張 川,于 濤,于小焱,朱 勇,王麗芳,張曉慧

(1.國家海洋標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量中心,天津 300112; 2.海洋計(jì)量檢測技術(shù)創(chuàng)新中心,天津 300112; 3.自然資源部第二海洋研究所,浙江 杭州 310012; 4.自然資源部海洋生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310012; 5.廈門大學(xué) 近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361102)

0 引言

磷是構(gòu)成生命體的基本元素,在海洋中磷元素是海洋初級生產(chǎn)力的主要影響因素[1],同時(shí)磷也是海水富營養(yǎng)化的主要因素之一[2]。磷含量不足會限制生物生長,反之則可導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化、生物繁殖過剩,進(jìn)而造成生態(tài)災(zāi)害[3]。水體中磷以多種形態(tài)存在[4],包括溶解態(tài)無機(jī)磷/有機(jī)磷和顆粒態(tài)無機(jī)磷/有機(jī)磷。依據(jù)測定方法和操作步驟還可將其劃分為活性磷、可酸解磷、總磷等類別。其中,經(jīng)過濾后的樣品,未經(jīng)水解或消解,能通過磷鉬藍(lán)(Phospho Molybdenum Blue,PMB)分光光度法測得的稱為活性磷[4-6]。在海洋科學(xué)研究及日常監(jiān)測、調(diào)查工作中,磷酸鹽的測定非常重要,建有標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)范[7-8]。測定方法可分為濕化學(xué)法、紫外光譜法及離子選擇性電極法[9]。為了保證測量結(jié)果的準(zhǔn)確可靠,在測定過程中均需要使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)開展質(zhì)量控制[10-11]。

國內(nèi)研制生產(chǎn)磷酸鹽等營養(yǎng)鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的單位主要有自然資源部第二海洋研究所、國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心、中國計(jì)量科學(xué)研究院等。上述單位研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基質(zhì)均為氯化鈉溶液或純水[12],將其用于測量海水樣品會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。加拿大國家研究委員會和日本國家計(jì)量院研制的MOOS-1、MOOS-3、NMIJ7601-a、NMIJ7602-a、NMIJ7603-a等有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Certified Reference Material,CRM)以及韓國海洋科學(xué)技術(shù)研究所和荷蘭皇家海洋研究所研制的曾用于國際間交流比對活動(dòng)的相關(guān)樣品,均采用大洋海水作為基質(zhì)[13]。

本研究采用西太平洋表層海水為基質(zhì),通過對海水進(jìn)行前處理和定量配制來制備海水基質(zhì)磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),并對定值方法進(jìn)行了優(yōu)化,評估了制備樣品的均勻性及穩(wěn)定性,采用多實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值的方式確定了不同濃度的4個(gè)批次樣品的標(biāo)準(zhǔn)值,并對其不確定度進(jìn)行了分析。該研究填補(bǔ)了國內(nèi)活性磷酸鹽海水基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備領(lǐng)域的空白。

1 材料

1.1 基質(zhì)材料準(zhǔn)備

海水采集自西太平洋(24°42′N,126°03′E),該區(qū)域?yàn)楣褷I養(yǎng)鹽海域[14],表層海水活性磷酸鹽濃度一般約為幾十納摩爾每升。采集時(shí)間為2017年7月,采水位置遠(yuǎn)離大陸或其他潛在污染源,水深大于1 500 m。采用水泵直接抽取表層(5 m左右)海水分裝于25 L食品級聚乙烯塑料桶內(nèi)保存,同時(shí)通過現(xiàn)場溫鹽深測量儀(conductivity-temperrature-depth measuring instrument,CTD)測量海水水溫為28.5 ℃,鹽度為33.6。采集的大洋海水運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,儲存在陰涼避光處,陳化1 a以上備用。陳化后的海水中易降解的有機(jī)物降解完全,而活性磷酸鹽的濃度基本保持穩(wěn)定。采用固相萃取富集與分光光度法聯(lián)用技術(shù)測定采集海水的活性磷酸鹽本底值為31.6 nmol/L,大約為本研究中試制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度(最小為500 nmol/L)的1/17,該本底值對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后續(xù)定值可能產(chǎn)生的影響很小,基本可忽略。

