王寶群，甄政安，林莎莎，陳醒，鄒圣燦，李亞利

（青島琛藍(lán)海洋生物工程有限公司，山東青島 266100）

透明質(zhì)酸（HA）是由D-葡糖醛酸和N-乙醛基-D-氨基葡糖雙糖單位重復(fù)連接組成的一種鏈性聚陰離子黏多糖[1-3]，是構(gòu)成皮膚、玻璃體、關(guān)節(jié)滑液和軟組織的成分，具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能[4]。天然的透明質(zhì)酸易被體內(nèi)的透明質(zhì)酸酶迅速降解，在體內(nèi)保持時(shí)間短，限制了其在臨床上的應(yīng)用[5-8]。為了解決這個(gè)問(wèn)題，通常使用交聯(lián)劑對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾，穩(wěn)固透明質(zhì)酸在體內(nèi)的維持時(shí)間[9-13]。目前常使用的交聯(lián)劑有二乙烯基砜（DVS）[14]和1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE）[15]。

修飾度是指交聯(lián)劑修飾透明質(zhì)酸凝膠的程度，是凝膠的重要性能指標(biāo)之一。修飾度又分為懸掛修飾度和交聯(lián)修飾度（懸掛修飾指BDDE 分子只有一端與HA 分子連接，另一端游離；交聯(lián)修飾指BDDE分子兩端同時(shí)與HA 分子連接，也叫有效交聯(lián)）[16]。修飾度與凝膠的降解能力、吸漲程度緊密相關(guān)[17-19]。利用測(cè)量修飾度可以反應(yīng)凝膠的物理化學(xué)性能，并直接影響凝膠體內(nèi)降解性能，從而影響產(chǎn)品的生物安全性；當(dāng)交聯(lián)度偏小時(shí)，會(huì)影響凝膠的穩(wěn)定性和抗降解性；當(dāng)交聯(lián)度偏大時(shí)，會(huì)引起人體的排斥反應(yīng)，從而增加凝膠植入的風(fēng)險(xiǎn)[14]。楊彪[20]等使用酶解法將凝膠降解為雙糖，采用分子排阻色譜法對(duì)產(chǎn)物分離，然后使用H-NMR和質(zhì)譜儀分析，利用面積歸一法計(jì)算凝膠的修飾度，但該方法操作繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)。

筆者以丙三醇為外標(biāo)，利用氣相色譜法檢測(cè)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠經(jīng)酸解后得到的樣品中丙三醇濃度，再計(jì)算出凝膠的修飾度，該方法不僅簡(jiǎn)便、快速，而且具有較高的精密度和準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

精密電子天平：PX224ZH/E 型，感量為0.1 mg，奧豪斯儀器（常州）有限公司。

氣相色譜儀：島津-GC2014C型，配有氫火焰離子化（FID）檢測(cè)器，日本島津公司。

恒溫?cái)嚢杵鳎篐J-6B 型，金壇市城東新瑞儀器廠(chǎng)。

超聲波清洗器：KQ-600DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

pH計(jì)：PHS-3E型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

離心機(jī)：GL-20G-II型，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)。

丙三醇標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于99.7%，上海麥克林試劑有限公司。

無(wú)水乙醇：高效液相色譜級(jí)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

氫氧化鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

氫溴酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

高純氮?dú)猓嘿|(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.999%。

交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品：20220606 批，自制樣品。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：PEG-20M毛細(xì)管柱（30.0 m×0.32 mm，0.50 μm）；檢測(cè)器溫度：290 ℃；載氣：高純氮?dú)?，流量?0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比為20∶1；色譜柱流量：2.00 mL/min，吹掃氣：高純氮?dú)?，流量?.0 mL/min；柱溫：程序升溫，初始溫度為60 ℃，再以5 ℃/min 速率升溫至230 ℃，保持10 min。

1.3 溶液配制

丙三醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg/mL，精確稱(chēng)取10 mg丙三醇標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中，加入無(wú)水乙醇定容。

丙三醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別取丙三醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25、0.50、0.75、1.25、2.50 mL，各加入到1只25 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜。所得系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL。

樣品溶液：精確稱(chēng)取1 g 透明質(zhì)酸凝膠樣品于10 mL具塞玻璃管中，加入氫溴酸5 mL，混合均勻，于沸水中煮50 min，將溶液轉(zhuǎn)移至燒杯中，用6 mol氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液至中性（pH 7.0～7.2）。將燒杯置于數(shù)顯多頭磁力恒溫?cái)嚢杵魃?，?5 ℃以轉(zhuǎn)速400～500 r/min 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，至燒杯中無(wú)液體，靜置放涼；加入5 mL 無(wú)水乙醇，于超聲器中超聲30 min 后轉(zhuǎn)移至離心管中離心20 min，用注射器吸取上清液，過(guò)0.22 μm濾膜。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

使用氣相色譜儀按照1.2 色譜條件檢測(cè)丙三醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，建立丙三醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；同法檢測(cè)樣品溶液，利用色譜峰面積外標(biāo)法計(jì)算出樣品中丙三醇的質(zhì)量濃度，將所得丙三醇濃度帶入式(1)計(jì)算凝膠樣品的修飾度Dm：

式中：V——無(wú)水乙醇總體積，mL;

ρ——樣品溶液中丙三醇的質(zhì)量濃度，mg/L；

ρHA——樣品溶液中透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量濃度，mg/mL；

mHA——樣品溶液中透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1.1 酸解溫度和酸解時(shí)間的選擇

