曾鴻哲，彭麗媛，萬麗瑋，劉昌偉，方雯雯，王闊飛，張欣儀，文帥，黃建安，劉仲華

基于肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究發(fā)花紅茶降血糖作用的潛在機(jī)制

曾鴻哲，彭麗媛，萬麗瑋，劉昌偉，方雯雯，王闊飛，張欣儀，文帥，黃建安*，劉仲華*

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物基因資源評價(jià)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128

EGCG作為茶葉中保護(hù)血糖穩(wěn)態(tài)的主要活性成分，發(fā)花紅茶中的EGCG等低分子量多酚含量極低，并且少見發(fā)花紅茶的降血糖作用研究。為探究發(fā)花紅茶的降血糖作用及潛在機(jī)制，采用自發(fā)性高血糖GK大鼠，給予280?mg·kg-1發(fā)花紅茶提取物（相當(dāng)于人體每日飲用9?g發(fā)花紅茶）灌胃干預(yù)，檢測其對高血糖大鼠體重、血糖穩(wěn)態(tài)、血糖穩(wěn)態(tài)相關(guān)調(diào)控因子、糖尿病并發(fā)癥以及肝臟轉(zhuǎn)錄譜等的影響。結(jié)果表明，發(fā)花紅茶能夠明顯降低高血糖大鼠的空腹血糖值、隨機(jī)血糖值；改善高血糖大鼠糖代謝異?，F(xiàn)象，保護(hù)高血糖大鼠的血糖穩(wěn)態(tài)；減輕高血糖大鼠糖尿病并發(fā)癥損傷。此外，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，發(fā)花紅茶的降血糖作用可能與調(diào)控肝臟等基因的表達(dá)密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)花紅茶可作為一種潛在的降血糖功能飲品，為發(fā)花紅茶等發(fā)酵茶的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

紅茶；降血糖；糖尿病并發(fā)癥；轉(zhuǎn)錄組；GK大鼠

隨著生活水平不斷提高，人們的膳食模式也發(fā)生了變化，由傳統(tǒng)的高碳水化合物、低脂肪的膳食結(jié)構(gòu)逐步向低碳水化合物、高脂肪結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變；同時(shí)環(huán)境改變、工作壓力增加及運(yùn)動(dòng)量減少等因素會(huì)導(dǎo)致機(jī)體新陳代謝紊亂、大量代謝廢物堆積，影響人體的正常穩(wěn)態(tài)[1]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟預(yù)測，到2045年，全球糖尿病患者將增加到7億[2]。糖尿病是一種以長期高血糖為主要特征的慢性內(nèi)分泌代謝性疾病，表現(xiàn)為胰島素含量絕對不足、相對不足或胰島素生物作用缺陷，從而導(dǎo)致高血糖癥狀[3]。當(dāng)機(jī)體長期處于高血糖狀態(tài)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致腎臟、心臟、血管等多種器官嚴(yán)重的損傷，以及一系列的糖尿病并發(fā)癥[4]。因此，維持血糖穩(wěn)態(tài)是管理糖尿病患者病情的關(guān)鍵。目前，針對糖尿病患者缺乏有效的根治方法，而臨床實(shí)踐表明，長期服用降糖藥會(huì)導(dǎo)致不利的毒副作用，因此使用天然產(chǎn)物進(jìn)行飲食干預(yù)輔助降血糖，從而減少藥物的攝入，對糖尿病患者病情的控制以及提高糖尿病患者的生活質(zhì)量具有積極效應(yīng)[5]。

