別瑋 姚佳 馮鑫 楊海濤 崔風(fēng)云 張茂東 槐碩 任西杰 張捷*

（1.中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心 北京 100026；2.北京勤邦科技股份有限公司；3.內(nèi)蒙古中敖食品有限公司）

0 引言

美洛昔康（Meloxicam）是一種新型非甾體抗炎藥，具有良好的解熱鎮(zhèn)痛、消炎等作用，在獸醫(yī)臨床治療方面應(yīng)用廣泛[1-2]。 然而，由于乳畜飼養(yǎng)業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，養(yǎng)殖數(shù)量大，存在不法養(yǎng)殖戶濫用獸藥、不遵守休藥期等現(xiàn)象， 導(dǎo)致乳品中美洛昔康殘留，嚴(yán)重影響了乳品品質(zhì)。 殘留的美洛昔康隨食物鏈進(jìn)入人體后，還可能導(dǎo)致消費(fèi)者胃腸道、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及血液系統(tǒng)等不良反應(yīng)[3-4]，乳品中抗炎藥殘留問題已成為全世界關(guān)注的焦點(diǎn)。

為了確保動(dòng)物源性食品的安全， 維護(hù)消費(fèi)者健康， 一些國(guó)家和地區(qū)規(guī)定了乳品中美洛昔康的最大殘留限量（MRLs），如歐盟規(guī)定了美洛昔康在牛奶中的MRLs 為15 μg/kg，加拿大規(guī)定了美洛昔康在牛奶中的MRLs 為35 μg/kg。我國(guó)GB 31650.1—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中41 種獸藥最大殘留限量》規(guī)定了美洛昔康在牛奶中的MRLs 為15 μg/kg[5]。

目前， 主要采用色譜方法檢測(cè)動(dòng)物源食品中美洛昔康的殘留，包括高效液相色譜法[6-7]、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[3-4，8-10]等。 如彭濤等[4]首次建立了牛奶中64 種中性和酸性藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定方法，其中檢測(cè)美洛昔康的定量下限（LOQ）為1 μg/kg。 現(xiàn)有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2190—2008《進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中非甾體類抗炎藥殘留量檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》就是采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法對(duì)牛肉、豬肝、兔肝、牛奶和雞蛋中美洛昔康殘留量進(jìn)行檢測(cè)， 測(cè)定低限為5 μg/kg。色譜方法雖然準(zhǔn)確靈敏，但其需要較高成本和專業(yè)人員操作，且操作復(fù)雜不利于推廣使用。 因此與上述現(xiàn)有的儀器方法相比，利用免疫化學(xué)法原理的快速檢測(cè)方法更加靈敏、快捷，且成本較低，適用于現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模的檢測(cè)。 但目前還沒有檢測(cè)美洛昔康試紙或者美洛昔康半抗原改造的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本文采用自合成的美洛昔康半抗原人工制備免疫原，對(duì)免疫BALB/c 小鼠進(jìn)行免疫；免疫后取小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，篩選得到可產(chǎn)生美洛昔康單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)小鼠體內(nèi)誘生腹水法制備特異性高的單克隆抗體；并利用該抗體研制可快速檢測(cè)乳品中美洛昔康的膠體金免疫層析試紙條。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c 小鼠（許可證號(hào)：SCXK2019-0010，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司）。

1.1.2 試劑

美洛昔康、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素、鏈霉素、雌二醇、青霉素G、頭孢氨芐、四環(huán)素、土霉素、玉米赤霉醇、黃曲霉毒素M1、三聚氰胺和諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品（北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、1-乙基-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和羊抗鼠二抗（生工生物工程（上海）股份有限公司）；化合物Ⅰ（CAS 號(hào)188422-58-4，上海麥克林生化科技股份有限公司）；化學(xué)試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；生牛乳（本地養(yǎng)殖場(chǎng)）；巴氏殺菌乳、UHT 滅菌乳、羊奶等乳品（購(gòu)自超市）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平 （ESJ110-4A， 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-201D，上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；酶標(biāo)儀（MK3，上海雷勃分析儀器有限公司）；點(diǎn)膜儀（xyz 3000，美國(guó)BioDot 公司）；Milli-Q 純水儀（美國(guó)Millipore 公司）； 核磁共振波譜儀（NMR）（EFT-60，美國(guó)Anasazi 公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 半抗原合成

