楊霽虹，周漢琛，徐玉婕

不同茶樹品種中基因催化功能、啟動子結(jié)構(gòu)及功能分析

楊霽虹，周漢琛*，徐玉婕

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，安徽 黃山 245000

香葉醇是茶樹中重要的萜烯類化合物，在不同茶樹品種中的積累存在較大差異。茶樹核苷二磷酸水解酶（Nucleoside diphosphate hydrolase，Nudix）基因可促進(jìn)香葉醇及其糖苷在茶樹中的積累。為探究該基因在不同茶樹品種中的催化功能及調(diào)控差異，分析了7個(gè)茶樹品種中香葉醇的積累差異及時(shí)空表達(dá)變化，同時(shí)分析了該基因的催化功能及其啟動子結(jié)構(gòu)和功能差異。結(jié)果顯示，表達(dá)量與香葉醇含量變化呈顯著正相關(guān)（0.805）；香葉醇在中國變種茶樹嫩梢中的含量顯著高于阿薩姆變種茶樹。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系表明，不同茶樹品種的均能促進(jìn)香葉醇的生物合成。啟動子活性分析顯示，云抗10號茶樹品種中的啟動子活性較弱；結(jié)構(gòu)分析表明，云抗10號茶樹品種啟動子在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)–33處有185堿基的序列插入，使得增強(qiáng)元件CAAT-box位于–133處（其他品種CAAT-box均位于–47處）。研究結(jié)果表明不同茶樹品種中的均能夠促進(jìn)香葉醇的生物合成，但啟動子區(qū)域遺傳多樣性使得其表達(dá)水平有差異。

茶樹；香葉醇；基因；功能分析；啟動子分析

研究顯示野生型阿薩姆茶樹（Ancestralvar.）、栽培型阿薩姆茶樹（Cultivatedvar.，CSA）和中國變種茶樹（var.，CSS）在遺傳進(jìn)化樹上分別屬于不同分枝，且目前我國茶樹栽培品種遺傳背景差異較大，其內(nèi)源代謝途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)及代謝產(chǎn)物積累存在差異[1-3]。Zhang等[4]研究顯示，云南、貴州、廣東栽培茶樹品種多為阿薩姆變種；安徽、浙江及福建北部栽培茶樹品種間親緣關(guān)系較近，遺傳背景差異較小，區(qū)別于福建南部和臺灣栽培品種，也區(qū)別于江西、湖北、陜西等地區(qū)栽培品種，表明了茶樹品種豐富的遺傳多樣性。Takeo[5]分析了33個(gè)茶樹品種（品系）中香葉醇及芳樟醇的含量，并計(jì)算了萜烯指數(shù)，發(fā)現(xiàn)變種茶樹中的萜烯指數(shù)最高可達(dá)到1；中國種與阿薩姆種雜交品種中萜烯指數(shù)分布范圍為0.21～0.76；日本地區(qū)栽種的變種茶樹中萜烯指數(shù)為0.12～0.69，表明不同茶樹品種中芳樟醇和香葉醇含量存在顯著差異。

香葉醇作為茶葉中重要的單萜烯醇，是綠茶和紅茶的重要呈香物質(zhì)，其閾值低（6～75?μg·L-1）[6]，且具有濃郁的玫瑰花香和甜香特征。茶樹中的香葉醇主要以糖苷形式存在，在加工過程中，由內(nèi)源糖苷水解酶催化并釋放出游離態(tài)香葉醇[7-8]。羅勒（）[9]、細(xì)毛樟（）[10]、紫蘇（）[11]、長春花（）[12]等植物中的香葉醇可由香葉醇合成酶（Geraniol synthase，GES）直接催化底物牻牛兒基焦磷酸（Geranyl diphosphate，GPP）生成[13]。Magnard等[14]研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰中的核苷二磷酸水解酶（Nucleoside diphosphate hydrolase，Nudix）基因可以脫去GPP的單磷酸基團(tuán)形成牻牛兒基單磷酸（Geranyl monophosphate，GP），再通過另一種磷酸水解酶催化合成香葉醇，這是玫瑰中合成香葉醇的主要途徑。在茶樹中，Nudix基因家族中定位于細(xì)胞質(zhì)的可以顯著促進(jìn)香葉醇及其糖苷在轉(zhuǎn)基因植物中的積累[15-16]。研究顯示，茶樹萜類合成酶轉(zhuǎn)基因煙草葉片中可檢測到香葉醇的微弱積累，但體外酶活反應(yīng)中該基因重組蛋白無法催化底物GPP生成香葉醇[17]。

