列整齊,Z線、M線清晰可見,而隨著檳榔堿處理后,斑馬魚肌纖維排列和超微結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生了顯著變化,并出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)空泡、線粒體腫脹等現(xiàn)象。此外,正常斑馬魚心肌纖維細(xì)胞間絲連接緊密,Z線、H帶和明暗帶也能清晰區(qū)分,當(dāng)經(jīng)過三氯生暴露后,肌細(xì)胞核膜輕微起皺,肌絲間隙有一定水腫跡象,肌絲斷裂,H帶和明暗帶難以區(qū)分[20]。這與禁食后斑馬魚呈現(xiàn)出的肌肉組織及超微結(jié)構(gòu)變化均有相似之處,說明當(dāng)機(jī)體遭受應(yīng)激后會(huì)造成肌肉組織損傷。

2.5 蝦殼活性肽對(duì)斑馬魚肌肉抗氧化功能的影響

通過對(duì)斑馬魚肌肉抗氧化酶活性(圖4)和氧化應(yīng)激損傷(圖5)指標(biāo)的測定與分析可知,禁食組中肌肉抗氧化酶SOD、GSH-PX活性和GSH含量均有不同程度降低,氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)MDA、PC含量顯著增加(P<0.05)。與禁食組相比,恢復(fù)正常飲食組中SOD、GSH-PX酶活性及GSH含量得到顯著提高,并降低了MDA含量(P<0.05),而在恢復(fù)含蝦殼活性肽飲食組中,抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX活性和GSH含量均顯著提升,且恢復(fù)到正常飲食水平,同時(shí)還顯著降低了MDA、PC含量(P<0.05),有效地改善了斑馬魚肌肉氧化應(yīng)激損傷。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

禁食脅迫誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)生成過量自由基,使組織受到氧化損傷[21]。GSH-Px是機(jī)體中清除脂質(zhì)過氧化物和過氧化氫的重要抗氧化物[22-23],受禁食脅迫后其活性顯著下降,其根本原因是由于禁食使機(jī)體不能夠合成充足的氨基酸,導(dǎo)致GSH合成受阻,而GSH作為GSH-Px發(fā)揮作用的輔助底物,GSH含量下降,GSH-Px的活性必定下降[24]。細(xì)胞中多不飽和脂肪酸過氧化會(huì)產(chǎn)生MDA,而MDA含量是評(píng)價(jià)脂質(zhì)氧化性損傷的重要指標(biāo)[25]。吳曉雲(yún)等[26]研究發(fā)現(xiàn),禁食7 d長江鱘肌肉組織中的MDA含量上升和GSH-Px活力下降,與試驗(yàn)過程中禁食脅迫下斑馬魚肌肉組織發(fā)生的變化一致,說明禁食使斑馬魚肌肉抗氧化能力下降。在斑馬魚攝食后,機(jī)體合成氨基酸的底物得到補(bǔ)充,氨基酸開始合成,GSH得到補(bǔ)充,隨之GSH-Px活力也上升。

2.6 蝦殼活性肽對(duì)斑馬魚肌肉抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

通過對(duì)斑馬魚肌肉抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的測定與分析(圖6),結(jié)果顯示,禁食組中斑馬魚肌肉抗氧化酶基因sod1、sod2、cat、gpx1a、gpx2、gstm1、gstr、gstz1、gsr轉(zhuǎn)錄水平較正常組顯著降低(P<0.05),當(dāng)恢復(fù)正常飲食后,sod1、sod2、cat、gpx1a、gpx2、gstm1、gstz1、gsr表達(dá)明顯升高,而在恢復(fù)含蝦殼活性肽飲食后,發(fā)現(xiàn)抗氧化信號(hào)分子nrf2轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào),keap1明顯上調(diào),其下游抗氧化酶基因sod1、sod2、cat、gpx1a、gpx2、gpx3、gstm1、gstr、gstz1、gsr表達(dá)顯著升高且部分基因表達(dá)量達(dá)到最高值(P<0.05),說明增加了斑馬魚肌肉組織抗氧化防御能力,以改善禁食誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

圖6 蝦殼活性肽對(duì)斑馬魚肌肉抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,keap1)-核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-erythroid 2-related factor-2,nrf2)是維持過氧化物和抗氧化平衡的重要信號(hào)通路。已有研究[27]證明,nrf2是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,通過與其下游抗氧化酶基因啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合,促進(jìn)抗氧化酶基因(sod、cat、gpx、gst等)轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Deng等[28]研究報(bào)道,上調(diào)nrf2表達(dá)可提高肌肉中sod、cat、gpx和gst基因的表達(dá)。研究在飲食中添加蝦殼活性肽后,斑馬魚肌肉nrf2表達(dá)顯著上調(diào),keap1下調(diào)并恢復(fù)至正常飲食水平,其下游抗氧化酶活性及基因表達(dá)得到顯著提高,并顯著降低了MDA、PC含量,有效減輕了肌肉氧化應(yīng)激水平,恰好佐證了上述結(jié)論。

3 結(jié)論

研究利用酶解法制備得到了蝦殼活性肽,在體外表現(xiàn)出潛在的抗氧化活性,而在日糧中添加蝦殼活性肽可顯著提高禁食脅迫下斑馬魚肌肉超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性和谷胱甘肽(GSH)含量,并降低丙二醛(MDA)和蛋白質(zhì)羰基(PC)的生成量。此外,還顯著增加抗氧化酶基因表達(dá),并且上調(diào)抗氧化信號(hào)分子nrf2以及下調(diào)keap1表達(dá)水平,進(jìn)而增強(qiáng)斑馬魚抗氧化功能,緩解機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。研究證明蝦殼活性肽對(duì)氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用,但對(duì)于蝦殼活性肽的分離提純以及在機(jī)體中的分子機(jī)制尚不清楚,有待進(jìn)一步深入研究。