稱取3.0 g 化合物Ⅰ， 加入1，4-二氧六環(huán)80 mL，叔丁醇鈉1.15 g， 醋酸鉛0.2 g，（2R）-1-[（1R）-1-[雙（1，1-二叔丁基）膦]乙基]-2-（二環(huán)己基膦）二茂鐵0.2 g，充分?jǐn)嚢?，然后加入巰基丙酸2.12 g，攪拌，加熱回流反應(yīng)12 h。 停止加熱，冷卻至室溫，加入水200 mL，乙酸乙酯100 mL，萃取，除去水相，有機(jī)相蒸干，無水乙醇20 mL 重結(jié)晶，得到化合物Ⅱ1.49 g，回收率為39.9%。

全部的化合物Ⅱ1.49 g， 依次加二甲基甲酰胺20 mL、二甲苯80 mL，加2-氨基-5-甲基噻唑0.68 g，充分?jǐn)嚢?，裝上回流冷凝管，加熱回流反應(yīng)24 h，旋蒸，除去有機(jī)溶劑，得到紅色油狀物，上硅膠柱，加體積比為5/1 的二氯甲烷/甲醇洗脫分離純化，得到化合物Ⅲ0.76 g，回收率為41.8%，即為半抗原產(chǎn)物。合成路線見圖1。

圖1 美洛昔康半抗原合成路線Fig.1 Synthesis of Meloxicam Hapten

1.3.2 免疫原的合成

取1.2.1 中的化合物Ⅲ16.97 mg，加1 mL DMF溶解澄清，加12.87 mg NHS 和18.1 mg EDC，充分溶解并混勻，室溫反應(yīng)2 h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白BSA 50 mg，加入0.1 mol/L pH 9.5的CB 緩沖液4 mL 進(jìn)行溶解，得到B 液。 將A 液逐滴滴加到B 液中，室溫反應(yīng)6 h，停止反應(yīng)，用0.02 mol/L PBS 透析純化3 d，每天換液3 次，之后離心分裝，得到美洛昔康-BSA 偶聯(lián)物，即為免疫原，取出分裝保存于-20℃。

1.3.3 包被原的合成

取1.2.1 中的化合物Ⅲ20.22 mg，加1 mL DMF溶解澄清，加12.87 mg NHS，18.1 mg EDC，充分溶解并混勻，室溫反應(yīng)2 h，得到半抗原活化液A 液；取卵清蛋白OVA 100 mg， 加0.1 mol/L pH 9.5 的CB緩沖液4 mL 進(jìn)行溶解，得到B 液。將A 液逐滴滴加到B 液中，室溫反應(yīng)6 h ，停止反應(yīng)，用0.02 mol/L PBS 透析純化3 d，每天換液3 次，之后離心分裝，得到美洛昔康-OVA 偶聯(lián)物，即為包被原，取出分裝保存于-20℃。

1.3.4 半抗原結(jié)構(gòu)的鑒定

美洛昔康半抗原的分子結(jié)構(gòu)鑒定采用核磁共振法（1H-NMR）確證。

1.3.5 多抗血清的制備及效價(jià)測(cè)定

對(duì)BALB/c 小鼠進(jìn)行美洛昔康人工抗原免疫，將100 μg 免疫原溶于100 μL pH 7.4 的PBS 中，隨后與等體積的FCA/FICA 混合， 對(duì)小鼠進(jìn)行頸背部皮下多點(diǎn)注射。免疫結(jié)束7 d 后，對(duì)小鼠進(jìn)行斷尾取血，對(duì)美洛昔康抗血清的效價(jià)采用間接ELISA 法進(jìn)行測(cè)定[11]，選擇抗血清效價(jià)最優(yōu)的小鼠作為后續(xù)單克隆抗體制備過程中融合細(xì)胞的脾細(xì)胞供體。

