王麗瓊，魏長勇

（樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，四川省中藥質(zhì)量研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 樂山 614000）

小兒香橘丸是由蒼術(shù)、厚樸、陳皮、枳實(shí)、甘草等19 味中藥制成的大蜜丸，用于治療脾虛食滯所致的嘔吐便瀉、脾胃不和、身熱腹脹、面黃肌瘦、不思飲食［1-2］，其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2020 年版《中國藥典》 一部，但僅以橙皮苷為指標(biāo)成分，不能全面準(zhǔn)確地評價(jià)其質(zhì)量［3］。中藥質(zhì)量控制提倡全面性［4-7］，故多指標(biāo)成分測定為直接有效的方法［8-11］。

小兒香橘丸中蒼術(shù)、甘草為主藥，陳皮為輔藥，加上枳實(shí)、厚樸等藥味，全方合用效果顯著，符合中醫(yī)藥整體理念。一測多評法以性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)廉易得的對照品為內(nèi)標(biāo)，同時(shí)測定其他多種成分的含量，解決了中藥對照品昂貴、稀缺、管理困難等問題，在中藥材、中藥成方制劑質(zhì)量控制中應(yīng)用廣泛［12-18］。因此，本實(shí)驗(yàn)建立一測多評法同時(shí)測定小兒香橘丸中蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷的含量，以期為整體全面地控制該制劑質(zhì)量提供科學(xué)可靠的依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置DAD 檢測器（美國Agilent 公司）； XSE205 DualRange 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； CQ-100B 超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）； 16K 離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）。SVEATMA585V3 C18Opal、GL Sciences Intersustain AQ-C18、Welch Ultimate LP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），其中SVEATMA585V3 C18Opal 有3 個批號，分別為18333165、19303361、2111939。

蒼術(shù)素（批號111924-201806，純度99.5%）、厚樸酚（批號110729-202015，純度99.0%）、和厚樸酚（批號110730-201915，純度99.8%）、新橙皮苷（批號111857-201804，純度99.4%）、橙皮苷（批號110721-201818，純度96.2%）、柚皮苷（批號110722-201714，純度93.4%）、甘草苷（批號111610-201607，純度93.1%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院； 蕓香柚皮苷對照品（批號G22080134，純度98.8%） 購自壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。小兒香橘丸（市售，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號 16015845、18015421、15015420、19010678，每丸3 g）。乙腈為色譜純（北京百靈威科技有限公司）；N-N二甲基甲酰胺為分析純 （成都市科隆化學(xué)品有限公司）； 磷酸為分析純［重慶川東化工（集團(tuán)） 有限公司］； 水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷對照品適量，N-N二甲基甲酰胺制成質(zhì)量濃度分別為0.22、1.14、0.48、4.25、2.74、2.86、0.34 mg/mL 貯備液； 精密稱取橙皮苷對照品14.43 mg，置于25 mL 量瓶中，N-N二甲基甲酰胺溶解，制成貯備液，分別精密量取上述7 種貯備液1 mL，定容至刻度，即得（蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷質(zhì)量濃度分別為8.90、45.59、19.16、170.17、555.27、109.46、114.29、13.64 μg/mL）。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取本品10 粒，研細(xì)，取約6 g，精密稱定，加入適量硅藻土研磨均勻，置于具塞錐形瓶中，精密加入N-N二甲基甲酰胺50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h，放冷至室溫，N-N二甲基甲酰胺補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按本品處方工藝和比例，分別制成缺蒼術(shù)、缺厚樸、缺陳皮和枳實(shí)、缺甘草的陰性樣品（其中山藥、蓮子、薏苡仁、砂仁、白扁豆、六神曲經(jīng)樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心專家鑒定為正品，其他13 味藥材均購自中國食品藥品檢定研究院），按 “2.1.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 SVEATMA585V3 C18Opal 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相0.1% 磷酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫，程序見表1； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長286 nm （厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷）、338 nm （蒼術(shù)素）； 進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution manners

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密量取“2.1” 項(xiàng)下對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均符合要求，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取橙皮苷對照品29.28 mg，置于25 mL 量瓶中，N-N二甲基甲酰胺溶解，精密加入“2.1.1” 項(xiàng)下其他7 種成分貯備液各2 mL，定容至刻度，搖勻，分別精密量取4、3、2、1、0.5 mL，置于5 mL 量瓶中，N-N二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，并以S/N ＝10 為定量限，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.1.1” 項(xiàng)下對照品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷峰面積RSD 分別為 1.01%、0.86%、0.74%、0.87%、1.24%、1.31%、1.01%、1.33%，表明儀器精密度較好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷含量RSD 分別為1.82%、1.06%、0.89%、1.36%、1.01%、1.74%、1.85%、1.66%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，室溫（25 ℃） 下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷峰面積RSD 分別為0.57%、0.85%、0.74%、0.69%、1.25%、0.78%、0.81%、1.02%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的同一批樣品約3 g，加入一定量硅藻土，研磨均勻，置于具塞錐形瓶中，精密加入橙皮苷對照品約12 mg 及“2.1.1” 項(xiàng)下下蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷貯備液各0.6、0.5、0.6、0.5、0.9、0.5、0.7 mL，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷平均加樣回收率 （RSD） 分別為101.44% （1.36%）、99.50% （0.93%）、99.26% （1.67%）、101.23%（1.76%）、99.81% （1.91%）、101.71% （1.37%）、100.78% （1.28%）、99.77% （1.66%）。