1.2 儀器與試劑

本研究使用荷蘭斯卡拉(Skala)San++型營養(yǎng)鹽自動(dòng)分析儀作為測定活性磷酸鹽的分析儀器。該儀器使用氣泡間隔連續(xù)流動(dòng)分析系統(tǒng)搭配紫外分光光度檢測器進(jìn)行磷酸鹽濃度的測定。該檢測器具備雙光束背景扣除功能。測定實(shí)驗(yàn)中所用比色皿光程為5 cm。

實(shí)驗(yàn)室所用超純水為自來水經(jīng)過美國密理博(Millipore)Milli-Q型超純水系統(tǒng)凈化而成,其電阻率為18.2 MΩ·cm。抗壞血酸(VC)、四水合鉬酸銨[(NH4)6Mo7O24·4H2O]、酒石酸銻鉀[K(SbO)C4H4O6·H2O]均采購自Sigma-Aldrich公司,純度為“優(yōu)級純”。磷酸二氫銨中磷、氮成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW06502)采購自中國計(jì)量科學(xué)研究院。濃硫酸(97%)采購自天津化學(xué)試劑有限公司,純度為“優(yōu)級純”。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

實(shí)驗(yàn)采用0.45 μm混合纖維素微孔濾膜對天然大洋海水進(jìn)行過濾,濾除海水中的懸浮物、不溶性顆粒。采用高溫滅菌設(shè)備對過濾后的海水在124 ℃下滅菌2 h,采用容器及包裝瓶分裝,并在同樣條件下滅菌 30 min。此過程可滅活天然海水中的各類活體以及容器內(nèi)可能存在的細(xì)菌等微生物,以避免儲存期間其生命活動(dòng)導(dǎo)致水中活性磷酸鹽濃度發(fā)生變化。將處理后的天然海水作為溶液基質(zhì),定量加入磷酸二氫銨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(10 mmol/L)溶解混勻,調(diào)制后磷酸鹽濃度大約為0.5、1.0、2.0和4.0 μmol/L,分裝(批次代號分別為P1、P2、P3、P4)后進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性檢驗(yàn),并用于定值研究。

2.2 活性磷酸鹽濃度測定方法

PMB分光光度法是一種測定水體中活性磷酸鹽較成熟的方法:在酸性介質(zhì)中,活性磷酸鹽在酒石酸銻鉀的催化下與鉬酸銨反應(yīng)生成磷鉬雜多酸,該絡(luò)合物被抗壞血酸還原為PMB絡(luò)合物,在710 nm或882 nm波長處可進(jìn)行分光光度測定[15]。該方法不僅可測定微摩爾級別的樣品,結(jié)合氫氧化鎂共沉淀法[14,16]、流動(dòng)分析-固相萃取法[17-19]等技術(shù),檢出限可達(dá)納摩爾級別,是海水中痕量磷元素分析的有力手段。此外,由于海水高鹽及共存離子復(fù)雜等特性會造成靈敏度或儀器操作受限,諸如化學(xué)發(fā)光法、色譜法、質(zhì)譜法等方法多用于測定淡水水體磷酸鹽含量。

2.3 樣品均勻性檢驗(yàn)方法

均勻性用于描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值的空間分布特征。根據(jù)《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值及均勻性、穩(wěn)定性評估》(JJF 1343—2022)[20]的要求,在分裝過程中采用分層隨機(jī)抽樣的方法抽取11瓶樣品用于檢驗(yàn),每瓶樣品平行測定 3次。采用單因素方差分析(F檢驗(yàn))進(jìn)行統(tǒng)計(jì),若統(tǒng)計(jì)量F值小于臨界值,則認(rèn)為樣品均勻。