1.3.6 單克隆抗體的制備和純化

準(zhǔn)備細(xì)胞融合時(shí)提前3 d 對(duì)小鼠進(jìn)行200 μg的免疫原腹腔注射， 融合時(shí)利用小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞通過聚乙二醇的作用進(jìn)行細(xì)胞融合，融合成功的細(xì)胞在HAT 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)融合細(xì)胞的特異性進(jìn)行檢測(cè)， 選取特異性最好的陽(yáng)性細(xì)胞孔進(jìn)行有限稀釋，采用HT 培養(yǎng)基進(jìn)行克隆化，待陽(yáng)性率達(dá)100%后用DEME 培養(yǎng)基培養(yǎng)建立細(xì)胞株。 收集生長(zhǎng)良好的雜交瘤細(xì)胞對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，10 d后無菌操作收集小鼠腹水并采用辛酸-硫酸銨法進(jìn)行純化。

1.3.7 單克隆抗體免疫學(xué)特性分析

靈敏度測(cè)定：采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（icELISA）測(cè)定單克隆抗體對(duì)美洛昔康的50%抑制質(zhì)量濃度（IC50），以IC50衡量靈敏度[12]；特異性測(cè)定：采用交叉反應(yīng)試驗(yàn)，選擇慶大霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素、鏈霉素、雌二醇、青霉素G、頭孢氨芐、四環(huán)素、土霉素、玉米赤霉醇、黃曲霉毒素M1、三聚氰胺、諾氟沙星作為抑制物，icELISA 測(cè)定各抑制物的IC50，以單克隆抗體對(duì)美洛昔康的IC50與抑制物的IC50百分比為其交叉反應(yīng)率。

1.3.8 膠體金免疫層析試紙條的制備

用磷酸緩沖液將美洛昔康半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋到10 mg/mL， 用Isoflow 點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線（T 線），包被量為0.8 μL/cm；用0.01 mol/L pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠抗抗體稀釋到200 μg/mL，用Isoflow 點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線（C 線），包被量為1.0 μL/cm。將包被好的反應(yīng)膜置于37℃條件下干燥2 h，備用。

將樣品吸收墊置于含0.5%牛血清白蛋白（體積分?jǐn)?shù)）、0.1 mol/L pH 7.2 的磷酸鹽緩沖液中浸泡2 h，在37℃下烘2 h 備用。

將樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊依次按順序粘貼在PVC 底板上；結(jié)合物釋放墊從起始端有1/3 區(qū)域被樣品吸收墊覆蓋， 結(jié)合物釋放墊的末端與反應(yīng)膜的始端連接，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與PVC 底板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與PVC 底板的末端對(duì)齊；所述反應(yīng)膜上有檢測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線（T 線）和質(zhì)控線（C 線）均為與所述試紙條的長(zhǎng)相垂直的條狀帶；檢測(cè)線位于靠近結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)； 質(zhì)控線位于遠(yuǎn)離結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)；將試紙條用機(jī)器切成3 mm 寬的小條，裝在特制的塑料制卡中。

1.3.9 膠體金試紙條方法的建立

待測(cè)乳品樣本須為均勻液體，不能有結(jié)塊、發(fā)酸或沉淀。吸取待測(cè)液100 μL 垂直滴于試紙條加樣孔中，液體流動(dòng)開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)10 min，肉眼觀察判定結(jié)果。T 線顯色高于或者等于C 線顯色為陰性（－）；T線顯色低于C 線顯色或者T 線不顯色為陽(yáng)性（＋）；未出現(xiàn)C 線表示結(jié)果無效，應(yīng)重新測(cè)試。

1.3.10 試紙條靈敏度測(cè)試

用經(jīng)儀器方法確認(rèn)為不含美洛昔康的乳品（生牛乳、巴氏殺菌乳、UHT 滅菌乳、羊奶）與美洛昔康標(biāo)準(zhǔn)溶液混合， 制成濃度分別為0.025、0.05、0.075 μg/L 的樣品， 用1.3.9 所述方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)3 次，以T 線顯色最淺時(shí)的稀釋度作為試紙條最低檢測(cè)濃度。