茶是世界三大無酒精飲料之一，具有減肥、降血糖等多種健康功能[6]。綠茶中的多酚類物質(zhì)，尤其是表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG），已被廣泛用于糖尿病的替代療法[7]。發(fā)花紅茶是以紅毛茶為原料，通過控制一定的溫濕度，促進(jìn)冠突散囊菌的生長，冠突散囊菌的生長會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)多酚類化合物氧化及淀粉轉(zhuǎn)化等。從理論上分析，發(fā)花紅茶中的EGCG等低分子量多酚含量較低[8-10]，且目前發(fā)花紅茶的降血糖研究較少，消費(fèi)者無法從現(xiàn)有資料了解發(fā)花紅茶的降血糖作用效果及其機(jī)制。GK大鼠（Goto-Kakizaki大鼠）屬于非肥胖、自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型，是目前使用最廣泛的自發(fā)性高血糖大鼠模型，主要表現(xiàn)為高隨機(jī)血糖、高空腹血糖，且不伴隨肥胖[11]。因此，本研究通過采用自發(fā)性高血糖GK大鼠模型，探究發(fā)花紅茶能否通過調(diào)節(jié)肝臟轉(zhuǎn)錄譜維護(hù)高血糖大鼠的血糖穩(wěn)態(tài)，以期為發(fā)花紅茶等發(fā)酵茶的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)花紅茶由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)系提供，每克發(fā)花紅茶冠突散囊菌含量約為5.17×107個(gè)。血糖試紙、血糖儀購于羅氏公司（中國上海），總膽固醇（Total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、糖化血清蛋白、-葡萄糖苷酶、總蛋白定量測定試劑盒等試劑盒購于南京建成生物工程研究所，胰島素、胰高血糖素、糖化血紅蛋白、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）等試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司。通用型RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（用于qPCR）以及預(yù)混型qPCR試劑盒購于湖南艾科瑞生物工程有限公司，用于qPCR試驗(yàn)的引物購于擎科生物科技股份有限公司。

1.2 發(fā)花紅茶提取物制備及劑量選擇

發(fā)花紅茶提取物制備參照Zhu等[12]方法，按茶水比（∶，g·mL-1）1∶20的比例90?℃恒溫浸提2?h，提取發(fā)花紅茶茶湯，過濾收集上清液后通過真空冷凍干燥成粉末，獲得發(fā)花紅茶提取物，用于后續(xù)試驗(yàn)。按照成人（60?kg）每日飲用9?g發(fā)花紅茶進(jìn)行換算，根據(jù)體表面積歸一化方法推算[13]，相對于大鼠發(fā)花紅茶提取物劑量約為280?mg·kg-1（浸提率以30%計(jì)算）。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

從江蘇常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司采購SPF級9～11周齡的雄性GK大鼠16只以及7～8周齡健康Wistar大鼠8只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（蘇）2021-0013。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號(hào)：倫審科2021第（2137）號(hào)]，動(dòng)物房溫度24～26?℃，光照黑暗時(shí)間為12?h/12?h循環(huán)，自由飲水進(jìn)食。雄性GK大鼠及Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為正常對照組（Normal，Wistar大鼠）、高血糖組（Model，GK大鼠）和發(fā)花紅茶組（FFBT，GK大鼠）。大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中自由進(jìn)食與飲水，Wistar大鼠進(jìn)食實(shí)驗(yàn)鼠維持飼料，GK大鼠進(jìn)食60%高脂飼料，飼養(yǎng)籠的墊料每隔24?h更換1次以保持籠內(nèi)整潔衛(wèi)生。發(fā)花紅茶連續(xù)干預(yù)4周，每天灌胃1次發(fā)花紅茶水提物。實(shí)驗(yàn)開始前以及結(jié)束前通過羅氏血糖儀尾尖取血測定隨機(jī)血糖值、空腹血糖值以及糖耐量試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠禁食12?h后腹腔注射戊巴比妥鈉（30?mg·kg-1）。采集血液樣本、肝組織、十二指腸樣本，并立即儲(chǔ)存在–80?℃，以供進(jìn)一步研究。

1.4 發(fā)花紅茶的化學(xué)成分檢測

根據(jù)GB/T 8313—2018測定茶多酚含量；根據(jù)GB/T 8314—2013測定游離氨基酸含量；使用蒽酮比色法測定可溶性糖含量；使用系統(tǒng)分析法檢測茶黃素、茶紅素、茶褐素含量；參照Zhou等[14]的HPLC方法測定EGGC、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）、兒茶素（DL-catechin，DL-C）、沒食子酸和3種生物堿（咖啡堿、可可堿和茶堿）的含量。