2.4 樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)方法

穩(wěn)定性用于描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值隨時(shí)間的變化,即樣品特性的時(shí)間分布特征。研制過程中通過穩(wěn)定性檢驗(yàn)可分析評估穩(wěn)定性相關(guān)的不確定度分量,同時(shí)以此確定合適的保存和運(yùn)輸條件以及有效期。檢驗(yàn)主要分為長期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性,前者考察標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在一般保存條件下1年以上的穩(wěn)定性,后者考察運(yùn)輸?shù)韧獠恳蛩匾鸬亩唐诜€(wěn)定性變化。長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)中,在樣品制備后第0、0.5、1、2、4、6、15個(gè)月,每次隨機(jī)抽取1組樣品(共7組)進(jìn)行測定。短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)中,分別以不同環(huán)境條件保存樣品(環(huán)境溫度為-20、4、25、65 ℃),在樣品保存0、1、4、7天后,每次隨機(jī)抽取1組樣品進(jìn)行測定。

按照J(rèn)JF 1343—2022[20]的要求采用趨勢分析法進(jìn)行穩(wěn)定性評估。作時(shí)間-測量值數(shù)據(jù)圖,并進(jìn)行線性擬合。計(jì)算直線斜率β1的標(biāo)準(zhǔn)偏差s(β1),并作t檢驗(yàn)。若滿足式(1)要求,則表明監(jiān)測數(shù)據(jù)隨時(shí)間沒有顯著性的趨勢變化,樣品穩(wěn)定性良好:

|β1|

(1)

式中:t95,n-2為雙邊檢驗(yàn)置信概率95%下t分布臨界值。判定長期穩(wěn)定性時(shí)(n=7),t95,n-2查表為2.571;判定短期穩(wěn)定性時(shí)(n=4),t95,n-2查表為4.303。

2.5 定值誤差統(tǒng)計(jì)分析

采用多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合測試的方式進(jìn)行定值,參與定值的實(shí)驗(yàn)室均具有海水磷酸鹽檢測計(jì)量認(rèn)證資質(zhì)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)室來自專業(yè)檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)、海洋儀器設(shè)備研發(fā)機(jī)構(gòu)、科研院所、海洋水質(zhì)監(jiān)測業(yè)務(wù)部門等多個(gè)領(lǐng)域的多家單位。向上述單位發(fā)送隨機(jī)抽取的樣品及測試說明,由各實(shí)驗(yàn)室自行獨(dú)立測定后按照統(tǒng)一的數(shù)據(jù)格式反饋結(jié)果及質(zhì)控信息。

對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總,通過以下統(tǒng)計(jì)分析手段剔除異常值和離群值,并進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù),同組取平均值作為定值結(jié)果。

1)格拉布斯檢驗(yàn)

2)科克倫檢驗(yàn)

接公式(2)計(jì)算各組數(shù)據(jù)的C值,查表獲得臨界值C(α,m,n),其中α為顯著性水平,取0.05或0.01;m為數(shù)據(jù)組數(shù);n為重復(fù)測量次數(shù)。若C≤C(0.05,m,n),表明各組數(shù)據(jù)平均值為等精度;若C(0.05,m,n)≤C≤C(0.01,m,n),仍按等精度處理;若C>C(0.01,m,n),則為不等精度。

(2)

3)狄克遜檢驗(yàn)

將測定數(shù)據(jù)按由小到大的順序排列,第n個(gè)數(shù)據(jù)記為X(n),按照式(3)和式(4)計(jì)算r1和rn值。

(3)

(4)

查表獲得臨界值f(α,n),其中α為顯著性水平,n為數(shù)據(jù)序列數(shù)。若r1>rn,且r1>f(α,n),則判定X(1)為異常值;若rn>r1,且rn>f(α,n),則判定X(n)為異常值;若r1和rn值均小于f(α,n)值,則所有數(shù)據(jù)保留。

4)夏皮洛-威爾克正態(tài)分布檢驗(yàn)

將數(shù)據(jù)按由小到大的順序排列,計(jì)算統(tǒng)計(jì)量W:

(5)

當(dāng)W>W(n,p)時(shí),則接受測定數(shù)據(jù)為正態(tài)分布。其中W(n,p)是與測量次數(shù)n和置信概率p有關(guān)的數(shù)值,可查表得到。