1.3.11 試紙條準(zhǔn)確性測(cè)試

用試紙條檢測(cè)樣本中美洛昔康的殘留情況，統(tǒng)計(jì)出假陽(yáng)性試紙條和假陰性試紙條的數(shù)量， 從而計(jì)算出試紙條的假陽(yáng)性率、假陰性率。而這2 個(gè)指標(biāo)能夠用來評(píng)價(jià)試紙條的準(zhǔn)確性， 當(dāng)試紙條的假陽(yáng)性率小于5%，同時(shí)，未出現(xiàn)假陰性結(jié)果，即假陰性率為0。那么，這說明試紙條的準(zhǔn)確性指標(biāo)良好。本研究利用已由儀器確證的樣本進(jìn)行測(cè)定， 即質(zhì)量濃度小于0.05 μg/L 的50 份陰性乳品樣本、 質(zhì)量濃度大于0.05 μg/L 的50 份陽(yáng)性乳品樣本， 以此測(cè)定的結(jié)果來反映所研制試紙條的準(zhǔn)確性。

1.3.12 試紙條穩(wěn)定性測(cè)試

本研究利用已由儀器確證的樣本進(jìn)行測(cè)定，即質(zhì)量濃度小于0.05 μg/L 的20 份陰性乳品樣本、質(zhì)量濃度大于0.05 μg/L 的20 份陽(yáng)性乳品樣本， 用不同保藏時(shí)間的試紙條進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估測(cè)定。 對(duì)試紙條進(jìn)行37℃老化試驗(yàn)，4℃、25℃、30℃穩(wěn)定性試驗(yàn)，每個(gè)樣本測(cè)定次數(shù)為2 次。

1.3.13 試紙條特異性試驗(yàn)

向空白生牛乳、巴氏殺菌乳、UHT 滅菌乳、羊奶等乳品樣本中， 各添加乳品中可能與美洛昔康聯(lián)合用藥的藥物（慶大霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素、鏈霉素、雌二醇、青霉素G、頭孢氨芐、四環(huán)素、土霉素、玉米赤霉醇、黃曲霉毒素M1、三聚氰胺、諾氟沙星） 來進(jìn)行試紙條的特異性分析， 添加濃度至500 μg/L，用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)3 次，從而判斷試紙條的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原結(jié)構(gòu)鑒定

美洛昔康是一種小分子非甾體抗炎藥， 不具有完全抗原的免疫原性，需要與大分子蛋白質(zhì)偶聯(lián)成人工完全抗原后才能進(jìn)行動(dòng)物免疫[16]。 本研究人工合成了美洛昔康半抗原，并對(duì)1.2.1 制備的半抗原，進(jìn)行核磁共振（1H-NMR，500 MHz，Chloroform-d）試驗(yàn)，結(jié)果由圖2 可知，1H NMR （500 MHz，Chloroform-d）譜圖顯示：δ7.84（d，J=8.8 Hz，1H），7.74 （d，J=1.9 Hz，1H），7.45 （dd，J=8.9，1.9 Hz，1H），6.99（s，1H），3.15（t，J=6.5 Hz，2H），3.06（s，2H），2.54（t，J=6.5 Hz，2H）。其中， 化學(xué)位移δ=3.15、2.54 的峰為間隔臂上亞甲基氫的吸收峰，該峰的存在，證明半抗原合成成功。

圖2 半抗原1H-NMR 鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of hapten by 1H-NMR

2.2 抗血清效價(jià)的測(cè)定

第4 次免疫后，通過對(duì)小鼠斷尾取血，采用間接ELISA 檢測(cè)，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm 條件下的吸光度值（OD450值），計(jì)算其抑制率，對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為抗血清效價(jià)值。表1 顯示6 號(hào)小鼠產(chǎn)生的抗血清效價(jià)（540 000）和抑制率（47.1%）最優(yōu)，因此選擇6 號(hào)小鼠作為與骨髓瘤細(xì)胞融合的脾細(xì)胞供體。

表1 小鼠抗血清測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of mouse antiserum assay

