王冬慧 荀玉芳 高曉鵬 郭 瑋 李文斌 賈 莉

在中國(guó)胃癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，由于早期胃癌患者癥狀缺乏特異性，以及中國(guó)未廣泛開(kāi)展胃癌的早期篩查，80%～90%的胃癌患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期[1-2]。多數(shù)進(jìn)展期胃癌患者已失去根治手術(shù)的機(jī)會(huì)，化學(xué)治療、放射治療等非手術(shù)方式則成為延長(zhǎng)患者生存期的手段[3]。PD-1 是T 淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)蛋白，在調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞衰竭中發(fā)揮著重要作用[4]。隨著免疫治療的發(fā)展，以程序性死亡受體-1（PD-1）抑制劑為代表的免疫抑制劑在進(jìn)展期胃癌的治療中顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者的細(xì)胞免疫處于免疫抑制狀態(tài)，與健康人群相比，其外周血CD3+、CD4+T 淋巴細(xì)胞占比及CD4+/CD8+比值顯著降低，CD8+T淋巴細(xì)胞占比顯著升高[6]；經(jīng)免疫治療后，CD3+、CD4+T 淋巴細(xì)胞占比及CD4+/CD8+比值較治療前顯著升高，CD8+T 淋巴細(xì)胞占比則較治療前顯著降低[7]。由此推測(cè)，外周血T 淋巴細(xì)胞亞群可能與胃癌免疫治療反應(yīng)性相關(guān)，可作為療效評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)。中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值（NLR）是反映全身炎癥反應(yīng)的有效指標(biāo)。研究表明，具有較高的基線NLR 水平的腫瘤患者易出現(xiàn)免疫治療抵抗，且腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)和患者死亡風(fēng)險(xiǎn)均顯著增高[8]。目前尚缺少預(yù)測(cè)進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的有效指標(biāo)。本研究探討了外周血T 淋巴細(xì)胞亞群及NLR 對(duì)進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的預(yù)測(cè)價(jià)值，旨在為患者的個(gè)性化治療提供可靠依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2020 年11 月至2023 年2 月于山西省運(yùn)城市中心醫(yī)院接受免疫治療的86 例進(jìn)展期胃癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）18～80 歲；（2）經(jīng)胃鏡檢查或活體組織病理檢查證實(shí)為胃腺癌[9]；（3）無(wú)手術(shù)指征，應(yīng)用PD-1 抑制劑進(jìn)行免疫治療，且至少完成1 個(gè)療程；（4）卡氏評(píng)分≥60 分，預(yù)計(jì)生存期3 個(gè)月及以上；（5）根據(jù)TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)[10]，患者均為Ⅲ～Ⅳ期；（6）影像學(xué)檢查結(jié)果示至少有1 處可測(cè)量病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）除免疫治療外，還接受了其他抗腫瘤治療；（2）存在心、肺、肝、腎功能異常；（3）存在免疫缺陷或合并其他惡性腫瘤；（4）合并免疫或代謝性疾?。唬?）近3 個(gè)月內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重感染；（6）合并再生障礙性貧血、骨髓纖維化等影響骨髓造血功能的疾病。入組患者的年齡為33～78 歲，平均年齡為（54.72±8.29）歲，平均卡氏評(píng)分為（82.18±10.23）分，平均BMI 為（23.69±3.21）kg/m2； 低分化56 例，中/高分化30 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43 例；TNM 分期Ⅲ期48 例，Ⅳ期38 例。所有患者均簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)202013）。

1.2 免疫治療方案

入組患者均應(yīng)用PD-1 抑制劑進(jìn)行免疫治療。用法：每日200 mg 靜脈滴注，30 min 輸注完畢，以21 d 為1 個(gè)療程，用藥至患者不耐受或疾病進(jìn)展[11-12]。本研究的入組患者均至少完成1 個(gè)療程。

1.3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)實(shí)體瘤免疫治療療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（iRECIST）[13]評(píng)估療效，將完全緩解、部分緩解、疾病穩(wěn)定的患者納入治療有效組（n＝55），將疾病進(jìn)展的患者納入治療無(wú)效組（n＝31）。

