徐嵐，胡泉，黃麗麗

咸寧市中心醫(yī)院（湖北科技學(xué)院第一附屬醫(yī)院）生殖中心，湖北咸寧 437100

據(jù)研究報(bào)道，中國(guó)大約有15%的育齡夫婦面臨不孕不育困境[1]。當(dāng)前，臨床對(duì)男性生育力的評(píng)估主要依據(jù)WHO 標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)對(duì)精子濃度、精子活力、形態(tài)等指標(biāo)來(lái)判斷，只能反映精液的一般現(xiàn)狀，即使檢測(cè)正常也可能被診斷為不育，臨床上需要尋找能預(yù)測(cè)男性生育能力的檢測(cè)方法[2]。當(dāng)前研究表明，高齡患者體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species, ROS）自由基過(guò)度產(chǎn)生會(huì)損傷精子DNA，導(dǎo)致精子受精能力下降[3]，因此高齡對(duì)男性精子的DNA 完整性可能存在不利影響[4]。而又有研究表明，男性精子頭部DNA 完整性（DNA fragmetation index of sperm, DFI）受損可能會(huì)增加其配偶發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[5]，因此完善精子DNA 碎片的檢測(cè)對(duì)男性生育力的評(píng)估非常重要。本研究回顧性分析2021 年8 月—2022 年8 月在咸寧市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的503 例男性患者的精液常規(guī)指標(biāo)和DFI 指數(shù)，分別按照年齡和DFI 指數(shù)分組，探討不同年齡組、不同DFI 組精液質(zhì)量的差異?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

在獲得患者及其家屬知情并同意的情況下選取在本院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的503 例男性患者作為研究對(duì)象，年齡23～50 歲。此次研究獲得咸寧市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：男性身體健康，無(wú)睪丸外傷，無(wú)家族遺傳性疾病及性功能障礙病史，無(wú)不良生活習(xí)慣（嗜煙、嗜酒、吸毒等）；無(wú)腮腺炎病史；男性體征明顯，睪丸、附睪及輸精管體檢無(wú)明顯異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者無(wú)遺傳性疾病家族史、無(wú)隱睪、睪丸腫瘤、無(wú)精癥、精索靜脈曲張、腮腺炎病史等。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 患者在取精前禁欲2～7 d，洗凈雙手手淫法取精，且精液完整取出收集在取精杯內(nèi)，稱重后立即放置于37℃恒溫箱內(nèi)溫育至完全液化后檢驗(yàn)。

1.3.2 精液常規(guī)檢測(cè) 用3 mL 巴斯德吸管上下吹吸使精液完全液化，充分混勻后移液器取10 ul 精液樣本于makler 計(jì)數(shù)板加樣池中，然后采用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA BEION V4.2）對(duì)男性精液參數(shù)進(jìn)行分析。

1.3.3 精子形態(tài)學(xué)檢測(cè) 將精液標(biāo)本制片干燥至少4 h并采用改良巴氏染色法染色，制片完成后將由檢驗(yàn)人員按照第五版操作手冊(cè)[6]正常精子判定標(biāo)準(zhǔn)在100 倍油鏡下篩選至少200 條精子，并計(jì)算正常精子形態(tài)百分率，≥4%即為正常。

1.3.4 精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 將適量精液標(biāo)本，用緩沖液稀釋成濃度為（1.5～2.0）×106/mL 的100 μl 精子懸液，然后與200 μl 酸處理液混勻30 s，再加入600 μl 吖啶橙染液進(jìn)行染色，再將標(biāo)本置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每個(gè)待檢測(cè)精液標(biāo)本至少檢測(cè)1 000 個(gè)精子，吖啶橙染液對(duì)精子核進(jìn)行染色，用于評(píng)估單鏈和雙鏈DNA 的比例。采用精子DFI 表示精子DNA 損傷的程度，并對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行分組。目前臨床上用于檢測(cè)DNA 損傷的方法主要有：彗星實(shí)驗(yàn)，精子染色體結(jié)構(gòu)檢測(cè)（sperm chromatin structure assay, SCSA），精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（sperm chromatin diffusion, SCD），TUNEL 檢測(cè)以及基于熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）技術(shù)等。與其他檢測(cè)方法相比SCD 是一種性價(jià)比高的檢測(cè)方法且已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。

1.4 觀察指標(biāo)

根據(jù)WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5 版）[6]精液各項(xiàng)參數(shù)的參考標(biāo)準(zhǔn)如下：禁欲天數(shù)：2～7 d，精液體積≥1.5 mL，pH:7.2～8.0，精子濃度≥15×106/mL，精子總數(shù)≥39×106個(gè)，前向運(yùn)動(dòng)精子PR≥32%，總活力PR+NP≥40%，不動(dòng)精子IM＜60%，正常精子形態(tài)≥4%，精子DNA 碎片指數(shù)（DFI）參考值＜25%。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，非正態(tài)分布采用中位數(shù)(四分位間距)[M（P25，P75）]來(lái)描述，方差不齊采用多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)（Kruskal-Wallis H）檢驗(yàn)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)于不服從雙變量正態(tài)分布的計(jì)量資料進(jìn)行spearman 秩相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同程度DFI 組男性精液參數(shù)比較