2.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選

經(jīng)過篩選得到3 株陽(yáng)性融合細(xì)胞株，如圖3 所示，Mel-101 細(xì)胞株隨美洛昔康競(jìng)爭(zhēng)濃度的增加OD450顯色程度下降最為顯著，說明其分泌的單克隆抗體對(duì)于美洛昔康的親和力最高[13]。因此，選擇該細(xì)胞株用于小鼠腹水的采集。

圖3 雜交瘤細(xì)胞的篩選Fig.3 Screening of hybridoma cells

2.4 單克隆抗體免疫學(xué)特性分析

抗體特異性是指與抗原類似物相比，與特定抗原結(jié)合的能力，常用交叉反應(yīng)率作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。 抗體的交叉反應(yīng)率和特異性呈反比關(guān)系。 本試驗(yàn)選擇了乳品中可能與美洛昔康聯(lián)合用藥的慶大霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素、鏈霉素、雌二醇、青霉素G、頭孢氨芐、四環(huán)素、土霉素、玉米赤霉醇、黃曲霉毒素M1、三聚氰胺、諾氟沙星來進(jìn)行特異性分析。結(jié)果表明，單克隆抗體對(duì)美洛昔康具有特異性，與其結(jié)構(gòu)類似物無交叉反應(yīng)（表2）。

2.5 試紙條靈敏度試驗(yàn)

由圖4 可知， 檢測(cè)美洛昔康濃度分別為0.025、0.050、0.075 μg/L 的陰性乳品加標(biāo)樣品，T 線顏色由強(qiáng)（0 μg/L）到弱，在0.05 μg/L 濃度時(shí)T 線顯色弱于C 線，為陽(yáng)性。因此確定本試紙條對(duì)乳品樣本的檢測(cè)限為0.05 μg/L，我國(guó)GB 31650.1—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中41 種獸藥最大殘留限量》 規(guī)定了美洛昔康在牛奶中的MRLs 為15 μg/kg， 因此符合GB 31650.1—2022 規(guī)定的最大殘留限量要求。

圖4 膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)限的確定Fig.4 Determination of detection limit of gold immunochromatographic strip

2.6 試紙條準(zhǔn)確性試驗(yàn)

用試紙條檢測(cè)50 份陰性和50 份陽(yáng)性生牛乳、巴氏殺菌乳、UHT 滅菌乳、羊奶等乳品樣本，表3 為檢測(cè)結(jié)果。 結(jié)果顯示，檢測(cè)所有陽(yáng)性樣本時(shí)，試紙條未出現(xiàn)假陰性結(jié)果，假陰性率為0%；檢測(cè)陰性樣本時(shí)，巴氏殺菌乳、UHT 滅菌乳、羊奶等樣本出現(xiàn)了不同數(shù)量的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，假陽(yáng)性數(shù)量分別為1、1、3，即假陽(yáng)性率分別為2%、2%、6%。

表3 準(zhǔn)確性測(cè)定結(jié)果Table 3 Accuracy determination

測(cè)定結(jié)果的假陽(yáng)性率和假陰性率是評(píng)價(jià)試紙條的重要指標(biāo)， 部分省市的市場(chǎng)監(jiān)督管理局頒發(fā)了相關(guān)的地方標(biāo)準(zhǔn)， 標(biāo)準(zhǔn)中均涉及到假陽(yáng)性率和假陰性率的考察。 湖北省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布的DB42/T 1868—2022 《食品快速檢測(cè)產(chǎn)品評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》、深圳市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布的DB4403/T 96—2020《食品快速檢測(cè)產(chǎn)品評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[14]中均規(guī)定：對(duì)沒有國(guó)家規(guī)定食品快速檢測(cè)方法的，假陽(yáng)性率應(yīng)≤15%、假陰性率應(yīng)≤5%。 江西省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布的DB36/T 1334—2020 《食品快速檢測(cè)產(chǎn)品評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[15]中規(guī)定：沒有國(guó)家規(guī)定食品快速檢測(cè)方法的，假陰性率和假陽(yáng)性率應(yīng)根據(jù)在實(shí)際樣品的檢出情況評(píng)估是否符合需求。 本試紙條滿足上述標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.7 試紙條特異性試驗(yàn)