1.4 T 淋巴細(xì)胞亞群及NLR 檢測(cè)

于免疫治療前1 日采集所有入組患者的空腹肘靜脈血5 mL，置于抗凝管內(nèi)，分別加入鼠抗人CD4-PC5 單克隆抗體、鼠抗人CD25-FITC 單克隆抗體、鼠抗人CD127-PE 單克隆抗體、三色熒光單克隆抗體CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5、鼠抗人CD16+CD56-PE/CD19-PC5/CD3-FITC 熒光單克隆抗體（以上抗體均購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter 公司），避光孵育15 min；滴加500 μL 溶血?jiǎng)ㄙ?gòu)自美國(guó)Beckman Coulter 公司），室溫下充分裂解紅細(xì)胞15 min；加入2 mL PBS 溶液，混勻后，1 300 r/min離心5 min，棄上清；加入500 μL PBS 溶液，使用FC500 型流式細(xì)胞儀（購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter 公司）進(jìn)行分析。

于免疫治療前1 日采集所有入組患者的空腹肘靜脈血2 mL，使用BC-2600 型全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀 （購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）測(cè)定中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算NLR。

1.5 隨訪

采用電話和門(mén)診復(fù)查的方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，起始時(shí)間為接受免疫治療的當(dāng)日，每月1 次，隨訪截止時(shí)間為2023 年3 月1 日，終點(diǎn)事件為病情進(jìn)展或患者死亡。隨訪期間無(wú)患者失訪。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。采用多因素logistic 回歸模型分析進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的影響因素。采用ROC 曲線分析T 淋巴細(xì)胞亞群及NLR 對(duì)進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的預(yù)測(cè)價(jià)值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血T 淋巴細(xì)胞亞群水平與進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的關(guān)系

以CD3+T 淋巴細(xì)胞（872 個(gè)/μL）、CD4+T 淋巴細(xì)胞（521 個(gè)/μL）、CD8+T 淋巴細(xì)胞（414 個(gè)/μL）水平及CD4+/CD8+比值（1.38）的中位數(shù)為臨界值，將CD3+T 淋巴細(xì)胞水平≥872 個(gè)/μL 者納入高CD3+組，＜872 個(gè)/μL 者納入低CD3+組；CD4+T 淋巴細(xì)胞水平≥521 個(gè)/μL 者納入高CD4+組，＜521 個(gè)/μL 者納入低CD4+組；CD8+T 淋巴細(xì)胞水平≥414 個(gè)/μL 者納入高CD8+組，＜414 個(gè)/μL者納入低CD8+組；CD4+/CD8+比值≥1.38 者納入高CD4+/CD8+組，＜1.38 者納入低CD4+/CD8+組。結(jié)果顯示，高CD3+組的治療有效率顯著高于低CD3+組，高CD4+組的治療有效率顯著高于低CD4+組，高CD4+/CD8+組的治療有效率顯著高于低CD4+/CD8+組，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；高CD8+組與低CD8+組的治療有效率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 外周血T 淋巴細(xì)胞亞群水平與進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的關(guān)系/例（%）

2.2 NLR 與進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的關(guān)系

以NLR 的中位數(shù)（3.3） 為臨界值， 將NLR ≥3.3 的患者納入高NLR 組，＜3.3 的患者納入低NLR 組。結(jié)果顯示，低NLR 組的治療有效率顯著高于高NLR 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 NLR 與進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的關(guān)系/例（%）

2.3 影響進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，分別與低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者比較，中/高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的治療有效率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。不同年齡、BMI、TNM 分期患者的免疫治療療效差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 外周血T 淋巴細(xì)胞亞群水平與進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的關(guān)系/例（%）

2.4 影響進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的多因素logistic 回歸模型分析

以免疫治療的療效（有效＝1，無(wú)效＝0）作為因變量，將CD3+T 淋巴細(xì)胞 （≥872 個(gè)/μL＝1，＜872 個(gè)/μL＝0）、CD4+T 淋巴細(xì)胞 （≥521 個(gè)/μL＝1，＜521 個(gè)/μL＝0）、CD4+/CD8+比值（≥1.38＝1，＜1.38＝0）、NLR（≥3.3＝1，＜3.3＝0）、分化程度（中/高分化＝1，低分化＝0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無(wú)＝1，有＝0）作為自變量，納入多因素logistic回歸模型分析，結(jié)果顯示CD3+T 淋巴細(xì)胞、CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+比值、NLR、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P均＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 影響進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的多因素logistic 回歸模型分析

2.5 T 淋巴細(xì)胞亞群及NLR 對(duì)進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC 曲線分析結(jié)果顯示，外周血T 淋巴細(xì)胞亞群及NLR 對(duì)進(jìn)展期胃癌免疫治療療效均有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，其中CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+比值、NLR 和CD3+T 淋巴細(xì)胞的AUC 均＞0.6。見(jiàn)表5、圖1。