香葉醇作為茶樹中重要的單萜類物質(zhì)，對成品茶香氣品質(zhì)形成具有重要作用?；诓铇滟Y源的遺傳多樣性，本研究擬通過分析不同茶樹品種中香葉醇的積累變化及功能差異，以期探究遺傳背景差異下的香葉醇生物合成機(jī)制，為后續(xù)研究其代謝途徑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿薩姆茶樹品種佛香3號（FX3）、云抗10號（YK10）、雪芽100（XY100）、紫娟（ZJ），中國種茶樹品種舒茶早（SCZ）、中茶108（ZC108）、浙農(nóng)117（ZN117）均種植于安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)基地，于10月中旬按一芽一葉標(biāo)準(zhǔn)采摘，取樣后立即置于液氮中速凍，并于?80?℃冰箱保存?zhèn)溆?。本氏煙草（）生長于溫室（白天25?℃，夜晚23?℃）中，光照時(shí)間為16?h。

AR2000廣譜糖苷酶購自上海普邁生物科技有限公司；大腸桿菌DH5購自上海吐露港生物科技有限公司；根癌農(nóng)桿菌GV3101購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒（DP441）購自天根生化科技有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR036A）、I限制性內(nèi)切酶（1093A）、I限制性內(nèi)切酶（1078A）、QuickCut?d Ⅲ限制性內(nèi)切酶（1615）、QuickCut?H Ⅰ限制性內(nèi)切酶（1605）均購自TaKaRa公司；KOD One PCR Master Mix（KMM-101）聚合酶購自TOYOBO公司；平末端克隆試劑盒5?min TOPO-Blunt Cloning Kit（C602-01）、快速克隆試劑盒（ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit）和熒光定量分析試劑（Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒（?Plasmid MiniPrep Kit）和膠回收試劑盒（?PCR Purification Kit）購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104電子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司；RCT basic磁力加熱攪拌器，德國艾卡公司；GCMS-QP2020 NX氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本Shimadzu公司；50/30?μm DVB/CAR/PDMS萃取頭及手動固相微萃?。⊿PME）進(jìn)樣器，美國Supelco公司；LightCycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；SimpliAmp PCR儀，賽默飛世爾科技有限公司；DYY-6D電泳儀，北京六一生物科技有限公司；GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；MQT-60R振蕩培養(yǎng)箱，上海旻泉儀器有限公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 揮發(fā)性化合物吸附方法

參考文獻(xiàn)[15]中方法，不同茶樹品種的嫩梢和瞬時(shí)侵染的本氏煙草葉片用液氮研磨粉碎后，準(zhǔn)確稱取0.1?g樣品，加入2?mL蒸餾水、200?μL 200?mg·mL-1AR2000廣譜糖苷酶和1?μL 10?μg·mL-1癸酸乙酯，于37?℃水浴下反應(yīng)20?min，然后利用SPME萃取頭（50/30?μmol·L-1DVB/CAR/PDMS Stableflex，USA）于65?℃水浴下吸附30?min，用于GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS分析

