周家田 尚觀勝 張聰 蔣德熊 袁冬冬 湯登堯 周江

食管癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，該病被列為第七大最常見的癌癥和第六大癌癥死亡原因［1］。食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）是目前食管癌主要組織學(xué)類型，病死率在全球所有腫瘤中排名第四，總體5 年生存率僅為15%～25%［2-4］。由于大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，導(dǎo)致ESCC患者的預(yù)后不理想，5 年總生存率較差［5-7］。因此，探索ESCC 發(fā)生轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制，對ESCC 早期診斷和治療的新型生物標(biāo)志物具有重要意義。

富含精氨酸和絲氨酸的卷曲螺旋1（RSRC1）也稱SRrp53，編碼富含精氨酸和絲氨酸家族的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用［8-9］。RSRC1 被報(bào)道在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃癌等癌癥中低表達(dá)，發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用［8，10］。如Teplyuk 等［10］研究表明在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，RSRC1 是微小RNA（miR）-10b的靶基因，miR-10b 通過調(diào)節(jié)RSRC1 的表達(dá)促進(jìn)體內(nèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性進(jìn)展。RSRC1 還被證明可以通過調(diào)節(jié)磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移［10］。最近，一些研究表明 RSRC1 基因多態(tài)性與癌癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。如Tang 等［11］發(fā)現(xiàn)RSRC1 基因多態(tài)性與神經(jīng)母細(xì)胞瘤易感性有關(guān)，該研究證實(shí)了攜帶RSRC1rs6441201A等位基因的參與者與神經(jīng)母細(xì)胞瘤風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān) 。目前關(guān)于RSRC1 在腫瘤進(jìn)展中的作用研究較少，且尚未有研究報(bào)道RSRC1 在ESCC 細(xì)胞發(fā)展中發(fā)揮的作用。因此，本研究將進(jìn)一步探究RSRC1對ESCC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響及其作用機(jī)制。本研究擬探討RSRC1 在ESCC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中的作用，揭示RSRC1 抑制ESCC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的新作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料與方法

一、生信分析

從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載ESCC mRN 表達(dá)矩陣（normal：11，tumor：81），利用edgeR 包進(jìn)行差異分析。本研究所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人ESCC 細(xì)胞系（TE-1，Eca-109，EC9706）和正常食管上皮細(xì)胞系Het-1A，培養(yǎng)在含10% FB 的RPMI-1640（Corning，美國）中，于37 ℃和5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并根據(jù)試劑盒操作說明書將blank、NC 和si-RSRC1 轉(zhuǎn)染到ESCC細(xì)胞。

2.qRT-PCR

通過TRIzol 試劑 （Merck，德國） 從ESCC 中提取總RNA。根據(jù)試劑盒說明，利用Hifair?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（Yeasen，中國）將總RNA 反轉(zhuǎn)錄。使用 Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix（Yeasen，中國）在ABI 12K 熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR） 儀（ThermoFisher，美國）上進(jìn)行qRT-PCR?；贓ca-109 細(xì)胞構(gòu)建了以下細(xì)胞分組：blank 組；NC 組；si-RSRC1 組，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對RSRC1 表達(dá)水平，并將GAPDH 用作內(nèi)源性對照。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物

3.蛋白免疫印跡法

通過RIPAlysis buffer（Beyotime，中國）從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)。使用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒（Beyotime，中國） 檢測蛋白質(zhì)濃度。對于蛋白質(zhì)印跡分析，細(xì)胞裂解物通過SDS-PAGE 電泳，隨后轉(zhuǎn)移到 PVDF。然后將膜在室溫下在脫脂牛奶中封閉約1 h，然后在4 ℃下與一抗過夜。用PBST 洗滌3 次，每次10 min 后，將膜與二抗在室溫下再孵育1 h。使用ECL 底物試劑盒以及凝膠成像系統(tǒng)ChemiDoc ?XRS+（Bio-rad，美國）檢測蛋白表達(dá)。

