廖陽(yáng)陽(yáng) 李思貝 張彩美 謝成婕

【摘 要】目的 研究濃縮生長(zhǎng)因子（CGF）在炎癥微環(huán)境下對(duì)人牙周膜細(xì)胞（hPDLCs）成骨抑制作用的影響。方法 分離、培養(yǎng)并鑒定hPDLCs，并采用脂多糖（LPS）制造細(xì)胞炎癥微環(huán)境，分別將全血（對(duì)照組）、Con組、LPS組和CGF組與hPDLCs共培養(yǎng)，使用1%、5%、10%的LPS、CGF分別對(duì)hPDLCs處理24、48、72 h，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，觀察不同TGFβ1和IGF-1濃度下各組CGF中含有存在成骨相關(guān)生長(zhǎng)因子水平、炎癥微環(huán)境下hPDLCs的各組ALP活性、qPCR檢測(cè)各組成骨相關(guān)生長(zhǎng)因表達(dá)量。結(jié)果 CGF+DMEM培養(yǎng)基中TGFβ1、IGF-1濃度均顯著高于DMEM培養(yǎng)基、CGF析出液（P<0.01）；hPDLCs細(xì)胞較為均一，無(wú)明顯雜質(zhì)細(xì)胞，形態(tài)穩(wěn)定，生長(zhǎng)旺盛，進(jìn)一步對(duì)hPDLCs進(jìn)行LPS及CGF干預(yù)后，與Con組比較，ALP在LPS組明顯下降，而經(jīng)過(guò)CGF干預(yù)后ALP的濃度有所回升，甚至比Con組更高；CGF組干預(yù)后ALP活性顯著高于對(duì)照組、LPS組，且LPS組低于對(duì)照組、炎癥組（P<0.01）；炎癥微環(huán)境下，CGF組hPDLCs成骨標(biāo)志物ALP、COL1及OCN的表達(dá)量顯著高于Con組、LPS組（P<0.01）。結(jié)論 CGF在炎癥微環(huán)境下對(duì)改善人牙周膜細(xì)胞成骨抑制作用具有積極的影響，可提高成骨相關(guān)因子（ALP、COL1、OCN）水平，促進(jìn)成骨分化的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量，從而有效修復(fù)人牙周膜細(xì)胞在炎癥微環(huán)境下的成骨抑制作用。

【關(guān)鍵詞】CGF；炎癥微環(huán)境；人牙周膜細(xì)胞；成骨抑制

中圖分類(lèi)號(hào)：R781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1004-4949（2023）18-0065-05

基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金-面上項(xiàng)目（編號(hào)：B2022024）

Effect of CGF on Osteogenic Inhibition of Human Periodontal Ligament Cells in Inflammatory Microenvironment

LIAO Yang-yang1， LI Si-bei2， ZHANG Cai-mei3， XIE Cheng-jie1

（1.Department of Periodontal Disease， Haizhu Square Campus， Stomatological Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510280， Guangdong， China； 2.The Third Department of Surgery， Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou 510095， Guangdong， China； 3.Department of Dentistry and Endodontics， Haizhu Square Campus， Stomatological Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510280， Guangdong， China）