2.4 相對校正因子計(jì)算 采用多點(diǎn)校正法，以橙皮苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他7 種成分的相對校正因子fk/s，公式為fk/s＝fk/fs＝ （CkAs） / （CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見表3。

表3 各成分對校正因子Tab.3 Relative correction factors for various constituents

2.5 耐用性試驗(yàn) 精密量取“2.1.1” 項(xiàng)下對照品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別考察SVEATMA585V3 C18Opal、GL Sciences Intersustain AQ-C18、Welch Ultimate LP-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm） 及同一品牌 ［SVEATMA585V3 C18Opal （250 mm×4.6 mm，5 μm）］ 不同批號（18333165、19303361、2111939） 色譜柱對相對校正因子的影響，結(jié)果見表4，可知均無明顯影響（RSD＜2%）。

表4 不同色譜柱對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different columns on relative correction factors

2.6 色譜峰定位

2.6.1 相對保留時(shí)間法 精密量取“2.1.1” 項(xiàng)下對照品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以橙皮苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他7 種成分的相對保留時(shí)間，按“2.5” 項(xiàng)下方法進(jìn)行定位，結(jié)果見表5，可知該方法穩(wěn)定性良好（RSD＜4%），能初步定位色譜峰。

表5 各成分相對保留時(shí)間Tab.5 Relative retention time of various constituents

2.6.2 紫外光譜輔助法 在相對保留時(shí)間一致的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)從紫外光譜形狀、特征吸收波長及其吸光度比值出發(fā)進(jìn)行分析。對照品、供試品溶液色譜圖中各成分二極管陣列檢測器采集的峰頂點(diǎn)紫外光譜圖見圖2，可知兩者一致。

圖2 各成分紫外光譜圖Fig.2 Ultraviolet spectrograms of various constituents

各成分紫外光譜特征波長及其吸光度比值見表6，可知供試品溶液色譜圖中各成分紫外光譜特征波長均與對照品溶液一致，特征波長吸光度比值亦然。結(jié)合圖2 發(fā)現(xiàn)，新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷均屬于黃酮類成分，其紫外光譜圖形狀、特征波長極其相似，不易分辨，但四者特征波長（286、248 nm） 吸光度比值有明顯區(qū)別，表明該參數(shù)可將結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)成分的紫外光譜進(jìn)行區(qū)分，可采用峰/峰、峰/谷、谷/峰、谷/谷等形式。綜上所述，紫外光譜形狀、特征吸收波長、特征波長吸光度比值層層遞進(jìn)，進(jìn)一步提高了定性準(zhǔn)確度，并且紫外光譜可準(zhǔn)確輔助定位色譜峰。

表6 各成分紫外光譜特征Tab.6 Ultraviolet spectral characteristics of various constituents

2.7 樣品含量測定 取4 批樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批3 份，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法、一測多評法計(jì)算含量，結(jié)果見表7，可知2 種方法所得結(jié)果接近［相對平均偏差（RAD） ＜4%］。

表7 各成分含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab.7 Results of content determination of various constituents （mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 色譜條件選擇 紫外光譜圖顯示，5 種黃酮類成分及厚樸酚、和厚樸酚在286 nm 波長處吸收較強(qiáng)，而含量較低的蒼術(shù)素適合338 nm 吸收峰，故選擇286、338 nm 作為檢測波長。再比較了SVEATMA585V3 C18Opal、GL Sciences Intersustain AQ-C18、Welch Ultimate LP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 的分離效果，發(fā)現(xiàn) SVEATMA585V3 C18Opal 色譜柱最優(yōu)，適用于小兒香橘丸中多成分含量同時(shí)測定。

3.2 內(nèi)標(biāo)選擇 由于橙皮苷對照品性質(zhì)穩(wěn)定，價(jià)廉易得，含量較高，色譜峰出峰時(shí)間適中，故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為內(nèi)標(biāo)。

3.3 色譜峰定位 本實(shí)驗(yàn)采用相對保留時(shí)間法進(jìn)行色譜峰定位，并且保留時(shí)間有偏移或有干擾時(shí)紫外光譜常作為輔助方法［19-20］。另外，新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷均屬于黃酮類化合物，紫外光譜圖極其相似，從形狀、特征吸收波長上無法區(qū)分，而本實(shí)驗(yàn)采用特征波長吸光度比值法，可達(dá)到滿意的定位效果，從而提高紫外光譜定性色譜峰的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立一測多評法同時(shí)測定小兒香橘丸中蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷的含量，該方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可為整體全面地控制該制劑質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)，并且首次采用特征波長吸光度比值法來定位色譜峰，可為區(qū)分其他同類物質(zhì)的紫外光譜提供思路。