色譜柱為DB-5MS（30?m×0.25?mm×0.25?μm，Agilent，USA）。具體參數(shù)如下：總流量為17?mL·min-1，柱流量為1?mL·min-1，線速率為36.1?cm·s-1，分流比為10∶1，吹掃流量為6?mL·min-1。吸附完成的SPME萃取頭立即于250?℃進(jìn)樣口中解吸附5?min。柱溫箱升溫程序：40?℃保留5?min，以3?℃·min-1速率上升到85?℃并保留2?min，以3?℃·min-1速率上升到110?℃并保留1?min，以5?℃·min-1速率上升到200?℃并保留1?min，最后以15?℃·min-1速率上升到260?℃并保留3?min。

以癸酸乙酯為內(nèi)標(biāo)，以癸酸乙酯峰面積與化合物峰面積之比計(jì)算香葉醇含量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 基因表達(dá)分析

1.3.4 基因、啟動子克隆及載體構(gòu)建

將茶樹基因組數(shù)據(jù)中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1?500?bp核苷酸序列設(shè)為該基因啟動子區(qū)域，利用南京諾唯贊官網(wǎng)提供的引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站（https://crm.vazyme.com/ce-tool/ simple.html）設(shè)計(jì)克隆引物（表1）。

以不同茶樹品種的cDNA為模板，利用表1中引物（--F和--R）進(jìn)行全長克隆，1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，回收后的目的片段利用ClonExpress?ⅡOne Step Cloning Kit試劑盒連接到經(jīng)Ⅰ、Ⅰ雙酶切后的植物表達(dá)載體pZP121上，用于過量表達(dá)分析（pZP121-）。以不同茶樹品種的基因組DNA為模板，利用表1中引物（F和--R）進(jìn)行啟動子克隆，1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，回收后的目的片段利用ClonExpress?ⅡOne Step Cloning Kit試劑盒連接到經(jīng)d Ⅲ、H Ⅰ雙酶切后的植物表達(dá)載體pBI121上，用于-葡萄糖醛酸酶（-glucuronidase，GUS）染色分析（pBI121-）。連接載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，過夜培養(yǎng)后挑選陽性克隆送至擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行測序。

表1 引物序列

注：加粗字母表示酶切位點(diǎn)；下劃線序列表示基因特異性引物

Note: The bold letters indicte the restriction site. The underlined sequences indicate gene-specific primers

1.3.5基因啟動子結(jié)構(gòu)分析

利用CLUSTALW（www.genome.jp/ tools- bin/clustalw）和GENEDOC軟件比對序列差異，并利用PlantCARE網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）在線分析啟動子序列的順式作用元件。

1.3.6 煙草瞬時(shí)表達(dá)

將測序成功的重組質(zhì)粒pZP121-和pBI121-用凍融法轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101，PCR鑒定陽性克隆后，避光振蕩培養(yǎng)（28?℃，200?r·min-1，16～24?h）并侵染本氏煙草葉片。具體操作方法如下：GV3101菌液培養(yǎng)至適宜濃度（OD600值約為0.8），3?500?r·min-1離心5?min收集菌體，用緩沖液（5?mg·mL-1-葡萄糖，50?mmol·L-1MES，2?mmol·L-1Na3PO4·12H2O，20?mg·L-1乙酰丁香酮）洗滌2次，然后用緩沖液重懸至OD600為0.6左右；采用一次性無菌注射器將菌液從下表皮緩慢注射入本氏煙草葉片中，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)[20]。

分別以注射緩沖液和野生型本氏煙草葉片為對照，收取侵染3～4?d的本氏煙草葉片，于–80?℃冰箱保存。按照1.3.1章節(jié)和1.3.2章節(jié)方法測其香葉醇的含量。