【Abstract】Objective To investigate the effect of concentrated growth factor （CGF） on the osteogenic inhibition of human periodontal ligament cells （hPDLCs） in an inflammatory microenvironment. Methods hPDLCs were isolated， cultured and identified， and lipopolysaccharide （LPS） was used to create an inflammatory microenvironment. Whole blood （control group）， Con group， LPS group and CGF group were co-cultured with hPDLCs， and hPDLCs were treated with 1%， 5%， and 10% LPS and CGF for 24， 48， and 72 h， respectively. Osteogenic induction was performed to observe the levels of osteogenic-related growth factors in CGF of each group at different concentrations of TGFβ1 and IGF-1， the ALP activity of hPDLCs in each group under the inflammatory microenvironment， and the expression of bone-related growth factors in each group by qPCR. Results The concentrations of TGFβ1 and IGF-1 in CGF+DMEM medium were significantly higher than those in DMEM medium and CGF precipitation solution （P<0.01）. The hPDLCs cells were relatively uniform， with no obvious impurity cells， stable morphology and vigorous growth. After further LPS and CGF intervention on hPDLCs， compared with the Con group， ALP decreased significantly in the LPS group， while the concentration of ALP increased after CGF intervention， even higher than the Con group； the ALP activity of the CGF group was significantly higher than that of the control group and the LPS group， and that in the LPS group was lower than that in the control group and the inflammation group （P<0.01）. Under the inflammatory microenvironment， the expression levels of osteogenic markers ALP， COL1 and OCN in hPDLCs of CGF group were significantly higher than those of Con group and LPS group （P<0.01）. Conclusion CGF has a positive effect on improving the osteogenic inhibition of human periodontal ligament cells in the inflammatory microenvironment. Meanwhile， it can increase the levels of osteogenic related factors （ALP， COL1， OCN） and promote the expression of transcription factors related to osteogenic differentiation， so as to effectively repair the osteogenic inhibition of human periodontal ligament cells in the inflammatory microenvironment.

【Key words】CGF； Inflammatory micro-environment； Human periodontal ligament cells； Osteogenesis inhibition

牙周炎（periodontitis）是影響牙齒支持組織的慢性感染性疾病，可引起牙周附著喪失、牙齦退縮，嚴(yán)重者可導(dǎo)致牙齒松動(dòng)、脫落[1]。重度牙周炎患者往往伴有牙周骨內(nèi)缺損病變，是牙周疾病治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)。牙周治療的最終目標(biāo)是修復(fù)和重建已破壞的牙周組織，實(shí)現(xiàn)牙周組織再生。不同的骨移植材料被應(yīng)用于臨床研究中，包括牙周引導(dǎo)組織再生術(shù)、牙周骨移植術(shù)等。不同療法的治療效果存在一定差異，且目前多種治療方法均無(wú)法使缺損的牙周支持組織得到真正意義上的再生，治療目標(biāo)在于恢復(fù)牙周組織生理結(jié)構(gòu)和功能[2]。研究顯示[3，4]，人牙周膜細(xì)胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）作為牙周組織的主要功能成分，在一定條件下具有向成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞等方向分化的潛能，其潛在的成骨分化能力，為臨床治療牙周骨缺損提供了新的方向。但是牙周炎的炎癥環(huán)境對(duì)hPDLCs成骨分化具有一定影響，可能會(huì)抑制牙周膜細(xì)胞成骨作用。而濃縮生長(zhǎng)因子（concentrated growth factors，CGF）作為新一代血小板制品，其主要成分包括各種生長(zhǎng)因子，可調(diào)控細(xì)胞的聚集、增殖和分化過(guò)程，促進(jìn)牙周組織再生和修復(fù)的進(jìn)程[5]?；诖耍谘乐苎籽仔原h(huán)境中，CGF可能一定程度促進(jìn)hPDLCs增殖和成骨分化，但是具體的作用機(jī)制尚未完全明確。本研究通過(guò)建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)一步探究CGF在炎癥微環(huán)境下對(duì)人牙周膜細(xì)胞成骨抑制作用的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)），TGFβ1-ELISA Kit（Boster，中國(guó)武漢），一次性真空采血管、細(xì)胞培養(yǎng)皿（Corning公司，美國(guó)），CGF離心機(jī)（Medifuge公司，意大利），大腸桿菌脂多糖LPS（SIGMA公司，美國(guó)），BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)上海），堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)上海），總RNA提取試劑盒（Takara，日本），反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （Thermo公司，美國(guó)），qPCR反應(yīng)體系：Maxima TM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix （2X）（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）。

1.2 hPDLCs的傳代與培養(yǎng) 收集18～25歲志愿者拔除的健康正畸前磨牙，反復(fù)沖洗后刮取牙根中1/3部位的牙周膜組織，采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，直至細(xì)胞從組織塊周?chē)莱霾㈤L(zhǎng)滿(mǎn)約培養(yǎng)皿底80%左右區(qū)域。利用0.25%胰酶消化，傳代，將此代細(xì)胞記為第1代細(xì)胞（P1）[6]。P1代細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)皿底約90%左右，再次使用0.25%胰酶消化、傳代，方法同前，使用2-4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)由南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2021-23），所有志愿者均已簽署知情同意書(shū)。

