陳艷 丁旭 李朝陽 鄒明強(qiáng) 殷宏 齊小花 薛強(qiáng) 羅雁非 金涌*

（1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院& 國家藥監(jiān)局體外快速診斷試劑技術(shù)轉(zhuǎn)化與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100123；2.吉林國際旅行衛(wèi)生保健中心；3.長春海關(guān)；4.長春海關(guān)技術(shù)中心）

0 引言

新型冠狀病毒（Novel Coronavirus）感染的肺炎疫情暴發(fā)以來，核酸檢測作為確診方法，在患者臨床診斷和疑似患者排查中發(fā)揮了重要作用。 但是，核酸檢測存在較高的假陰性，且操作繁瑣、耗時(shí)較長、對場地設(shè)備和技術(shù)人員要求較高，而免疫學(xué)檢測因其快速可滿足現(xiàn)場檢測、 診斷較為準(zhǔn)確可輔助臨床確診，故得到更多重視[1]。 新型冠狀病毒抗體檢測可用于新冠病毒感染的輔助診斷， 但自新冠疫苗廣泛接種后，血清學(xué)抗體檢測作為新冠核酸確診的補(bǔ)充應(yīng)用受到了一定限制[2]。 為進(jìn)一步優(yōu)化新冠病毒檢測策略，2022 年3 月11 日，國務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制綜合組決定在核酸檢測基礎(chǔ)上，增加抗原檢測作為補(bǔ)充，已制定印發(fā)《新冠病毒抗原檢測應(yīng)用方案（試行）》。 作為核酸檢測的重要補(bǔ)充手段， 新冠抗原檢測可用于特定人群的篩查，有利于提高“早發(fā)現(xiàn)”能力，對于快速控制疫情傳播具有重大意義，但靈敏度較低。 因此，如何提供一種新冠病毒的檢測試劑， 克服上述技術(shù)缺陷，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

稀土熒光納米微球具有明顯的信號放大效應(yīng)，不同于量子點(diǎn)和熒光染料等其他熒光標(biāo)記探針，稀土熒光納米顆粒具有發(fā)射帶窄、Stokes 位移大、熒光壽命長等特點(diǎn)，可以大大消除背景干擾，非常適用于熒光免疫分析中生物分子的熒光標(biāo)記[3-4]。 本研究以稀土銪螯合物熒光納米微球標(biāo)記新冠病毒N 蛋白單克隆抗體，制備了具有高熒光強(qiáng)度、高穩(wěn)定性的熒光納米微球免疫探針， 建立的新冠病毒快速熒光檢測側(cè)流免疫層析技術(shù)，配套儀器使用，可實(shí)現(xiàn)定量分析和動(dòng)態(tài)監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

StedimUniSart CN140 硝酸纖維素膜（Sartorius公司）；GFCP20300 玻纖、CFSP223000 吸水紙（Millpore 公司）；PVC 底板（上海金標(biāo)生物科技有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，98%）、碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、羊抗鼠IgG（Sigma 公司）；Tween-20（北京化學(xué)試劑廠）；新冠N 蛋白、新冠N 蛋白抗體（東莞菲鵬生物股份有限公司）；熒光微球（0.2 μm，F(xiàn)CEU002，Bangs公司）。

1.1.2 主要儀器

Biodot XYZ 3050 噴膜儀、Biodot CM4000 切條機(jī)（Biodot 公司）；JEM-2100 透射電子顯微鏡（JEOL公司）；FIC-S1 熒光讀數(shù)儀（蘇州和邁精密儀器有限公司）；ABI-Q5 熒光定量PCR 儀（賽默飛公司）。

1.2 方法與原理

1.2.1 熒光納米微球免疫探針的制備

取0.05 M/pH 8.0 硼酸緩沖溶液400 μL，置于2 mL離心管中，加入100 μL 熒光微球，混勻；加入25 μL的EDC（10mg/mL）溶液，室溫振蕩活化15 min；20 000 r/min，10℃離心10 min，棄上清，用0.05 M/pH 8.0 硼酸緩沖液0.5mL 復(fù)溶；將溶液超聲分散（100W，5 min）后，加入新冠N 蛋白偶聯(lián)抗體，使終濃度為100 μg/mL，室溫震蕩反應(yīng)2 h；加入BSA 使終濃度為1%，室溫反應(yīng)2 h；20 000 r/min，10℃離心10 min，棄上清，用0.05 M/pH 8.0 硼酸緩沖液復(fù)溶，于4℃恒溫保存。