1.3.7 GUS組織染色分析

GUS染色液由50?mmol·L-1PBS（pH 7.2），0.1% Triton X-100，2?mmol·L-1K4[Fe(CN)6]·3H2O，2?mmol·L-1K3[Fe(CN)6]，10?mmol·L-1EDTA，2?mmol·L-15-溴-4-氯-3-吲哚--葡糖苷酸環(huán)己胺鹽（X-Gluc）組成，將處理后的葉片（侵染3～4?d）立即浸沒在染色液中，于37?℃培養(yǎng)箱中避光孵育12?h，然后利用75%乙醇脫色，用于后續(xù)觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 20.0軟件對不同樣品中香葉醇含量及基因表達(dá)量進(jìn)行方差分析，采用Duncan法分析不同樣品間的顯著性（<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同月份茶樹中香葉醇合成酶基因表達(dá)分析

基于可促進(jìn)茶樹中香葉基櫻草糖苷的積累[15]，萜類合成酶轉(zhuǎn)基因本氏煙草葉片中也可檢測到香葉醇的積累[17]，本研究分析了舒茶早茶樹品種不同月份嫩梢中香葉醇的代謝譜與和基因的表達(dá)譜。

結(jié)果表明，茶樹嫩梢中的香葉醇含量在3、4、5月較高，在1、2、7月較低（圖1）。qRT-PCR分析表明，和在不同月份茶樹嫩梢中的表達(dá)模式較為接近，均在3月表達(dá)量最高。通過Pearson運(yùn)算方法分析了不同月份嫩梢中香葉醇含量與、相對表達(dá)量間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，相對表達(dá)量與香葉醇含量的相關(guān)系數(shù)（）為0.805；相對表達(dá)量與香葉醇含量也存在顯著正相關(guān)性（=0.818），表明和與茶樹中香葉醇的生物合成密切相關(guān)，但由于體外酶活反應(yīng)中無法催化底物GPP生成香葉醇，本研究不進(jìn)行討論。

2.2 香葉醇含量及CsNUDX1-cyto、CsTPS10表達(dá)分析

本研究利用HS-SPME-GCMS分析了3個(gè)CSS（舒茶早、中茶108、浙農(nóng)117）和4個(gè)CSA茶樹品種（佛香3號、云抗10號、雪芽100、紫娟）鮮葉中的香葉醇含量。由圖2可知，不同茶樹品種鮮葉中的香葉醇含量存在顯著差異，舒茶早鮮葉中的香葉醇含量最高（7.65?μg·g-1），其次為中茶108。CSS茶樹品種鮮葉中的香葉醇含量均顯著高于CSA茶樹品種鮮葉，如舒茶早中的香葉醇含量約為雪芽100（0.08?μg·g-1）的95.6倍。

芳樟醇是茶樹中另一個(gè)重要的單萜化合物，與香葉醇的合成前體物質(zhì)相同，均為GPP[8]。本研究同時(shí)分析了7個(gè)茶樹品種鮮葉中芳樟醇及其氧化物的含量，結(jié)果表明，兩類茶樹變種鮮葉中的芳樟醇含量無顯著性差異，但芳樟醇呋喃型氧化物（芳樟醇氧化物Ⅰ和芳樟醇氧化物Ⅱ）在CSS茶樹中的含量顯著高于CSA茶樹品種。

qRT-PCR分析表明，在中茶108嫩梢中的表達(dá)量最高，在浙農(nóng)117嫩梢中的表達(dá)量最低；在雪芽100中的表達(dá)量最高，在佛香3號、云抗10號、紫娟及浙農(nóng)117中的表達(dá)量無顯著差異。不同月份茶樹中香葉醇含量與和表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，而不同茶樹品種中香葉醇積累與這兩個(gè)基因表達(dá)量的相關(guān)性不明顯，推測茶樹遺傳背景多樣性使得香葉醇生物合成存在差異調(diào)控。