1.3 血小板濃縮制品的制備與血小板計(jì)數(shù)

1.3.1 CGF制備 各抽取10名18～25歲健康志愿者肘靜脈全血5 ml（不加入抗凝劑）。按照Medifuge公司離心機(jī)CGF制備程序離心，分為3層：上層為貧血小板血漿層，下層為紅細(xì)胞層，中間即為CGF凝膠層（擠壓CGF凝膠得到CGF析出液，CGF liquid）。取CGF層置于含有5 ml DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，靜置5 min，然后放置在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，7 d后取出CGF浸出液，離心，過(guò)濾，-80 ℃保存，為CGF+DMEM培養(yǎng)基，用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3.2脂多糖（LPS）炎癥微環(huán)境制備 將第2-4代hPDLCs以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度鋪于6孔板。在細(xì)胞生長(zhǎng)至50%融合時(shí)進(jìn)行分組：①Con組：hPDLCs+DMEM；②LPS組：hPDLCs+ 10 μg/ml LPS+DMEM；③CGF組：hPDLCs+ 10 μg/ml LPS+10%CGF+DMEM。

1.4 檢測(cè)PRP、CGF對(duì)hPDLCs增殖能力的影響

1.4.1ELISA 采用酶標(biāo)儀分別對(duì)TGFβ1及IGF-1濃度進(jìn)行檢測(cè)。按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒說(shuō)明，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，其中空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品和樣品稀釋液100 μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μl。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)均使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照酶標(biāo)測(cè)試程序反應(yīng)后，最終用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各孔待測(cè)液的OD值[7]。

1.4.2堿性磷酸酶（ALP）染色 選取生長(zhǎng)良好的第2-4代hPDLCs以相同數(shù)量、相同條件接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)約50%時(shí)換為成骨礦化誘導(dǎo)液，按照分組分別培養(yǎng)7 d后，4%多聚甲醛固定3 min，PBS洗滌2～3次，每孔加入1 ml BCIP/NBT工作液，室溫避光放置15 min，PBS洗滌2～3次，觀察ALP染色情況。

1.4.3 ALP活性檢測(cè) 選取生長(zhǎng)良好的第2-4代hPDLCs以相同數(shù)量、相同條件接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)約50%時(shí)換為成骨礦化誘導(dǎo)液，按照分組分別培養(yǎng)7 d后，PBS清洗3次，配置ALP活性測(cè)定工作液，添加工作液至96孔板，37 ℃環(huán)境中孵育30 min，加入顯色液。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在405 nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)，記錄數(shù)據(jù)。

1.4.4 qPCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因mRNA表達(dá) 選取生長(zhǎng)良好的第2-4代hPDLCs細(xì)胞，分別標(biāo)記為上述分組。采用Trizol總RNA法提取各組細(xì)胞RNA，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA模板，用獲得的cDNA進(jìn)行qPCR[8]。檢測(cè)成骨相關(guān)基因：ALP，Ⅰ型膠原蛋白（Collagen-Ⅰ，COL1）和骨鈣素（OCN）。以GAPDH作為組內(nèi)對(duì)照，對(duì)各組成骨基因表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析，見(jiàn)表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（x-±s）表示，行t檢驗(yàn)；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2 結(jié)果

2.1 CGF中含有存在成骨相關(guān)生長(zhǎng)因子 CGF+DMEM培養(yǎng)基中TGFβ1、IGF-1濃度均顯著高于DMEM培養(yǎng)基、CGF析出液（P<0.01），見(jiàn)圖1。

2.2 CGF對(duì)炎癥微環(huán)境下hPDLCs成骨抑制的修復(fù) hPDLCs 細(xì)胞較為均一，無(wú)明顯雜質(zhì)細(xì)胞，形態(tài)穩(wěn)定，生長(zhǎng)旺盛（見(jiàn)圖2A、圖2B）。進(jìn)一步對(duì)hPDLCs進(jìn)行LPS及CGF干預(yù)后，與Con組比較，ALP在LPS組明顯下降，而經(jīng)過(guò)C G F干預(yù)后A L P的濃度有所回升，甚至比Con組更高（見(jiàn)圖2C～圖2H）。CGF組干預(yù)后A L P活性顯著高于對(duì)照組、L P S組，且LPS組低于對(duì)照組、炎癥組（P<0.01），見(jiàn)圖2I。