1.2.2 熒光免疫檢測試紙條制備

用0.01 M 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4） 稀釋新冠N蛋白抗體2 和羊抗鼠IgG 抗體， 用點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上， 形成間隔0.4 cm 的檢測線（T線）和質(zhì)控線（C 線），37℃烘干。 樣品墊用0.01 mol/L Tris 溶液 （含0.5% Tween-20，pH 8.0） 浸泡后于37℃烘干。將樣品墊、吸水墊分別粘貼在帶硝酸纖維素膜的PVC 背襯上，用切條機(jī)切成4 mm 寬的條狀，即制成試紙條，干燥保存?zhèn)溆谩?在使用時(shí)，對樣品進(jìn)行一定處理后再滴入樣品墊上即可（圖1A），樣品墊上可制作出專門的加樣孔。

圖1 新冠病毒抗原檢測熒光免疫試紙條檢測原理圖Fig.1 Detection of novel coronavirus by fluorescent nanomicrosphere immunochromatographyprinciple model

1.3 熒光免疫檢測試紙條檢測原理

采用雙抗體夾心法來檢測待測樣品中是否含有新冠狀病毒。檢測陽性樣品時(shí)，樣品中的新冠狀病毒與熒光免疫探針上所連接的新冠狀病毒抗體1 結(jié)合， 該復(fù)合物通過層析作用在硝酸纖維素膜內(nèi)部向前移動(dòng)， 經(jīng)過檢測區(qū)時(shí)與包被的新冠狀病毒抗體2結(jié)合， 形成熒光微球—新冠狀病毒抗體1—新冠狀病毒—新冠狀病毒抗體2 復(fù)合物（抗體1 和2 分別為針對N 蛋白不同表面決定簇的單克隆抗體），因此，T 線將出現(xiàn)條帶，結(jié)果為陽性（圖1B）；檢測陰性樣品時(shí)，樣本中不含新冠抗原，無法形成上述免疫復(fù)合物，則T 線不出現(xiàn)條帶，結(jié)果為陰性（圖1C）。通過熒光檢測儀測定T 線上的熒光強(qiáng)度，測定新冠病毒的含量。

1.4 臨床樣品檢測

取咽拭子采集的新型冠狀滅活病毒上清液，用樣品提取液分別進(jìn)行10 倍、100 倍、1 000 倍稀釋，用移液器準(zhǔn)確吸取80 μL 待檢樣本，垂直緩慢滴加于檢測卡加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí)，10 min 讀取結(jié)果。同時(shí)用熒光定量PCR 技術(shù)和膠體金試紙條進(jìn)行檢測，比較檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 熒光納米微球免疫探針的表征

稀土銪螯合物納米微球與新冠抗體通過碳二亞胺法共價(jià)偶聯(lián)，獲得熒光微球—抗體復(fù)合納米顆粒，用透射電子顯微鏡對復(fù)合納米顆粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，熒光納米微球表面光滑，內(nèi)部包被有熒光物質(zhì)（圖2A）；熒光納米微球—抗體復(fù)合物表面有黑色物質(zhì)附著，表明新冠抗體成功偶聯(lián)在熒光納米微球的表面（圖2B）。

圖2 透射電子顯微鏡表征熒光納米微球免疫探針Fig.2 Fluorescent nanosphere immune probes characterized by transmission electron microscope

2.2 靈敏度實(shí)驗(yàn)及熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取新冠病毒N 蛋白，用樣品提取液進(jìn)行稀釋，獲得濃度為0、0.001、0.01、0.1、1、10 ng/mL， 用熒光免疫探針最佳反應(yīng)濃度（0.01M PB（pH7.4）緩沖液稀釋200 倍）的試紙條進(jìn)行測試后，通過熒光檢測儀檢測T、C 線熒光強(qiáng)度， 以相對熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，不同標(biāo)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制新冠病毒N-蛋白檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖3 可知，隨著樣品中新冠病毒N-蛋白含量的增加，檢測線T 線顏色逐漸變深，當(dāng)新冠病毒N-蛋白濃度為0.01 ng/mL 以上時(shí)，T、C 線顯色。 由圖4 可知，新冠病毒N-蛋白的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線回歸方程為y=2 237.81 lgx+6 724.8，相關(guān)系數(shù)R2=0.99，檢測范圍為0.01～10.00 ng/mL。 根據(jù)空白測定平均值加3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，求得最低檢測限為0.01 ng/mL。

圖3 新冠病毒N-蛋白試紙條檢測靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Test results of the sensitivity of novel coronavirus N-protein test strip

圖4 新冠病毒N-蛋白的熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of fluorescence detection of novel coronavirus

2.3 特異性試驗(yàn)

用于做特異性試驗(yàn)的病原菌或重組蛋白有新冠病毒S 蛋白、新冠病毒RBD 蛋白、禽流感H1N1 病毒分離物等。 將待測物的濃度稀釋為100 ng/mL，用移液器準(zhǔn)確吸取80 μL 待檢樣本， 垂直緩慢滴加于檢測卡加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí)，10 min 后讀取結(jié)果。 試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Specific test result