1.5 糖耐量試驗(yàn)及生化指標(biāo)檢測

空腹12?h后剪尾取血，通過羅氏血糖儀測定空腹血糖值。在不禁食情況下剪尾取血，通過羅氏血糖儀測定隨機(jī)血糖值?？崭?2?h后按2?g·kg-1的劑量灌胃無水葡萄糖，分別于灌胃后0、30、60、90、120?min時(shí)尾尖取血測定大鼠血糖值，記錄血糖數(shù)值和檢測時(shí)間，并計(jì)算曲線下面積（Area under curve，AUC）。大鼠主動(dòng)脈取血后，血液室溫靜止2?h，使用冷凍離心機(jī)（Eppendorf AG 22331 Hamburg）4?℃、3?500?r·min-1離心10?min，收集血清，置于–80?℃冰箱保存。準(zhǔn)確稱取組織質(zhì)量，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入生理鹽水，低溫條件下機(jī)械勻漿，4?℃、2?500?r·min-1離心10?min，取上清液再用生理鹽水按1∶9稀釋成1%組織勻漿。TC、LDL-C、MDA、GSH-Px、ALT、AST、LPS、糖化血清蛋白、-葡萄糖苷酶、胰島素、胰高血糖素、糖化血紅蛋白等指標(biāo)嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書檢測。

1.6 臟器組織切片觀察

大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（30?mg·kg-1）麻醉處死后，將肝組織、十二指腸置于4%多聚甲醛溶液中固定，在經(jīng)過脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-eosin staining，H&E染色）后，使用顯微鏡進(jìn)行臟器組織切片觀察。

1.7 大鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

收集大鼠肝臟組織，每組設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，于液氮中冷凍，委托華大基因公司進(jìn)行RNA提取和RNA-Seq測序，并使用Dr.Tom多組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)進(jìn)行分析（biosys.bgi.com）。使用TRIzol法提取肝臟組織的總RNA，將測序得到的raw data使用華大自主研發(fā)的過濾軟件SOAPnuke（v1.5.6）（github.com/BGI-flexlab/ SOAPnuke）進(jìn)行過濾，得到clean data。后續(xù)使用Dr.Tom多組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、繪圖及挖掘。使用HISAT2（v2.1.0）（www.ccb.jhu.edu/software/hisat/index.shtml）軟件將clean data比對到大鼠的參考基因組上（，GCF_000001895.5_Rnor_6.0）。使用DESeq2 v1.4.5（www.bioconductor.org/ packages/release/bioc/html/DESeq2.html）進(jìn)行差異基因檢測，條件為Q值（Adjustedvalue）≤0.05且|log2FC|≥0.585，并對差異基因進(jìn)行KEGG（www.kegg.jp）富集分析。

表1 qPCR相關(guān)引物序列

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)分析不同組間的數(shù)據(jù)差異，<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（*，<0.05）。使用GraphPad Prism 9.3作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)花紅茶主要成分分析

發(fā)花紅茶的主要成分含量如表2所示，圖1為發(fā)花紅茶代表性HPLC圖譜。由表2和圖1可知，發(fā)花紅茶中的EGCG等低分子量多酚含量極低（<1%）。此外，本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)花紅茶中的茶褐素含量較高（14.937%）。

2.2 糖脂代謝穩(wěn)態(tài)分析

由圖2A可知，正常對照組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中，體重明顯持續(xù)增長，而高血糖大鼠體重增長緩慢，發(fā)花紅茶干預(yù)對高血糖大鼠體重?zé)o明顯影響。血清中的TC、LDL-C水平升高常見于糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病[15]。由圖2B可知，與正常對照組相比，高血糖組血清中的TC水平顯著增加（<0.05），而發(fā)花紅茶干預(yù)顯著降低了高血糖大鼠血清中的TC水平（<0.05），并將其降至正常對照組水平。由圖2C可知，與正常對照組相比，高血糖組血清中的LDL-C水平顯著增加（<0.05），而發(fā)花紅茶干預(yù)顯著降低了高血糖大鼠血清中的LDL-C水平（<0.05），并將其降至正常對照組水平。這些結(jié)果表明，發(fā)花紅茶干預(yù)能夠顯著改善高血糖大鼠的脂代謝紊亂，具有潛在降低心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的的作用。

隨機(jī)血糖值、空腹血糖值是直接反映機(jī)體真實(shí)血糖水平的重要指標(biāo)。由圖2D、圖2F可知，發(fā)花紅茶干預(yù)前，發(fā)花紅茶組和高血糖組大鼠的初始隨機(jī)血糖值、初始空腹血糖值無顯著差異。圖2E表明，在經(jīng)過4周的發(fā)花紅茶連續(xù)干預(yù)后，高血糖大鼠在早上、下午、晚上3個(gè)時(shí)間段的隨機(jī)血糖值均出現(xiàn)了顯著降低，降糖效果依次為33%、34%、25%，但未恢復(fù)到正常對照組水平。由圖2G可知，發(fā)花紅茶干預(yù)顯著降低了干預(yù)4周后的高血糖大鼠空腹血糖值（<0.05），降糖效果為36%，高血糖大鼠的空腹血糖值降至正常對照組水平。