圖1 香葉醇含量與CsTPS10、CsNUDX1-cyto表達(dá)量的相關(guān)性分析

注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）

2.3 CsNUDX1-cyto的功能分析

為探究不同茶樹品種中CsNUDX1-cyto催化能力是否存在差異，本研究克隆了7個(gè)茶樹品種中的，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系將其瞬時(shí)過量表達(dá)于本氏煙草葉片中，以檢測香葉醇積累差異。以注射緩沖液的本氏煙草葉片（CK）為陰性對照，已鑒定功能的舒茶早為陽性對照，采用HS-SPME-GCMS方法檢測了7個(gè)處理組葉片中香葉醇的豐度變化。結(jié)果表明，與陰性對照及野生型本氏煙草葉片相比，瞬時(shí)過量表達(dá)7個(gè)茶樹品種基因均能夠顯著促進(jìn)香葉醇的積累；雪芽100的過表達(dá)葉片中香葉醇積累量高于陽性對照（圖3）。

2.4 CsNUDX1-cyto啟動子活性分析

qRT-PCR結(jié)果表明（圖4），在不同茶樹品種中的表達(dá)水平存在顯著差異，但均能促進(jìn)香葉醇的積累?；诖?，本研究構(gòu)建了7個(gè)品種的proCsNUDX11500-cyto:GUS融合載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，使其在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)，然后采用X-Gluc染色法分析各啟動子的活性。為消除葉片生長發(fā)育狀態(tài)對X-Gluc染色的影響，本研究以ZC108-proCsNUDX11500-cyto:GUS為對照，在同一片葉子兩側(cè)分別注射不同表達(dá)載體。結(jié)果顯示，7個(gè)茶樹品種基因啟動子均能正常驅(qū)動基因表達(dá)。與對照ZC108-proCsNUDX11500-cyto:GUS相比，雪芽100、紫娟、佛香3號、浙農(nóng)117、舒茶早5個(gè)品種的proCsNUDX11500-cyto活性差異較?。℅US染色程度相近），而云抗10號茶樹品種的proCsNUDX11500-cyto活性較弱。

注：WT表示野生型本氏煙草葉片，CK表示對照，F(xiàn)X3、YK10、XY100、ZJ、SCZ、ZC108、ZN117分別表示佛香3號、云抗10號、雪芽100、紫娟、舒茶早、中茶108、浙農(nóng)117過表達(dá)樣品

注：以中茶108茶樹品種CsNUDX1-cyto啟動子為陽性對照，同一片葉子兩側(cè)分別注射不同表達(dá)載體

2.5 CsNUDX1-cyto啟動子結(jié)構(gòu)分析

不同茶樹品種基因啟動子序列比對結(jié)果如圖5所示。云抗10號啟動子在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)–33處有185堿基的序列插入，其插入序列中雖存在TATA-box等重要啟動元件，但重要增強(qiáng)子元件CAAT-box距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)較遠(yuǎn)（位于–113處），其他品種CAAT-box位于–47處。CAAT-box可控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，研究發(fā)現(xiàn)，TATA-box上游存在CAAT-box時(shí)，基因的表達(dá)會增強(qiáng)[21]。推測云抗10號的啟動子活性弱可能與–33處堿基的序列插入有關(guān)。

