魯嘉欣

慢性萎縮性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)是一種由多致病因素引起的消化系統(tǒng)慢性疾病,以胃黏膜上皮和腺體萎縮,數(shù)目減少,胃黏膜變薄,黏膜基層增厚,或伴有腸上皮化生,或有不典型增生為特征[1]。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用根除幽門螺桿菌以及服用促動力藥、抑酸藥、胃黏膜保護劑、葉酸及維生素B12等作為主要治療手段,但這些療法對其癥狀的緩解及阻止黏膜病變進展的效果并不理想[2]。

升陽益胃湯出自《內(nèi)外傷辨惑論》,此湯主治脾胃氣虛,清陽不升,濕郁生熱之證。周迎春教授應(yīng)用此方,緊抓 “脾胃虛弱,陽氣不升,濕熱中阻”的核心病機,并概括其用藥指征為“乏倦納差口干苦,腹脹便溏或 便黏,舌淡胖大有齒痕,苔白黃膩并脈滑”,用于治療慢性胃炎等疾病[3]。有研究認(rèn)為CAG患者臨床辨證分型以脾胃虛弱證型較多,在升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎脾胃虛弱證的療效觀察中發(fā)現(xiàn),升陽益胃湯能有效改善臨床癥狀,提高臨床療效[4]。然而,目前關(guān)于升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的臨床療效觀察較少涉及藥理學(xué)研究,其潛在靶點及藥理學(xué)作用機制進一步研究。

本研究以升陽益胃湯為基礎(chǔ),基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論,初步探討升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的作用機制,構(gòu)建了藥物的活性成分、藥物靶點與慢性萎縮性胃炎相關(guān)疾病基因之間的相互作用網(wǎng)絡(luò),打破既往的藥物“單一成分、單一靶點、單一疾病”理念,為升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的臨床治療和相關(guān)科學(xué)研究提供支持。

1 材料和方法

1.1 升陽益胃湯中藥活性成分篩選 靶點預(yù)測通過TCMSP和Herb數(shù)據(jù)庫對黃芪、半夏、人參、炙甘草、獨活、防風(fēng)、白芍、羌活、陳皮、茯苓、柴胡、澤瀉、白術(shù)、黃連進行活性成分的收集。以化合物口服生物利用度(OB,%)≥30%,類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件并且將無靶點的成分篩選掉。

1.2 慢性萎縮性胃炎相關(guān)靶點的獲取通過在GeneCards、OMIM、DisGent數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“Chronic atrophic gastritis”進行檢索,以“Relevance score”大于等于1作為標(biāo)準(zhǔn)進行篩選,最終從而得到慢性萎縮性胃炎相關(guān)靶點。

1.3 藥物-疾病靶點預(yù)測結(jié)果將獲得的藥物作用靶點與慢性萎縮性胃炎靶點作韋恩圖,從而獲得交集基因。然后使用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“化合物-作用靶點”網(wǎng)絡(luò),根據(jù)化合物與靶點的連接情況篩選出藥物作用于慢性萎縮性胃炎的關(guān)鍵化合物。

1.4 靶蛋白相互作用及核心靶點篩選為了進一步研究藥物治療慢性萎縮性胃炎的蛋白之間的相互作用,將藥物-交集基因上傳至相互作用數(shù)據(jù)庫String進行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(PPI)數(shù)據(jù)庫;運用Cytoscape挑選核心的靶點做出蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO富集分析和KEGG通路分析將藥物-疾病交集基因進行GO、KEGG功能富集分析,利用微生信平臺GO基因功能從生物過程、細(xì)胞成分、分子功能三方面注釋藥物治療慢性萎縮性胃炎的作用靶蛋白在基因功能中的作用。為闡明藥物治療慢性萎縮性胃炎的靶點在信號通路中進行KEGG通路富集分析。選取GO功能條目和KEGG通路條目(P<0.05)作為藥物治療慢性萎縮性胃炎的主要基因功能富集過程和信號通路,預(yù)測中藥治療慢性萎縮性胃炎的作用機制。