糖化血紅蛋白是紅細(xì)胞中的血紅蛋白與血清中的葡萄糖通過非酶促反應(yīng)相結(jié)合的產(chǎn)物，該反應(yīng)具有持續(xù)、緩慢、不可逆的特點(diǎn)，糖化血紅蛋白濃度可有效反映過去8～12周平均血糖水平[16]。糖化血清蛋白與糖化血紅蛋白相似，能夠反映過去2～3周平均血糖水平。由圖2H可知，發(fā)花紅茶干預(yù)顯著降低了高血糖大鼠的糖化血紅蛋白水平（<0.05），降糖效果為58%，并且將高血糖大鼠的糖化血紅蛋白水平降至正常對照組水平。圖2I表明，發(fā)花紅茶干預(yù)顯著降低了高血糖大鼠的糖化血清蛋白水平（<0.05），降糖效果為42%。圖2J～圖2M表明，發(fā)花紅茶干預(yù)前，發(fā)花紅茶組和高血糖組的糖耐量曲線以及糖耐量曲線下面積無明顯差別（圖2J和圖2K），而發(fā)花紅茶干預(yù)4周后明顯降低了各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值。以上結(jié)果表明，發(fā)花紅茶干預(yù)顯著降低了高血糖大鼠的血糖值，并維持其健康的血糖穩(wěn)態(tài)，提示發(fā)花紅茶可作為一種潛在的降血糖功能飲品。

表2 發(fā)花紅茶主要成分含量

圖1 發(fā)花紅茶代表性HPLC圖譜

注：A為體重曲線；B為血清中TC水平；C為血清中LDL-C水平；D為發(fā)花紅茶干預(yù)前的隨機(jī)血糖值；E為發(fā)花紅茶干預(yù)4周后的隨機(jī)血糖值；F為發(fā)花紅茶干預(yù)前的空腹血糖值；G為發(fā)花紅茶干預(yù)4周后的空腹血糖值；H為糖化血清紅蛋白水平；I為糖化血清蛋白水平；J為發(fā)花紅茶干預(yù)前的糖耐量曲線；K為發(fā)花紅茶干預(yù)前的糖耐量曲線下面積；L為發(fā)花紅茶干預(yù)4周后的糖耐量曲線；M為發(fā)花紅茶干預(yù)4周后的糖耐量曲線下面積。* P<0.05，下同

2.3 血糖穩(wěn)態(tài)相關(guān)調(diào)控因子及血清氧化應(yīng)激指標(biāo)分析

胰島素與胰高血糖素由胰島細(xì)胞分泌，是調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)的重要激素[17]。由圖3A和圖3B可知，發(fā)花紅茶干預(yù)顯著提高了高血糖大鼠血清中的胰島素、胰高血糖素水平，表明發(fā)花紅茶可能具有作為胰島素促泌劑以及胰高血糖素促泌劑的潛力。-葡萄糖苷酶的主要作用是水解碳水化合物中的-葡萄糖苷鍵，生成葡萄糖等單糖，供人體腸道直接吸收[18]，它能夠控制碳水化合物的消化和吸收速度，從而減少血糖的積累，對于糖尿病患者十分重要。由圖3C可知，發(fā)花紅茶干預(yù)對高血糖大鼠十二指腸中的-葡萄糖苷酶水平無明顯影響，表明發(fā)花紅茶的降血糖功能可能不是通過調(diào)控碳水化合物的消化吸收這一途徑實(shí)現(xiàn)的。

LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁最外層組成成分，血清中的LPS水平升高，通常預(yù)示著腸道菌群紊亂，腸道屏障損傷[19]。由圖3D可知，與正常對照組相比，高血糖組血清中的LPS水平顯著升高（<0.05），而發(fā)花紅茶干預(yù)4周顯著降低了高血糖大鼠血清中的LPS水平（<0.05），表明發(fā)花紅茶具有潛在的修復(fù)腸道屏障損傷的作用。MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，因此可通過測定血液中的MDA水平了解全身細(xì)胞膜系統(tǒng)受損程度，進(jìn)而推測機(jī)體全身性的氧化應(yīng)激損傷情況[20]。由圖3E可知，與正常對照組相比，高血糖組血清中的MDA水平顯著升高（<0.05），而發(fā)花紅茶干預(yù)4周顯著降低了高血糖大鼠血清中的MDA水平（<0.05）。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，糖尿病模型動(dòng)物血清中的GSH-Px水平常代償性升高[21]。由圖3F可知，與正常對照組相比，高血糖組血清中的GSH-Px水平顯著增加（<0.05），而發(fā)花紅茶干預(yù)4周顯著降低了高血糖大鼠血清中的GSH-Px水平（<0.05），并將其降至正常對照組水平。ALT主要位于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而AST主要位于肝細(xì)胞的線粒體中，如果出現(xiàn)肝細(xì)胞的損傷破壞等，肝細(xì)胞中的ALT和AST會(huì)進(jìn)入到血液，因此可將血液中ALT和AST水平作為判斷肝細(xì)胞有無損傷的標(biāo)準(zhǔn)[22]。由圖3G、圖3H可知，與正常對照組相比，高血糖組血清中的ALT和AST水平顯著增加（<0.05），而發(fā)花紅茶干預(yù)顯著降低了高血糖大鼠血清中的ALT和AST水平（<0.05），達(dá)正常對照組水平。以上結(jié)果表明，發(fā)花紅茶干預(yù)能夠顯著改善高血糖大鼠全身性的氧化應(yīng)激損傷，特別是改善高血糖導(dǎo)致的肝損傷，因而具有潛在降低糖尿病并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的作用。

2.4 十二指腸、肝臟形態(tài)分析

十二指腸是小腸的第一段，上端連接胃，是葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所，而十二指腸絨毛長度的增加與營養(yǎng)物質(zhì)吸收效率增加密切相關(guān)[23]。由圖4A可知，與正常對照組相比，高血糖組大鼠的十二指腸絨毛長度明顯增加，而隱窩深度和管壁厚度無明顯差別。與高血糖組相比，發(fā)花紅茶干預(yù)4周后明顯縮短了高血糖大鼠十二指腸的絨毛長度，而對隱窩深度和管壁厚度無明顯影響。由圖4B可知，正常對照組大鼠肝細(xì)胞排列整齊緊密，細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核染色均勻。而高血糖組大鼠肝細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞質(zhì)疏松，呈空泡狀。與高血糖組相比，發(fā)花紅茶干預(yù)后，肝細(xì)胞水腫變性以及細(xì)胞質(zhì)疏松現(xiàn)象得到明顯緩解。

2.5 肝臟轉(zhuǎn)錄譜分析

肝臟是機(jī)體糖代謝的中心[24]。肝臟RNA-Sep分析共鑒定到17?282個(gè)基因，圖5A表明高血糖組轉(zhuǎn)錄水平和發(fā)花紅茶組轉(zhuǎn)錄水平有明顯差別。以Q值（Adjustedvalue）≤0.05且|log2FC|≥0.585為閾值，在發(fā)花紅茶組和高血糖組間共篩選到差異基因565個(gè)，其中上調(diào)的差異基因242個(gè)，下調(diào)的差異基因323個(gè)，差異基因散點(diǎn)圖如圖5B所示，差異基因表達(dá)量熱圖如圖5C所示。將差異基因中的上調(diào)基因和下調(diào)基因分別進(jìn)行KEGG富集分析，Q值≤0.05為顯著富集。如圖5D和圖5E所示，與高血糖組相比，發(fā)花紅茶組中的上調(diào)基因主要富集在類固醇激素生物合成、化學(xué)致癌、DNA復(fù)制、視黃醇代謝、維生素B6代謝、谷胱甘肽代謝、晝夜節(jié)律信號(hào)通路；發(fā)花紅茶組中的下調(diào)基因主要富集在PPAR信號(hào)通路，糖酵解/糖異生，碳代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，丙酮酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，氨基酸生物合成，癌癥中心碳代謝。其中19個(gè)基因與PPAR信號(hào)通路、糖酵解/糖異生、碳代謝密切相關(guān)，可能與發(fā)花紅茶發(fā)揮降血糖活性密切相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這19個(gè)基因除了與PPAR信號(hào)通路，糖酵解/糖異生，碳代謝相關(guān)，還與2型糖尿病密切相關(guān)（圖5F）。其中，19個(gè)基因中的、及直接與2型糖尿病密切相關(guān)，這3個(gè)基因的表達(dá)量熱圖如圖5G所示。qPCR結(jié)果表明，發(fā)花紅茶干預(yù)顯著抑制了高血糖大鼠肝臟的、、基因的表達(dá)，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果吻合（圖5H）。