2.3 炎癥微環(huán)境下CGF對(duì)成骨的抑制 炎癥微環(huán)境下，CGF組hPDLCs成骨標(biāo)志物ALP、COL1及OCN的表達(dá)量顯著高于Con組、LPS組（P<0.01），見(jiàn)圖3。

3 討論

牙周炎患者的牙周局部微環(huán)境是高濃度炎癥微環(huán)境，會(huì)抑制牙周膜細(xì)胞的成骨分化，導(dǎo)致牙槽骨缺失，最終導(dǎo)致牙齒脫落[9]。CGF作為血小板濃縮制品，在血小板被激活后，可釋放多種生物活性物質(zhì)，包括多種生長(zhǎng)因子，如血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖和分化、血管生成，從而加速傷口愈合[10]。PRP具有促進(jìn)骨重建、減輕術(shù)后反應(yīng)、抗感染及炎癥調(diào)節(jié)等作用[11]。CGF作為第3代血小板濃縮制品，也具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、成骨分化和促進(jìn)血管生成等作用[12]。從理論基礎(chǔ)上分析，CGF在炎癥微環(huán)境下對(duì)人牙周膜細(xì)胞成骨抑制作用具有一定的修復(fù)作用，但是具體的作用還需要進(jìn)一步探究。

本研究結(jié)果顯示，采用使用10μg/ml LPS模擬牙周炎患者的高濃度炎癥微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)其對(duì)牙周膜細(xì)胞（PDLCs）的成骨能力有顯著抑制作用。原因在于牙周炎的炎癥環(huán)境中含有TNF-ɑ、IL-1、IL-6等炎癥因子，炎癥微環(huán)境會(huì)抑制PDLCs的成骨分化能力，并受到多種通路調(diào)控。同時(shí)，CGF+DMEM培養(yǎng)基中TGFβ1、IGF-1濃度均顯著高于DMEM培養(yǎng)基、CGF析出液（P<0.01），提示CGF干預(yù)可促進(jìn)TGFβ1、IGF-1濃度升高。由于CGF含有TGFβ、IGF-1等成分，是促進(jìn)成骨所需物質(zhì)，并且TGFβ/Smad通路是經(jīng)典的成骨通路。TGFβ1是TGFβ超家族成員之一，TGFβ超家族包括TGFβ蛋白、活化素、蛋白及其他相關(guān)蛋白，TGFβ蛋白結(jié)合受體（TGFβRⅠ和TGFβRⅡ）后通過(guò)smad蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)至目標(biāo)基因，促進(jìn)細(xì)胞成骨分化。而TGFβ1作為T(mén)GFβ/ smad信號(hào)通路的啟動(dòng)者，同時(shí)可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。而在PDLCs中TGFβ1同樣有成骨誘導(dǎo)能力。因此，TGFβ1在CGF對(duì)PDLCs誘導(dǎo)成骨中起著重要作用。CGF組干預(yù)后ALP活性顯著高于對(duì)照組、LPS組，且LPS組低于對(duì)照組、炎癥組（P<0.01），表明在炎癥環(huán)境下，PDLCs內(nèi)成骨相關(guān)基因的表達(dá)降低，從而導(dǎo)致其成骨能力減弱，CGF內(nèi)所含的促成骨相關(guān)生長(zhǎng)因子將發(fā)揮重要作用。因此，通過(guò)加入CGF，PDLCs炎癥狀態(tài)下的骨生成抑制作用被修復(fù)，甚至較對(duì)照組有所增加，說(shuō)明CGF具備挽救PDLCs因炎癥環(huán)境所致的成骨抑制。該結(jié)論與張志媛等[13]研究結(jié)果基本一致。此外，炎癥微環(huán)境下，CGF組hPDLCs成骨標(biāo)志物ALP，COL1及OCN的表達(dá)量顯著高于Con組、LPS組（P<0.01），提示炎癥微環(huán)境下，CGF的加入可使hPDLCs的成骨標(biāo)志物ALP，COL1及OCN表達(dá)水平提高，從而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化。因此，CGF可影響成骨相關(guān)基因表達(dá)，與細(xì)胞成骨分化關(guān)系密切。可見(jiàn)，CGF具有的成骨修復(fù)能力是其挽救PDLCs炎癥環(huán)境下成骨的重要基礎(chǔ)。