1.6 分子對接將拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)排名靠前的大分子和小分子進行分子對接。使用AutodockTools1,2對蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)進行去水、加氫操作,并進行受體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備工作。使用Open Babel及Autodock 程序?qū)π》肿訋爝M行拆分等準(zhǔn)備工作。對接使用Autodock程序進行,最終將結(jié)果導(dǎo)入pymol進行對接結(jié)果的可視化。

2 結(jié)果

2.1 升陽益胃湯活性成分篩選及靶點預(yù)測通過TCMSP和Herb數(shù)據(jù)庫檢索并篩選,最終共得到黃芪16個、半夏11個、人參17個、炙甘草62個、獨活6個、防風(fēng)17個、白芍7個、羌活12個、陳皮5個、茯苓6個、柴胡11個、澤瀉5個、白術(shù)4個、黃連11個,共得到279個有效靶點。

2.2 慢性萎縮性胃炎相關(guān)靶點通過在GeneCards、DisGent、DisGent數(shù)據(jù)庫檢索慢性萎縮性胃炎相關(guān)的靶點,合并去重后共獲得841個靶點。

2.3 藥物-疾病靶點預(yù)測結(jié)果利用韋恩圖得到藥物-疾病交集基因102個,將上述所得的活性成分和有效交集靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入到 Cytoscape 3.8 進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,獲得疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。對疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)進行分析,各成分degree 值信息見圖1。其中自由度前五的活性成分分別為quercetin、kaempferol、7-O-methylisomucronulatol、formononetin、naringenin,推測可能是復(fù)方的重要成分。見圖1。

圖1 核心成分拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

圖2 核心靶點度值

2.4 核心靶點及網(wǎng)絡(luò)相互作用將共有靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)共有82個結(jié)點和252條邊。為進一步得到核心蛋白,再次將共有靶點導(dǎo)入String平臺,所得網(wǎng)絡(luò)進行可視化處理,進一步篩選核心靶點,最終得到升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的核心靶點共10個,分別為AKT1、TP53、IL6、TNF、JUN、VEGFA、IL1B、CASP3、PTGS2、STAT3。

2.5 生物功能富集分析

2.5.1 GO富集分析利用R軟件進行GO基因功能富集分析,共篩選出多條GO條目,其中生物過程(BP)相關(guān)的有3846條,細(xì)胞成分(CC)相關(guān)的242條,分子功能(MF)相關(guān)的350條。

2.5.2 KEGG通路富集分析利用R軟件進行KEGG通路富集分析,共富集到233條與藥物治療慢性萎縮性胃炎相關(guān)的通路,根據(jù)P<0.05篩選出藥物治療慢性萎縮性胃炎相關(guān)的通路,分別是:糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、乙型肝炎信號通路、膀胱癌癥信號通路、TNF信號通路、Th17細(xì)胞分化信號通路等。

2.6 分子對接分子對接結(jié)合熱能<-1 kcal·mol-1表示具有結(jié)合活性,<-5 kcal·mol-1表示結(jié)合活性較好。因此,由AutodockTools1.5.6軟件分子對接結(jié)果可知:拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)靠前的中藥化合物小分子quercetin、kaempferol與PPI核心蛋白拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)前10的大分子受體均具有良好的結(jié)合活性。其中quercetin、kaempferol與AKT1、TNF的結(jié)合熱能較低,結(jié)合活性較好。見表1。