圖1 T 淋巴細(xì)胞亞群和NLR 預(yù)測(cè)進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的ROC 曲線

3 討論

流行病學(xué)研究顯示，在中國(guó)胃癌的發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤第3 位，疾病的社會(huì)負(fù)擔(dān)較重[14]。有研究報(bào)道，胃癌患者的5 年生存率僅為49.48%，處于較低水平[15]。根治術(shù)是目前胃癌患者獲得長(zhǎng)期生存的唯一方法，但由于多數(shù)患者確診時(shí)疾病處于進(jìn)展期，已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，故化學(xué)治療、放射治療和靶向治療等手段成為進(jìn)展期胃癌的重要治療方式[16]。腫瘤免疫治療是近年來(lái)快速發(fā)展的新一代治療方法，具有較好的應(yīng)用前景。研究表明，以PD-1 抑制劑為代表的免疫治療方案在進(jìn)展期胃癌的治療中發(fā)揮了重要作用[17]。不同于靶向治療，進(jìn)展期胃癌免疫治療目前尚未有明確的療效預(yù)測(cè)因子[18]。因此，尋求對(duì)進(jìn)展期胃癌免疫治療療效具有良好預(yù)測(cè)價(jià)值的因子，對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。

T 淋巴細(xì)胞亞群是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞群，在惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要作用[19]。研究表明，外周血T 淋巴細(xì)胞亞群水平的測(cè)定有助于評(píng)估胃癌患者的病情及預(yù)后，可為臨床治療和預(yù)后判斷提供可靠依據(jù)[6]。本研究結(jié)果顯示，高CD3+、CD4+T 淋巴細(xì)胞水平及高CD4+/CD8+比值的患者的治療有效率高于低水平者；且多因素logistic 回歸模型分析顯示，CD3+T 淋巴細(xì)胞、CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+比值均是影響進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這提示T 淋巴細(xì)胞水平較低可影響進(jìn)展期胃癌患者的免疫應(yīng)答，從而促使腫瘤進(jìn)展。

隨著免疫治療的廣泛應(yīng)用，其相關(guān)的不良反應(yīng)逐漸成為臨床醫(yī)生關(guān)注的焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥是免疫相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制之一。經(jīng)免疫治療后，炎癥因子被大量釋放，可引起炎癥因子風(fēng)暴，進(jìn)而影響療效，甚至威脅患者生命[20]。NLR 是一項(xiàng)炎癥/免疫相關(guān)指標(biāo)。Hwang 等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，NLR 與腫瘤內(nèi)T 淋巴細(xì)胞重塑相關(guān)，且免疫檢查點(diǎn)阻斷期間高NLR 與腫瘤轉(zhuǎn)移及治療反應(yīng)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，低NLR 組的治療有效率顯著高于高NLR 組，且多因素logistic 回歸模型分析顯示，NLR 是影響進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這符合以往的研究結(jié)果[20]。本研究還發(fā)現(xiàn)，分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亦是影響進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在臨床上還需進(jìn)行綜合分析。ROC 曲線分析結(jié)果顯示，外周血T 淋巴細(xì)胞亞群及NLR 對(duì)進(jìn)展期胃癌免疫治療療效均有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，其中CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+比值、NLR、CD3+T 淋巴細(xì)胞的AUC 均＞0.6，臨床上可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。

綜上所述，外周血T 淋巴細(xì)胞亞群和NLR 均可作為預(yù)測(cè)進(jìn)展期胃癌免疫治療療效的生物標(biāo)志物，具有臨床推廣價(jià)值。本研究存在不足之處：（1）樣本量較小，擬在今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探討；（2）本研究?jī)H針對(duì)PD-1 抑制劑的療效預(yù)測(cè)進(jìn)行分析，下一步將對(duì)其他免疫治療方案進(jìn)行探討，以進(jìn)一步證實(shí)外周血T 淋巴細(xì)胞亞群及NLR 在進(jìn)展期胃癌免疫治療療效預(yù)測(cè)中的價(jià)值；（3）隨訪時(shí)間較短，無(wú)法明確上述指標(biāo)對(duì)遠(yuǎn)期療效的預(yù)測(cè)價(jià)值，擬在今后的研究中延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，進(jìn)一步觀察。