通過Plant CARE對啟動子序列進(jìn)行順式作用元件分析，除了包含負(fù)責(zé)基因轉(zhuǎn)錄起始準(zhǔn)確性及高效性的TATA-BOX和CAAT-BOX，還包含多個(gè)非生物逆境調(diào)控元件，如光響應(yīng)元件G-box、Box4、GT1-motif和Box Ⅱ，防御應(yīng)激響應(yīng)元件STRE，脫落酸響應(yīng)元件ABRE、ABRE4，生長素響應(yīng)元件TGA-element，赤霉素響應(yīng)元件P-box，乙烯響應(yīng)元件ERE，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件AAGAA-motif、CTAG-motif、MYC和MYB等。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，不同月份樣品中的和表達(dá)量變化與香葉醇積累均呈顯著正相關(guān)，表明這兩個(gè)基因與香葉醇生物合成密切相關(guān)。不同月份樣品中的表達(dá)量與香葉醇積累的相關(guān)性更顯著，但該基因重組蛋白無法催化底物GPP或法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）生成任何萜類物質(zhì)[17]。研究顯示，只有通過外源添加底物GPP，過量表達(dá)的煙草葉片中才可通過SPME-GC-MS檢測到香葉醇的釋放。而無論是在重組蛋白活性檢測（催化GPP生成GP）還是轉(zhuǎn)基因植株分析中（促進(jìn)香葉醇及其糖苷的積累）均具有生物學(xué)活性[15]。結(jié)合本研究結(jié)果，表明轉(zhuǎn)錄表達(dá)受季節(jié)、茶樹發(fā)育狀態(tài)影響較大，與萜類物質(zhì)的釋放具有相似規(guī)律，但該基因生物學(xué)活性較弱，推測其在茶樹中不是主導(dǎo)香葉醇生物合成的萜類合成酶基因。和表達(dá)量在供試的7個(gè)茶樹品種中有明顯差異，其中在中茶108嫩梢中的表達(dá)量最高，在浙農(nóng)117嫩梢中的表達(dá)量最低；在雪芽100茶樹嫩梢中的表達(dá)量最高。HS-SPME-GCMS結(jié)果顯示，中國變種茶樹與阿薩姆變種茶樹中的香葉醇積累有顯著性差異。與月份相關(guān)性分析不同的是，不同茶樹品種中和的表達(dá)量與香葉醇生物合成量相關(guān)性較弱，推測茶樹具有遺傳多樣性，不同茶樹品種遺傳基礎(chǔ)存在差異，且存在調(diào)控香葉醇生物合成的機(jī)制是多樣的，如蛋白水平在不同茶樹品種中是否存在差異？在后續(xù)研究中可進(jìn)一步解析。此外，本研究表明，不同茶樹品種中的均具有催化底物GPP生成香葉醇的生物學(xué)功能。

圖5 不同茶樹品種CsNUDX1-cyto基因啟動子序列比對及結(jié)構(gòu)分析

啟動子序列可通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而控制基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[22]。qRT-PCR定量分析顯示，品種間表達(dá)水平與香葉醇含量變化相關(guān)性較弱。啟動子活性分析顯示，除云抗10號品種中啟動子活性較弱外，其他品種間啟動子活性差異較小，導(dǎo)致不同茶樹品種中香葉醇積累差異的因素較多，如可能存在尚未發(fā)現(xiàn)的能夠合成香葉醇的萜類合成酶（Terpene synthase，TPS）以及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的差異等。Zhou等[23]研究顯示，芳樟醇為茶樹中重要的單萜類物質(zhì)，其生物合成前體為GPP，與香葉醇生物合成前體相同，具有相同底物的催化酶存在競爭關(guān)系。本研究中芳樟醇含量在兩類變種茶樹中的差異不明顯，而呋喃型芳樟醇氧化物在兩類變種茶樹中存在顯著性差異。Zeng等[24]研究表明，芳樟醇氧化物的積累與茶樹葉片面積呈顯著負(fù)相關(guān)，推測是由于阿薩姆變種茶樹葉片面積普遍較大，光照抑制了芳樟醇氧化物的合成。

綜上所述，和表達(dá)水平與香葉醇積累存在相關(guān)性；不同茶樹品種中香葉醇含量有顯著性差異；不同茶樹品種中的催化底物能力有差異，但均能促進(jìn)香葉醇的生物合成。

[1] Wang X C, Feng H, Chang Y X, et al. Population sequencing enhances understanding of tea plant evolution [J]. Nature Communications, 2020, 11(1): 4447. doi: 10.1038/s41467-020-18228-8.

[2] 夏恩華, 韋朝領(lǐng), 宛曉春. 茶樹生物學(xué)“十三五”進(jìn)展及“十四五”發(fā)展方向[J]. 中國茶葉, 2021, 43(9): 31-41. Xia E H, Wei C L, Wan X C. Tea plant biology process during the 13thFive-Year Plan period and development direction in the 14thFive-Year Plan period [J]. China Tea, 2021, 43(9): 31-41.