4.細(xì)胞活力測定

取慢病毒感染培養(yǎng)的 Eca-109 細(xì)胞接種到96孔板中。孵育0、24、48、72、96 h 后。向每孔中加入20 μL 的CCK-8 溶液，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。全功能微孔板檢測儀（PerkinElmer/envision，中國）檢測450 nm 處的吸光度。

5.遷移和侵襲檢測

細(xì)胞遷移的檢測：Eca-109 細(xì)胞（每孔1×105）重懸于無血清培養(yǎng)基，并接種于到上室，同時(shí)在下室加入10%的FBS（Thermo Fisher Scientific，美國）細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，用4%多聚甲醇固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行細(xì)胞染色。在顯微鏡下觀察成像情況并用Image J 軟件進(jìn)行分析。細(xì)胞侵襲的檢測：在Transwell 實(shí)驗(yàn)裝置（Corning，美國）的上室涂50 μL 基質(zhì)凝膠（BD Biosciences，美國），其余步驟與細(xì)胞遷移步驟一致。

二、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的資料以表示，2 組間比較采用t 檢驗(yàn)，重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量方差分析，P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RSRC1 在ESCC 中下調(diào)表達(dá)

qRT-PCR 結(jié)果顯示，與正常食管上皮細(xì)胞Het-1A 組相比，RSRC1 在人ESCC 細(xì)胞系（TE-1，Eca-109，EC9706）中的表達(dá)均下降（P 均＜ 0.05）。見圖1。因此，我們選擇了RSRC1 表達(dá)量相對較高的Eca-109 細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1 RSRC1 在ESCC 中的表達(dá)

二、RSRC1 抑制ESCC 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移

與NC 組相比，敲低RSRC1 的Eca-109 細(xì)胞中RSRC1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均降低（P 均＜0.01），見圖2A 和圖2B。隨后，通過CCK-8 檢測各組細(xì)胞活力，結(jié)果表明與NC 組相比，敲低RSRC1 明顯促進(jìn)了Eca-109 的細(xì)胞活力，見圖2C。最后，通過Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示與NC 組相比，敲低RSRC1明顯增加了Eca-109 中的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量，見圖2D 和圖2E。

三、RSRC1 可以調(diào)控PTEN/PI3K/AKT 信號通路

圖2 RSRC1 抑制 ESCC 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移

生信分析結(jié)果表明PTEN 在ESCC 組織中明顯低表達(dá)，見圖3A。以PTEN/PI3K/AKT 信號通路為研究對象，基于Eca-109 細(xì)胞構(gòu)建了以下細(xì)胞分組：blank 組；NC 組；si-RSRC1 組，然后通過蛋白免疫印跡法檢測各組細(xì)胞中PTEN/PI3K/AKT 信號通路相關(guān)因子的表達(dá)，結(jié)果顯示敲低RSRC1 明顯抑制了p-PTEN 的蛋白表達(dá)，而敲低RSRC1 明顯促進(jìn)了p-PI3K、p-AKT 的蛋白表達(dá)，見圖3B。