制備樣品時(shí)，需通過(guò)酸解透明質(zhì)酸凝膠樣品得到丙三醇，而不同酸解溫度會(huì)影響樣品的酸解程度和速度，最終影響丙三醇的含量測(cè)定結(jié)果。分別采用常溫酸解和沸水酸解兩種方式處理樣品，對(duì)比丙三醇色譜峰面積測(cè)定值，并確定最終酸解條件。經(jīng)試驗(yàn)比較，稱(chēng)取同一批次且質(zhì)量相同的凝膠樣品進(jìn)行酸解，分別在沸水酸解、常溫消解條件下，酸解40、50、60 min，經(jīng)測(cè)試后對(duì)比丙三醇色譜峰面積，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，沸水酸解樣品丙三醇色譜峰面積遠(yuǎn)大于常溫酸解丙三醇色譜峰面積，且沸水酸解時(shí)間到達(dá)50 min后，丙三醇色譜峰面積再無(wú)明顯增加，說(shuō)明沸水酸解條件下，凝膠能更快降解。綜合考慮，最終選擇沸水酸解，酸解時(shí)間為50 min。酸解方式的確定使得樣品降解的更徹底，且大幅縮短制樣的周期。

圖1 不同酸解溫度和酸解時(shí)間的丙三醇色譜峰面積

2.1.2 載氣流量的選擇

載氣流量是氣相檢測(cè)中的重要參數(shù)，直接影響氣相色譜峰的分離度、色譜柱理論塔板高度、柱效等指標(biāo)。一般情況下，選擇的載氣流量范圍在10～100 mL/min。當(dāng)載氣流量設(shè)置過(guò)低時(shí)，樣品的擴(kuò)散能力減弱，增加色譜柱的使用，從而影響色譜柱的柱效；當(dāng)載氣流量設(shè)置過(guò)高時(shí)，會(huì)影響樣品在色譜柱內(nèi)的保留，并且會(huì)影響色譜柱的柱效，間接影響檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際色譜柱柱效表明，選擇30 mL/min的載氣流量為最適流量。

2.1.3 色譜柱升溫速率的選擇

采用程序升溫方法進(jìn)行丙三醇含量的測(cè)定，其中升溫速率的快慢會(huì)對(duì)色譜峰有明顯的影響。升溫速率高會(huì)降低色譜峰的分離度，升溫速率低又會(huì)增加檢測(cè)時(shí)間，因此需要確定最佳升溫速率。分別設(shè)置升溫速率為5、25 ℃/min進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同升溫速率的凝膠樣品的氣相圖譜

由圖2可知，在其它試驗(yàn)條件相同的情況下，當(dāng)升溫速率為5 ℃/min 時(shí)，丙三醇峰的分離度為2.998；當(dāng)升溫速率為25 ℃/min 時(shí)，丙三醇的分離度為0.109。分離度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致被測(cè)物質(zhì)中各組分分離不完全，因此選擇升溫速率為5 ℃/min。

2.2 方法專(zhuān)屬性

精密量取丙三醇標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、樣品溶液、丙三醇加標(biāo)凝膠樣品溶液各1 mL，按照1.4步驟檢測(cè)，色譜圖見(jiàn)圖3。由圖3可知，三種溶液的保留時(shí)間均在同一位置，在目標(biāo)峰出現(xiàn)的位置確屬于待檢測(cè)的丙三醇峰，證明該方法的專(zhuān)屬性很高，檢測(cè)過(guò)程中不會(huì)出現(xiàn)雜峰的干擾。

圖3 丙三醇標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、消解前后的凝膠溶液色譜圖

2.3 方法精密度

配制6 份凝膠樣品溶液，按1.4 方法進(jìn)行檢測(cè)，考察凝膠樣品丙三醇含量和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗(yàn)結(jié)果列于表1。由表1 可知，樣品中丙三醇含量測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.13%，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02%，表明該方法的重現(xiàn)性很好，具有很高的精密度，能夠滿(mǎn)足定量分析的要求。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性測(cè)定

取1份凝膠樣品溶液，每隔3 h，按照1.4方法檢測(cè)1 次樣品，測(cè)定結(jié)果列于表2。由表2 可知，計(jì)算得丙三醇峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.77%，表明在15 h內(nèi)，樣品中丙三醇含量是穩(wěn)定的。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 線(xiàn)性關(guān)系和方法檢出限

按1.4 方法檢測(cè)丙三醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液計(jì)算線(xiàn)性方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，丙三醇質(zhì)量濃度在8.16～122 μg/mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性方程為y=3 266.9x-8 404.7，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。

以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的丙三醇質(zhì)量濃度確定檢出限為0.037 μg/mL，以10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的丙三醇質(zhì)量濃度確定定量限為0.83 μg/mL。

2.6 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

稱(chēng)取已知組分含量的透明質(zhì)酸凝膠樣品溶液，用標(biāo)準(zhǔn)加入法分別測(cè)定40.13、36.48、32.83 μg/mL 3個(gè)添標(biāo)水平下丙三醇的回收率，每組樣品6份，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 數(shù)據(jù)可知，丙三醇平均回收率為99.17～99.94%，表明該方法的準(zhǔn)確度很高，滿(mǎn)足樣品的分析要求。

表3 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)優(yōu)化樣品處理和檢測(cè)條件，建立了測(cè)定交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠修飾度的氣相色譜法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，所建立的方法具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，證明該方法可高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)透明質(zhì)酸凝膠樣品中的丙三醇含量，再通過(guò)計(jì)算即可得到凝膠樣品的修飾度。