結(jié)果顯示， 新冠病毒S 蛋白、 新冠病毒RBD 蛋白、甲型H1N1 病毒分離物等與本發(fā)明試紙條試劑盒無交叉反應(yīng)，表明本研究試紙條具有良好的特異性。

2.4 新冠滅活病毒的檢測

取新冠滅活病毒上清液， 用樣品提取液10 倍、100 倍稀釋，用移液器準(zhǔn)確吸取80 μL 待檢樣本，垂直緩慢滴加于檢測卡加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí)，10 min 后讀取結(jié)果，同時(shí)用熒光定量PCR 和膠體金試紙條進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6 和表1。 當(dāng)新冠滅活病毒培養(yǎng)上清液稀釋10 倍和100 倍時(shí)，T、C 線顯色，為陽性結(jié)果，表明本試紙條可以檢測新冠滅活病毒。 使用熒光定量PCR 進(jìn)行檢測，至104倍稀釋液檢測結(jié)果為陽性，105倍以上稀釋液檢測結(jié)果為陰性。 使用新冠滅活病毒膠體金試紙條進(jìn)行檢測，10倍稀釋液檢測結(jié)果為陽性，100 倍以上稀釋液檢測結(jié)果為陰性。

表1 新冠滅活病毒檢測結(jié)果Table 1 Test results of inactivated novel coronavirus

圖6 新冠滅活病毒檢測結(jié)果Fig.6 Test results for inactivated novel coronavirus

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將試紙條室溫干燥保存， 觀察不同保存時(shí)間的檢測結(jié)果，確定其有效期。試紙條在12 個(gè)月內(nèi)，其外觀、靈敏度、特異性均未發(fā)生變化，試驗(yàn)結(jié)果表明，本試紙條在室溫干燥條件下有效期為1 年。

3 討論

Novel Coronavirus 是發(fā)現(xiàn)的第7 種β 屬冠狀病毒， 含有14 個(gè)ORF 共編碼27 種蛋白質(zhì)。 靠近3′端約占基因組1/3 的ORF 編碼至少4 種結(jié)構(gòu)蛋白，包括特異性結(jié)合宿主細(xì)胞受體的棘突蛋白（S），包膜形成相關(guān)的膜蛋白（M）、包膜蛋白（E），病毒組裝相關(guān)的核衣殼蛋白（N）[5-7]。 抗原檢測通常測的是表達(dá)量高、 相對保守的核衣殼蛋白， 因此本研究采用N蛋白作為免疫學(xué)檢測方法的靶標(biāo)。

側(cè)流免疫層析法LFIA 技術(shù)由BEGGS 等[8]最早開發(fā)。 目前在Novel Coronavirus 的LFIA 檢測中，ZHOU 等[9]設(shè)計(jì)并開發(fā)了一種以量子點(diǎn)標(biāo)記的LFIA，與重組Novel Coronavirus 的S 蛋白共價(jià)連接后，采用雙抗原夾心法測定人血清中總抗體水平的方法。BAYIN 等[10]開發(fā)了一種以納米磁珠標(biāo)記的免疫層析技術(shù)，該技術(shù)基于超順磁性納米粒子（SMNP）和巨磁阻（GMR）傳感系統(tǒng)的LFIA 方法（夾心法），可同時(shí)定量檢測抗Novel Coronavirus 的IgM 和IgG， 其LOD分別為10 ng/mL 和5 ng/mL。

鑭系元素螯合物具有出色的熒光特性，銪（Ⅲ）螯合染色微粒修飾的羧酸基團(tuán)可增加熒光標(biāo)記的穩(wěn)定性并減少干擾，與傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記相比，具有更高的分析靈敏度和更大的檢測范圍[11]。 本研究利用稀土銪熒光納米微球表面的活性羧基和抗體的游離氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，將抗體共價(jià)結(jié)合于熒光微球表面，制備了具有高熒光強(qiáng)度、 高穩(wěn)定性的熒光納米微球免疫探針。 制備的熒光免疫層析試紙條與儀器配套使用，單樣本全程檢測時(shí)間10～15 min，最低檢測限可達(dá)0.01 ng/mL， 與膠體金試紙條 （最低檢測限為0.1 ng/mL）相比，靈敏度提高了10 倍。

綜上所述， 本研究建立了一種基于稀土銪熒光納米顆粒標(biāo)記的新冠病毒熒光免疫快速檢測技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對新冠病毒的定量分析和動(dòng)態(tài)監(jiān)測。 本方法操作簡便、快速、靈敏、成本低、體積小，適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)、公共衛(wèi)生應(yīng)急監(jiān)測場所，可用于新冠病毒的快速篩查診斷。