[3] An Y L, Mi X Z, Zhao S Q, et al. Revealing distinctions in genetic diversity and adaptive evolution between two varieties ofby whole-genome resequencing [J]. Frontiers in Plant Science, 2020, 11: 603819. doi: 10.3389/fpls.2020.603819.

[4] Zhang X T, Chen S, Shi L Q, et al. Haplotype-resolved genome assembly provides insights into evolutionary history of the tea plant[J]. Nature Genetics, 2021, 53(8): 1250-1259.

[5] Takeo T. Variation in amounts of linalool and geraniol produced in tea shoots by mechanical injury [J]. Phytochemistry, 1981, 20(9): 2149-2151.

[6] Ho C T, Zheng X, Li S M. Tea aroma formation [J]. Food Science and Human Wellness, 2015, 4(1): 9-27.

[7] 賀志榮, 項(xiàng)威, 徐燕, 等. 茶樹揮發(fā)性萜類物質(zhì)及其糖苷化合物生物合成的研究進(jìn)展[J]. 茶葉科學(xué), 2012, 32(1): 1-8. He Z R, Xiang W, Xu Y, et al. Progress in the research of biosynthesis of volatile terpenoids and their glycosides in tea plant [J]. Journal of Tea Science, 2012, 32(1): 1-8.

[8] 王讓劍, 楊軍, 孔祥瑞. 茶樹揮發(fā)性萜類物質(zhì)研究進(jìn)展[J]. 茶葉學(xué)報(bào), 2018, 59(3): 149-154. Wang R J, Yang J, Kong X R. Research advances in studies on volatile terpenes in tea plants () [J]. Acta Tea Sinica, 2018, 59(3): 149-154.

[9] Iijima Y, Gang D R, Fridman E. Characterization of geraniol synthase from the peltate glands of sweet basil [J]. Plant Physiology, 2004, 134(1): 370-379.

[10] Yang T, Li J, Wang H X, et al. A geraniol-synthase gene from[J]. Phytochemistry, 2005, 66(3): 285-293.

[11] Ito M, Honda G. Geraniol synthases from perilla and their taxonomical significance [J]. Phytochemistry, 2007, 68(4): 446-453.

[12] Kumar K, Kumar S R, Dwivedi V, et al. Precursor feeding studies and molecular characterization ofestablish the limiting role of geraniol in monoterpene indole alkaloid biosynthesis inleaves [J]. Plant Science, 2015, 239: 56-66.

[13] Degenhardt J, Kllner T G, Gershenzon J. Monoterpene and sesquiterpene synthases and the origin of terpene skeletal diversity in plants [J]. Phytochemistry, 2009, 70(15/16): 1621-1637.

[14] Magnard J L, Roccia A, Caissard J C, et al. Biosynthesis of monoterpene scent compounds in roses [J]. Science, 2015, 349(6243): 81-83.

[15] Zhou H, Wang S, Xie H F, et al. Cytosolicis involved in geranyl-primeveroside production in tea [J]. Frontiers in Plant Science, 2022, 13: 833682. doi: 10.3389/fpls.2022.833682.

[16] 周漢琛, 楊霽虹, 徐玉婕, 等. 香葉醇生物合成相關(guān)基因的進(jìn)化分析[J]. 茶葉科學(xué), 2022, 42(5): 638-648. Zhou H C, Yang J H, Xu Y J, et al. Phylogenetic analysis ofgene involved in geraniol biosynthesis [J]. Journal of Tea Science, 2022, 42(5): 638-648.

[17] Qiao D H, Tang M S, Jin L, et al. A monoterpene synthase gene cluster of tea plant () potentially involved in constitutive and herbivore-induced terpene formation [J]. Plant Physiology Biochemistry, 2022, 184: 1-13.