3 組結(jié)果分析表明，年齡越大，DFI 指數(shù)越高，不動(dòng)精子占比越高，而精子總活力越低，正常精子形態(tài)率越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他參數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 男性精子DFI 與年齡、精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)分析

精子DFI 與患者年齡、不動(dòng)精子呈正相關(guān)（P＜0.001）；與精子總活力、精子正常形態(tài)率呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001）；而其他參數(shù)與精子DNA 碎片不存在相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

表2 精子DFI 與年齡、精液參數(shù)的相關(guān)性分析

3 討論

研究表明，高齡、吸煙、生活作息不規(guī)律等不良生活習(xí)慣等因素會(huì)影響精子產(chǎn)生、降低精子質(zhì)量和損害精子功能，導(dǎo)致精子DNA 受損和男性不育[7]。學(xué)者們對(duì)男性不育患者的年齡與其精子DFI 相關(guān)性的研究比較多，且一致認(rèn)為DFI 水平越高，顯示研究對(duì)象年齡越大，這類似的結(jié)果也在一些研究中得到證實(shí)，例如當(dāng)男性年齡＞35 歲時(shí)精液質(zhì)量開始下降；20～35 歲組精子DNA 碎片率顯著低于36～57歲[8-9]等，本文結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。高齡之所以影響男性生育力，其機(jī)制可能是高齡男性睪丸結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生異常改變，而精液內(nèi)活性氧自由基濃度升高，同時(shí)伴隨體內(nèi)抗氧化能力減弱，繼而造成精子頭部DNA 單鏈或雙鏈出現(xiàn)損傷和斷裂，影響男性生育功能[10]。另外其他精液參數(shù)分析結(jié)果顯示，隨著DFI 水平的增加，精子總活力下降、正常形態(tài)精子率顯著降低，不動(dòng)精子占比增加；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，精子DFI 與患者年齡、不動(dòng)精子呈正相關(guān)，與精子總活力、精子正常形態(tài)率呈負(fù)相關(guān)，而與其他參數(shù)不存在相關(guān)性。因此檢測(cè)精子 DFI 可以在一定程度預(yù)測(cè)受檢者的年齡、精液中的精子活力和精子形態(tài)等情況。研究表明，隨著男性年齡的增大，會(huì)導(dǎo)致精液質(zhì)量下降，精子活力降低以及正常形態(tài)精子比例減少[11-12]，這與本研究的結(jié)果一致。而辜秀麗等[13]研究表明精子DFI 與精子活力（r=-0.406，P＜0.001）顯著相關(guān)，DFI 影響精子活力，與本研究結(jié)果“精子DFI 與精子活力（r=-0.365，P＜0.001）具有相關(guān)性”一致。此外，本研究中DFI 與精子濃度卻沒(méi)有明顯相關(guān)性，但隨著DFI 水平的增加，精子濃度有下降的趨勢(shì)，這可能與樣本選擇有關(guān)。DFI 影響精子活力與精子形態(tài)的機(jī)制可能是因?yàn)楦啐g患者精子DNA 損傷程度越高，為精子運(yùn)動(dòng)提供能量的線粒體功能缺陷越嚴(yán)重，導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力下降，同時(shí)也會(huì)誘導(dǎo)精子細(xì)胞發(fā)生凋亡，引起精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變[14]。這在Xu S 等[15]研究中有類似報(bào)道，男性年齡在40 歲以后精子總活力和精液參數(shù)則開始下降。在另外一篇文獻(xiàn)中也報(bào)道DFI≥25%組男性精子總活力、正常精子形態(tài)率明顯低于DFI＜25%組，受精率、可移植胚胎率、優(yōu)胚率、妊娠率均劣于對(duì)照組，而流產(chǎn)率高于對(duì)照組[16]。其他也有類似報(bào)道顯示DFI＞30%的男性配偶受精率不顯著低于DFI≤30%的男性配偶，但其囊胚發(fā)育不良的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)更高[17]。這表明高DFI 指數(shù)不僅明顯降低精子活力和正常精子形態(tài)，而且導(dǎo)致不動(dòng)精子占比增加，繼而影響男性配偶受精率，還可能導(dǎo)致囊胚發(fā)育不良，男性的生育能力明顯下降。

綜上所述，男性高齡對(duì)精子參數(shù)有顯著影響，因此高齡男性在生育前應(yīng)該進(jìn)行全面的精液質(zhì)量分析，充分評(píng)估男性生育能力，才能更有利于患者治療。在今后的研究中還將探討精子DNA 損傷對(duì)輔助生殖技術(shù)后生育結(jié)局的影響，進(jìn)一步探索精子DFI 在男性不育中的臨床應(yīng)用價(jià)值。