注：A，血清中胰島素水平；B，血清中胰高血糖素水平；C，十二指腸中的α-葡萄糖苷酶水平；D，血清中LPS水平；E，血清中MDA水平；F，血清中GSH-Px水平；G，血清中ALT水平；H，血清中AST水平

注：A為十二指腸H&E染色結(jié)果（50×）；B為肝臟H&E染色結(jié)果（400×）

注：A為大鼠肝臟組織轉(zhuǎn)錄譜的主成分分析；B為差異基因散點(diǎn)圖；C為差異基因表達(dá)量熱圖；D為差異上調(diào)基因的KEGG富集分析；E為差異下調(diào)基因的KEGG富集分析；F為與關(guān)注通路密切相關(guān)的19個(gè)基因的KEGG通路分析，正方形表示KEGG通路，圓圈代表基因；G為與2型糖尿病密切相關(guān)的3個(gè)基因的表達(dá)量熱圖；H為qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果

3 討論

2型糖尿病的病因復(fù)雜，目前認(rèn)為主要與遺傳、肥胖、年齡及個(gè)人的生活方式等因素密切相關(guān)[25]。鑒于2型糖尿病病因的復(fù)雜性，選擇模擬人體2型糖尿病的模型動(dòng)物尤為重要，這不僅有利于清晰了解2型糖尿病的誘因，更有利于潛在的降血糖活性成分從動(dòng)物模型到人體臨床的轉(zhuǎn)化效率。本研究選擇的高血糖動(dòng)物模型為GK大鼠，GK大鼠屬于非肥胖、自發(fā)性2型糖尿病大鼠，主要表現(xiàn)為高空腹血糖，高隨機(jī)血糖，且不伴隨肥胖，表現(xiàn)與人類糖尿病相似的代謝、內(nèi)分泌和血管疾病[11]。

血糖控制是糖尿病管理中的重要組成部分，本研究采用280?mg·kg-1發(fā)花紅茶提取物干預(yù)高血糖大鼠4周后，反映真實(shí)血糖水平指標(biāo)（隨機(jī)血糖值、空腹血糖值）、反映平均血糖水平指標(biāo)（糖化血清蛋白水平、糖化血紅蛋白水平）、糖代謝異?，F(xiàn)象（糖耐量試驗(yàn)）等均得到明顯改善，表明發(fā)花紅茶干預(yù)能夠維持高血糖大鼠的血糖穩(wěn)態(tài)，發(fā)花紅茶可作為一種潛在的降血糖功能飲品。雖然茶葉中EGCG的降血糖功能已得到公認(rèn)[7]，但考慮到發(fā)花紅茶中EGCG等低分子量多酚含量低（<1%），因而推測發(fā)花紅茶中存在其他發(fā)揮降血糖活性的功能成分。在發(fā)花過程中，冠突散囊菌分泌出的胞外酶促進(jìn)了發(fā)花茶樣獨(dú)特色香味的形成，使EGCG等多酚類物質(zhì)發(fā)生進(jìn)一步氧化，有利于茶褐素等大分子物質(zhì)的積累。本研究表明，發(fā)花紅茶中含有高含量的茶褐素（14.94%），而茶褐素在近些年被發(fā)現(xiàn)具有降脂減肥[26]、降血糖[27]、緩解腸道炎癥[28]等功能，因而推測發(fā)花紅茶的降血糖功能可能與高含量的茶褐素密切相關(guān)。