[18] Gohain B, Bandyopadhyay T, Borchetia S, et al. Identification and validation of stable reference genes inspecies [J]. E3 Journal of Biotechnology and Pharmaceutical Research, 2011, 2(1): 9-18.

[19] Wang X C, Hao X Y, Ma C L, et al. Identification of differential gene expression profiles between winter dormant and sprouting axillary buds in tea plant () by suppression subtractive hybridization [J]. Tree Genet & Genomes, 2014, 10: 1149-1159.

[20] 薛迎斌, 宋佳, 李梟藝, 等. 大豆基因克隆、亞細(xì)胞定位及功能分析[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2023, 44(3): 420-429. Xue Y B, Song J, Li X Y, et al. Cloning, subcellular localization and functional analysis ofin soybean [J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(3): 420-429.

[21] 楊鵬芳, 段國琴, 胡曉煒, 等. 高等植物啟動子研究概述[J]. 分子植物育種, 2018, 16(5): 1482-1493. Yang P F, Duan G Q, Hu X W, et al. Overview of higher plant promoters research [J]. Molecular Plant Breeding, 2018, 16(5): 1482-1493.

[22] 李明月, 李丹, 同拉嘎, 等. 不同類型水稻品種胚乳基因表達(dá)特性及啟動子序列比較分析[J]. 分子植物育種, 2017, 15(11): 4325-4335. Li M Y, Li D, Tong L G, et al. Expression characteristics and promoter sequences comparison analysis ofgene in endosperms of different rice varieties [J]. Molecular Plant Breeding, 2017, 15(11): 4325-4335.

[23] Zhou Y, Deng R F, Xu X L, et al. Enzyme catalytic efficiencies and relative gene expression levels of ()-linalool synthase and ()-linalool synthase determine the proportion of linalool enantiomers invar.[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68(37): 10109-10117.

[24] Zeng L T, Xiao Y Y, Zhou X C, et al. Uncovering reasons for differential accumulation of linalool in tea cultivars with different leaf area [J]. Food Chemistry, 2021, 345(9): 128752. doi: 10.1016/j.foodchem.2020.128752.

Catalytic Function, Promoter Structure and Functional Analysis ofin Different Tea Cultivars

YANG Jihong, ZHOU Hanchen*, XU Yujie

Tea Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Huangshan 245000, China

Geraniol is an important monoterpenoid in tea plants, and its accumulation varies greatly among different tea cultivars. The recent study shows thatis responsible for the production of geraniol and its glycosides in tea plants. In order to explore the differences in the catalytic function and regulation ofin different tea cultivars, this study analyzed the differences in the accumulation of geraniol and expression patterns of, and analyzed the differences in the catalytic function, promoter structure and function ofin seven tea cultivars. The result shows thatexpression was positively correlated with geraniol content (=0.805). The content of geranyl in fresh leaves ofvar.(CSS) was significantly higher than that in.var.(CSA) cultivars.-mediated genetic transformation system shows thatof different tea cultivars could promote the biosynthesis of geraniol. Analysis of promoter activity shows thatpromoter had the weakest activity in ‘Yunkang 10’, and the structural analysis shows that the promoter ofin ‘Yunkang 10’ had an 185 base sequence insertion at the transcription start site –33, making the enhancing element CAAT-box located at –133 (CAAT-boxes in other cultivars were located at –47). The results of this study indicate thatin different tea cultivars could promote geraniol biosynthesis, but the genetic diversity of the promoter region results in differences in its expression level.

tea plant, geraniol,gene, function analysis, promoter analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2023)05-621-10

2023-08-03

2023-09-07

國家自然科學(xué)基金（32002096）、安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才計(jì)劃項(xiàng)目（QNYC-202119）

楊霽虹，女，研究實(shí)習(xí)員，主要從事茶樹生物化學(xué)及分子生物學(xué)方面研究。*通信作者：tuesday1011@163.com