表1 結(jié)合能表

3 討論

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)quercetin、kaempferol、7-O-methylisomucronulatol、formononetin、naringenin是本次研究中的重要成分。naringenin是一種具有多重結(jié)構(gòu)的生物堿成分,研究發(fā)現(xiàn)其活性成分的提取物與慢性萎縮性胃炎發(fā)作密切相關(guān),是治療慢性萎縮性胃炎藥物的重要載體,其主要作用機制可能和免疫調(diào)節(jié)有關(guān),有待更多動物研究佐證[5]。體內(nèi)和體外研究表明,含類黃酮和不含類黃酮的植物都有可能降低慢性萎縮性胃炎的發(fā)病率,在本研究中,山奈酚作為黃酮類物質(zhì),被認(rèn)為具有潛在的抗慢性萎縮性胃炎能力,這可能和其具有抗慢性萎縮性胃炎的植物成分有關(guān)[6]。山奈酚同時具有抗利尿和抗心律失常的潛力,可以對抗各種感染類疾病[7]。研究發(fā)現(xiàn),慢性萎縮性胃炎的發(fā)作過程和氧化還原反應(yīng)密切相關(guān),這可能和神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生改變有關(guān),以氧化應(yīng)激為靶點的臨床藥物,可明顯減少慢性萎縮性胃炎患者的發(fā)作頻率[8]。在眾多的抗慢性萎縮性胃炎藥物研究中發(fā)現(xiàn),黃酮類物質(zhì)可以通過調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)來發(fā)揮治療慢性萎縮性胃炎的作用。研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激反應(yīng)會產(chǎn)生應(yīng)激損傷,而黃酮類物質(zhì)會清除損傷產(chǎn)生的自由基從而發(fā)揮治療疾病的作用[9]。山柰酚可以明顯改善患者的氧化應(yīng)激損傷,降低患者的氧化應(yīng)激水平[10]。同時,黃酮類物質(zhì)可以與治療藥物中的結(jié)合位點相結(jié)合,與藥物共同發(fā)揮治療疾病的作用,保護大腦免受氧化應(yīng)激的傷害。研究發(fā)現(xiàn),炎癥反應(yīng)在慢性萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[11]。formononetin被認(rèn)為與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),能夠通過平衡 GABA-A 受體,降低丙二醛和TNF-α水平,升高谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和過氧化氫水平,影響神經(jīng)炎癥從而發(fā)揮抗慢性萎縮性胃炎的作用[12]。

成分-靶點網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)綜合分析的結(jié)果顯示,AKT1、TP53、IL6、TNF、JUN等靶點可能是升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的核心作用靶點。研究發(fā)現(xiàn),AKT1、IL6、TNF等炎癥因子通過參與炎癥反應(yīng)干預(yù)慢性萎縮性胃炎進程,是重要的胃炎調(diào)控蛋白,其可能是通過多種炎癥通路來發(fā)揮作用[13]。GO富集分析結(jié)果表明,升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎靶點的功能主要體現(xiàn)在對氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、活性氧代謝過程、細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)、對金屬離子的響應(yīng);細(xì)胞成分(CC)相關(guān)的有242條,涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、質(zhì)膜筏、小窩、突觸前膜的組成部分、突觸前膜的內(nèi)在成分等;其中分子功能(MF)相關(guān)的有350條,涉及碳酸鹽脫水酶活性、藥物結(jié)合、水解酶活性等。主要涉及的通路有AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、乙型肝炎信號通路、膀胱癌癥信號通路、TNF信號通路、Th17細(xì)胞分化信號通路等。研究證實,免疫、炎癥、氧化還原、離子轉(zhuǎn)運與細(xì)胞凋亡和慢性萎縮性胃炎發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14],促炎性信號通路IL-17信號通路、TNF信號通路與自身免疫系統(tǒng)炎癥密切相關(guān),信號通路被激活后立刻參與自身炎癥反應(yīng),這可能和相關(guān)有效因子被激活有關(guān),調(diào)控相關(guān)信號通路,可以調(diào)控慢性萎縮性胃炎的“神經(jīng)免疫性炎癥”過程[15]。

綜上,基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎作用機制進行挖掘并分析后表明,升陽益胃湯的活性成分quercetin、kaempferol、7-O-methylisomucronulatol、formononetin、naringenin等可通過AKT1、TP53、IL6、TNF、JUN等靶蛋白介導(dǎo)AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、乙型肝炎信號通路、膀胱癌癥信號通路、TNF信號通路、Th17細(xì)胞分化信號通路發(fā)揮抗慢性萎縮性胃炎作用。闡明了升陽益胃湯干預(yù)調(diào)控治療慢性萎縮性胃炎的分子作用機制,既體現(xiàn)了中藥治療慢性病多途徑,多靶點,多通路的治療方式,也驗證了中醫(yī)學(xué)的整體醫(yī)學(xué)觀,為后期臨床研究提供了理論支持。