綜上所述，炎癥微環(huán)境下CGF可以促進(jìn)hPDLCs增殖，增強(qiáng)ALP，COL1及OCN的表達(dá)，達(dá)到修復(fù)hPDLCs成骨抑制的作用。CGF有望在牙周組織重建中發(fā)揮重要作用，但其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的臨床研究探究。CGF炎癥狀態(tài)下的成骨機(jī)制將是下一步研究的重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1] ？ebatariūnien？ A，Kriau？iūnait？ K，Prunskait？ J，et al.Extracellular Vesicles Suppress Basal and Lipopolysaccharide-Induced NFκB Activity in Human Periodontal Ligament Stem Cells[J].Stem Cells Dev，2019，28（15）：1037-1049.

[2] 廖海清，曹正國(guó).經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在牙周膜細(xì)胞成骨分化過(guò)程中的調(diào)控[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2018，32（3）： 224-227.

[3] Loo-Kirana R，Gilijamse M，Hogervorst J，et al.Although Anatomically Micrometers Apart：Human Periodontal Ligament Cells Are Slightly More Active in Bone Remodeling Than Alveolar Bone Derived Cells[J].Front Cell Dev Biol，2021，9：709408.

[4] Ni C，Zhou J，Kong N，et al.Gold nanoparticles modulate the crosstalk between macrophages and periodontal ligament cells for periodontitis treatment[J]. Biomaterials，2019，206：115-132.

[5] Yu M，Wang X，Liu Y，et al.Correction to：Cytokine release

kinetics of concentrated growth factors in different scaffolds[J].Clin Oral Investig，2019，23（4）：1999.

[6] 劉娟，陳斌，閆福華.富血小板血漿和濃縮生長(zhǎng)因子對(duì)人牙周膜細(xì)胞增殖和成骨分化影響的研究[J].國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2021，48（5）：520-527.

[7] Wu HH，Guo Y，Pu YF，et al.Adiponectin inhibits lipoplysaccharide-induced inflammation and promotes osteogenesis in hPDLCs[J].Biosci Rep，2021，41（3）：BSR20192668.

[8] Peng W，Zhang B，Sun Z，et al.Targeting the Nod-like receptor protein 3 Inflammasome with inhibitor MCC950 rescues lipopolysaccharide-induced inhibition of osteogenesis in Human periodontal ligament cells[J].Arch Oral Biol，2021，13（1）：105269.

[9] 陳蔚榕.液態(tài)濃縮生長(zhǎng)因子對(duì)人牙周膜干細(xì)胞成骨能力的影響[J].福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2020，6（1）：50-53.

[10] 陳靜濤，王燕，周志斐，等.力生長(zhǎng)因子對(duì)周期性牽張力誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞成骨分化及MMP-1、MMP-2表達(dá)的影響[J].上海口腔醫(yī)學(xué)，2019，15（2）：180-183.

[11] Cheng F，Yang MM，Yang RH.MiRNA-365a-3p promotes the progression of osteoporosis by inhibiting osteogenic differentiation via targeting RUNX2[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2019，23（18）：7766-7774.

[12] 賈婷婷.濃縮生長(zhǎng)因子對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖及成骨分化能力的影響[J].山東大學(xué)，2017，18（5）：265-268.

[13] 張志媛，趙世俊，盧文娟，等.濃縮生長(zhǎng)因子聯(lián)合骼瑞骨粉在上頜竇外提升同期種植術(shù)中應(yīng)用的臨床觀察[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2023，20（7）：90-93.

編輯 扶田