2.6 不確定度評定方法

本樣品特性值的不確定度由均勻性、穩(wěn)定性及定值過程三部分引入。通過分析不確定度來源,建立數(shù)學(xué)模型,對各類來源分別進(jìn)行分析計(jì)算,按照公式(6)計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以擴(kuò)展因子k可以得到擴(kuò)展不確定度(k=2),擴(kuò)展不確定度除以測量值可以得到相對擴(kuò)展不確定度。

(6)

式中:uCRM為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度,ubb為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性引入的不確定度,ults為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性引入的不確定度,uchar為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程引入的不確定度。

2.6.1 均勻性引入的不確定度

對同一批次樣品進(jìn)行均勻性檢驗(yàn),通過下列公式計(jì)算不確定度分量:

(7)

2.6.2 穩(wěn)定性引入的不確定度

統(tǒng)計(jì)穩(wěn)定性數(shù)據(jù),采用線性回歸假設(shè),通過下列公式計(jì)算不確定度分量:

ults=X×ub

(8)

式中:X為樣品保存時(shí)間;ub為時(shí)間(X)與測定磷酸鹽濃度值(Y)線性擬合后,曲線斜率的標(biāo)準(zhǔn)偏差(標(biāo)準(zhǔn)不確定度)。

2.6.3 定值過程引入的不確定度

對多家實(shí)驗(yàn)室的測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算由多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值引入的不確定度分量,計(jì)算方式為

(9)

(10)

(11)

3 定值方法優(yōu)化研究

3.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

在PMB生成的反應(yīng)中,溫度影響反應(yīng)熱力學(xué)[22-23],進(jìn)而導(dǎo)致反應(yīng)效率變化。首先采用分析儀廠商推薦的試劑條件及儀器設(shè)定,考察不同反應(yīng)溫度下的測定效果。設(shè)置分析儀反應(yīng)池恒溫溫度在20～60 ℃范圍內(nèi)依次變化,分別記錄同一組樣品的測定結(jié)果。結(jié)果顯示在此溫度范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)顯著的測量結(jié)果差異。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)保證在室溫下進(jìn)行測定,測定過程中儀器自帶反應(yīng)池恒溫器統(tǒng)一設(shè)定為30 ℃。

3.2 試劑質(zhì)量濃度的優(yōu)化

圖1 抗壞血酸質(zhì)量濃度條件優(yōu)化結(jié)果

圖2 鉬酸銨質(zhì)量濃度條件優(yōu)化結(jié)果

圖3 酒石酸銻鉀質(zhì)量濃度條件優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化后的測試條件:反應(yīng)溫度為30 ℃,抗壞血酸質(zhì)量濃度為4 g/L,混合酸中鉬酸銨質(zhì)量濃度為4 g/L,硫酸溶液體積分?jǐn)?shù)為4%,酒石酸銻鉀質(zhì)量濃度為100 mg/L。

3.3 定值方法性能評價(jià)

配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白溶液,測定后作標(biāo)準(zhǔn)曲線,校準(zhǔn)范圍為(0～5) μmol/L,線性相關(guān)度R2為0.999 9。平行測定11次空白樣品并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(s),方法的檢出限VMDL按照公式VMDL=s·t(10,0.99)計(jì)算,其中t(10,0.99)=3.17,檢出限結(jié)果為0.03 μmol/L。

采用日本國家計(jì)量院制造的編號為NMIJ7603-a、NMIJ7602-a的高濃度和中濃度天然海水活性磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為驗(yàn)證樣品,對定值方法的可靠性和準(zhǔn)確度進(jìn)行驗(yàn)證(見表1),結(jié)果顯示該定值方法誤差在0.05 μmol/L以內(nèi),可靠性良好。

表1 定值方法準(zhǔn)確度和可靠性驗(yàn)證結(jié)果

采用優(yōu)化后的定值方法對本研究制備的4種濃度的海水活性磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行9次重復(fù)性測定,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)值見表2。從數(shù)據(jù)可見,隨著樣品濃度值的減小,RSD基本呈增大趨勢,這與大多數(shù)痕量分析結(jié)果類似,即目標(biāo)物濃度越接近方法檢出限,測量結(jié)果精密度越差。