胰島素等降糖藥能夠促進(jìn)血液中過多的葡萄糖進(jìn)入組織，并以脂肪的形式儲(chǔ)存起來，從而發(fā)揮降血糖功能[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)花紅茶干預(yù)顯著降低了高血糖大鼠血清中TC和LDL-C水平，增加了血清中的胰島素含量，但并未顯著影響高血糖大鼠的體重，表明發(fā)花紅茶的降血糖功能可能不是通過促進(jìn)血液中過多的葡萄糖轉(zhuǎn)化為脂肪這一途徑實(shí)現(xiàn)的。減緩葡萄糖在十二指腸中的吸收速度，是緩解餐后高血糖的重要策略。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然發(fā)花紅茶干預(yù)對高血糖大鼠十二指腸中的-葡萄糖苷酶水平無明顯影響，但明顯縮短了十二指腸的絨毛長度，表明發(fā)花紅茶干預(yù)可能通過減緩高血糖大鼠十二指腸吸收葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)的速度，從而保護(hù)血糖穩(wěn)態(tài)。當(dāng)機(jī)體長期處于高血糖狀態(tài)，會(huì)造成機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致肝臟等多種器官損傷，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)花紅茶干預(yù)明顯緩解了高血糖大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕了機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷，尤其是緩解了肝臟損傷，具有潛在的降低糖尿病并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的作用。

過氧化物酶體增殖因子活化受體（Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）屬于核激素受體超家族，PPARs的激活被認(rèn)為與體內(nèi)多種代謝過程密切相關(guān)，研制開發(fā)以PPARs為靶點(diǎn)的新型抗糖尿病藥物已成為藥物研究的一大熱點(diǎn)[30]。糖酵解/糖異生過程屬于碳代謝，是葡萄糖代謝的重要途徑，因此，調(diào)節(jié)糖酵解/糖異生代謝過程對于控制糖尿病的發(fā)展和治療具有重要意義[31]。在本研究篩選到的565個(gè)差異基因中，19個(gè)差異基因與PPAR信號(hào)通路、糖酵解/糖異生、碳代謝密切相關(guān)，其中、及直接與2型糖尿病密切相關(guān)，因此，這3個(gè)基因（）被認(rèn)為是發(fā)花紅茶通過調(diào)控肝臟轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)揮降血糖活性的潛在靶點(diǎn)。未來仍需要通過siRNA干擾試驗(yàn)或者基因敲除試驗(yàn)深入研究驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組學(xué)的推測，找到更多證據(jù)揭示發(fā)花紅茶通過調(diào)控肝臟轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮降血糖功能的分子機(jī)制。

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Exploring the Potential Mechanism of Hypoglycemic Effect of Fungus Fermented Black Tea Based on Liver Transcriptomics

ZENG Hongzhe, PENG Liyuan, WAN Liwei, LIU Changwei, FANG Wenwen, WANG Kuofei, ZHANG Xinyi, WEN Shuai, HUANG Jian'an*, LIU Zhonghua*

Key Lab of Education Ministry of Hunan Agricultural University for Tea Science, National Research Center of Engineering and Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Co-Innovation Center of Education Ministry for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Key Laboratory for Evaluation and Utilization of Gene Resources of Horticultural Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs of China, Changsha 410128, China

EGCG is often regarded as the main active ingredient in tea to protect blood glucose homeostasis. The content of low molecular weight polyphenols such as EGCG in fungus fermented black tea (FFBT) is extremely low, and there are few studies on the hyperglycemic effect of FFBT. To explore the hypoglycemic effects and potential mechanisms of FFBT, GK rats with spontaneous hyperglycemic were given 280?mg·kg-1FFBT extract (equivalent to 9?g of FFBT for daily human consumption) by gavage intervention. The study assessed the effects of FFBT on body weight, glucose homeostasis, regulatory factors related to glucose homeostasis, diabetic complications and liver transcription profiles in hyperglycemic rats. The results indicated that FFBT could obviously reduce the fasting blood glucose level and random blood sugar level of hyperglycemic rats, improve the abnormal glucose metabolism in hyperglycemic rats, maintain glucose homeostasis and alleviate the damage caused by diabetic complications in hyperglycemic rats. In addition, transcriptome analysis revealed that the hypoglycemic properties of FFBT might be related to the regulation of gene expression in the liver, such as. This study found that FFBT may be a potential hypoglycemic functional beverage, providing a theoretical basis for the development and utilization of fermented tea such as FFBT.

black tea, hypoglycemic effect, diabetic complication, transcriptomics, GK rats

S571.1；R587.1

A

1000-369X(2023)05-645-12

2023-07-05

2023-08-07

國家現(xiàn)代茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CAS-19）、陳玖金花茶健康功效及作用機(jī)制研究（2022xczx-252）

曾鴻哲，男，博士研究生，主要從事茶葉功能成分利用與深加工方面研究。*通信作者：jian7513@sina.com；larkin-liu@163.com