討 論

ESCC 是一種常見的人類惡性腫瘤，晚期ESCC患者的5 年總生存率相對較低［12］。ESCC 的發(fā)病機(jī)制尚未完全明晰，這使得難以發(fā)現(xiàn)晚期 ESCC 的有效治療方法。因此，進(jìn)一步探索ESCC 病理生理學(xué)的分子機(jī)制對于開發(fā) ESCC 的新療法非常重要。在本研究中，我們通過分子實(shí)驗(yàn)首次證明RCRC1在ESCC 細(xì)胞中低表達(dá)，可能是ESCC 中潛在的腫瘤抑制因子。先前研究發(fā)現(xiàn)，RSRC1 通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子雌激素受體β 的SUMO 化來抑制雌激素受體β 轉(zhuǎn)錄活性。此外，RSRC1 在腫瘤發(fā)展中起重要作用。Tang 等［11］研究發(fā)現(xiàn)RSRC1 基因多態(tài)性增加了兒童對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的易感性。Yu 等［8］研究發(fā)現(xiàn)RSRC1 可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。然而，RSRC1 在ESCC 發(fā)展中的作用尚未闡明。本研究通過CCK-8 檢測各組細(xì)胞活力，結(jié)果表明與對照相比，敲低RSRC1 明顯促進(jìn)了Eca-109 的細(xì)胞活力；通過Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示與對照相比，敲低RSRC1明顯增加了Eca-109 中的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量，首次發(fā)現(xiàn)RSRC1 能夠抑制ESCC 細(xì)胞的增殖和遷移，這與前人研究結(jié)果一致，這一結(jié)果豐富了我們對ESCC 發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識，并提示靶向RSRC1可能是治療ESCC 的新策略。

有學(xué)者認(rèn)為PTEN 是一種腫瘤抑制基因，可以通過直接抑制PI3K/AKT 信號通路來抑制癌癥進(jìn)展［13］。PTEN 是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及存活的脂質(zhì)和蛋白磷酸酶，被充分證明為關(guān)鍵的腫瘤抑制因子，可以在多種癌癥（包括ESCC）中發(fā)揮腫瘤抑制作用［14-16］。Kuo 等［17］研究發(fā)現(xiàn)芝麻素能夠通過促進(jìn) PTEN 表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。Zhang 等［18］研究發(fā)現(xiàn)miR-155 通過下調(diào)PTEN 促進(jìn)ESCC 的遷移和侵襲。更重要的是，PTEN 是PI3K/AKT 信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子［19］。據(jù)報(bào)道，miR-93-5p 可通過抑制PTEN 的表達(dá)激活PI3K/AKT 信號通路促進(jìn)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的進(jìn)展［20］。蛇床子素通過激活PTEN抑制PI3K/AKT 信號通路誘導(dǎo)ESCC 細(xì)胞的凋亡［21］。為了確定RSRC1 抑制ESCC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，我們通過查閱文獻(xiàn)得到RSRC1 通過促進(jìn)PTEN 表達(dá)抑制腫瘤進(jìn)展，推測RSRC1 和PTEN 呈正相關(guān)，本研究通過生信分析發(fā)現(xiàn)PTEN 在ESCC組織中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步通過蛋白免疫印跡法檢測各組細(xì)胞中PTEN/PI3K/AKT 信號通路相關(guān)因子的表達(dá)，結(jié)果顯示敲低RSRC1 明顯抑制了p-PTEN的蛋白表達(dá)，而敲低RSRC1 明顯促進(jìn)了p-PI3K、p-AKT 的蛋白表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RSRC1 可以通過調(diào)節(jié)PTEN/ PI3K/AKT 信號通路抑制ESCC 細(xì)胞的增殖和遷移，這與前人的研究結(jié)果一致。

本研究證明RSRC1 是ESCC 中潛在的腫瘤抑制基因，并且能夠抑制ESCC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移以及調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT 信號通路。因此，RSRC1可能是ESCC 的潛在診斷生物標(biāo)志物，可以作為ESCC 治療的新靶點(diǎn)，并在未來的藥物開發(fā)中起到作用。然而，我們的研究還存在不足，缺少RSRC1 在體內(nèi)的研究，以及這種類型的調(diào)控是否與mRNA 替代剪接有關(guān)。這也是我們未來研究的重要方向，我們將在細(xì)胞、分子以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對這一課題進(jìn)行進(jìn)一步的探究。

綜上所述，RSRC1 可能通過調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT 信號通路抑制ESCC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，為豐富ESCC 的發(fā)病機(jī)制提供了新的方向，為RSRC1可以作為ESCC 治療的潛在靶點(diǎn)提供理論支持。