表2 定值方法精密度驗(yàn)證結(jié)果

4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢驗(yàn)定值結(jié)果

4.1 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

單因素方差分析結(jié)果(表3)顯示,4種濃度活性磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)的F值均小于臨界值(2.30),說明4種海水活性磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性良好,符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的要求。

表3 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

4.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)中對抽取的樣品在15個(gè)月內(nèi)先后測量7次,4種濃度活性磷酸鹽樣品在不同時(shí)間測定的結(jié)果及統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表4和圖4。經(jīng)分析,全部樣品的穩(wěn)定性均滿足公式(1)要求,即隨時(shí)間推移,特性值沒有顯著變化趨勢,可認(rèn)為是穩(wěn)定的。

表4 長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

圖4 長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

短期穩(wěn)定性是為了考察樣品在運(yùn)輸、野外條件下可能受到的影響。將樣品保存在4個(gè)環(huán)境溫度中分別進(jìn)行7天內(nèi)穩(wěn)定性評價(jià)(見圖5和表5)。經(jīng)分析,在包含高溫、低溫、常溫的全部環(huán)境條件下,所有樣品穩(wěn)定性均滿足公式(1)要求,即隨時(shí)間推移,特性值沒有顯著變化趨勢,可認(rèn)為是穩(wěn)定的。

表5 短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

圖5 短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

4.3 定值結(jié)果及不確定度

本研究中共6家實(shí)驗(yàn)室參與了聯(lián)合定值,均采用PMB分光光度法測定。其中兩家實(shí)驗(yàn)室采用流動(dòng)分析技術(shù),通過在線反應(yīng)方式完成分析,其余4家實(shí)驗(yàn)室參照GB/T 12763.4—2007[7],采用手工離線方式完成顯色及測定。各實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),均符合要求并被采納(表6和表7)。

表6 原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果

表7 聯(lián)合定值測量結(jié)果

統(tǒng)計(jì)分析后得到所研制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)值及各個(gè)不確定度分量,對各分量進(jìn)行合成后計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)不確定度,取包含因子k=2,得到相對擴(kuò)展不確定度分別為10%、5%、3%和2%(表8)。

表8 不確定度分析結(jié)果

5 結(jié)論與展望

本研究以西太平洋表層海水為基質(zhì),制備了0.5～4.0 μmol/L系列濃度的海水活性磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。通過定值方法研究、驗(yàn)證、應(yīng)用及均勻性、穩(wěn)定性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)等,對該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相關(guān)性能進(jìn)行了評價(jià),結(jié)論如下。

1)通過對PMB分光光度法進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證,確認(rèn)該方法檢出限為0.03 μmol/L,可滿足本研究中所制備的低濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值測量需求。

2)通過均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性檢驗(yàn),確認(rèn)所制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均符合批次內(nèi)均勻性要求,且長期穩(wěn)定性可達(dá)15個(gè)月,在高溫、低溫、常溫不同貯存環(huán)境下7天可保持特性值無顯著性變化。

3)經(jīng)不確定度分析,4個(gè)批次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最終定值的相對擴(kuò)展不確定度為2%～10%。

本研究成果可直接用于海洋樣品分析中的質(zhì)控環(huán)節(jié),或用于校準(zhǔn)海洋專用磷酸鹽分析儀器等方面,由于與分析目標(biāo)物基質(zhì)一致,可有效減小基質(zhì)差異引起的測量誤差。鑒于目前樣品覆蓋濃度范圍較小,且不確定度指標(biāo)與已有產(chǎn)品仍有差距,后續(xù)研究將繼續(xù)完善制備技術(shù)和定值技術(shù),針對不同海域特點(diǎn)研制更寬濃度范圍的樣品,以滿足我國海洋生態(tài)保護(hù)修復(fù)及環(huán)境監(jiān)測等多方面的需求。