向空白生牛乳、巴氏殺菌乳、UHT 滅菌乳、羊奶等乳品樣本中， 各添加乳品中可能與美洛昔康聯(lián)合用藥的慶大霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素、鏈霉素、雌二醇、青霉素G、頭孢氨芐、四環(huán)素、土霉素、玉米赤霉醇、黃曲霉毒素M1、三聚氰胺、諾氟沙星來進(jìn)行試紙條的特異性分析，添加濃度至500 μg/L，用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)3 次。 結(jié)果表明，本研究的試紙條對(duì)美洛昔康具有特異性， 與所測(cè)藥物無交叉反應(yīng)（表4）。

表4 檢測(cè)美洛昔康試紙條的特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Test results of specificity of meloxicam test strip

2.8 試紙條穩(wěn)定性試驗(yàn)

針對(duì)生牛乳、巴氏殺菌乳、UHT 滅菌乳、羊奶等乳品樣本， 為評(píng)估不同保藏時(shí)長(zhǎng)試紙條的穩(wěn)定性，本研究統(tǒng)計(jì)假陽(yáng)性結(jié)果或者假陰性結(jié)果的數(shù)量。 測(cè)定結(jié)果顯示， 如果試紙條的保藏時(shí)長(zhǎng)在12 個(gè)月以內(nèi)，那么，試紙條不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果或者假陰性結(jié)果；然而，試紙條的保藏時(shí)長(zhǎng)為13 個(gè)月時(shí)，試紙條出現(xiàn)個(gè)別失效或者假陽(yáng)性結(jié)果，準(zhǔn)確性相對(duì)下降。

一般情況下， 膠體金免疫層析試紙條的保質(zhì)期為1 年，這與試紙條的組成物質(zhì)有關(guān)，尤其是與包被原、金標(biāo)抗體等物質(zhì)的活性有關(guān)，為了方便試紙條的保存，綜合實(shí)際應(yīng)用情況以及試紙條的保質(zhì)期，將試紙條放置于4℃保存。

3 討論

在現(xiàn)有文獻(xiàn)中，通過儀器方法檢測(cè)美洛昔康殘留量的研究較多。 其中，彭濤等[3]采用超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定了豬肝中18 種非甾體類抗炎藥（NSAIDs）的殘留量，其中檢測(cè)美洛昔康的檢出限（LOD）為0.2～10 μg/kg。彭濤等[4]首次建立了牛奶中64 種中性和酸性藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定方法，其中檢測(cè)美洛昔康的定量下限（LOQ）為1 μg/kg。 李娜等[9]建立了豬肉中美洛昔康等四種非甾體抗炎藥殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測(cè)方法，對(duì)豬肉中美洛昔康的定量限為1.6 μg/kg。肖倩文[10]建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測(cè)豬?？墒承越M織（肌肉、腎臟、肝臟、牛奶）中美洛昔康殘留量的方法，牛奶中美洛昔康的定量限為1.5 μg/kg。

目前未檢索到檢測(cè)美洛昔康試紙或者美洛昔康半抗原改造的相關(guān)文獻(xiàn)。美洛昔康為小分子物質(zhì)，在動(dòng)物體內(nèi)無法產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)， 即僅用美洛昔康分子無法獲得相應(yīng)抗體，因此，本研究對(duì)其進(jìn)行半抗原改造，并偶聯(lián)相應(yīng)蛋白成為大分子，才能免疫動(dòng)物獲得抗體。本研究通過該思路人工合成了美洛昔康半抗原，然后通過羧基與BSA、OVA 進(jìn)行偶聯(lián)，進(jìn)而制備出美洛昔康的人工完全抗原， 獲得美洛昔康單克隆抗體， 根據(jù)半固體培養(yǎng)基的方法來進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的融合，篩選了3 株雜交瘤陽(yáng)性細(xì)胞株，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，腹腔法來獲得美洛昔康單克隆抗體，并對(duì)單克隆抗體的特性進(jìn)行鑒定， 其IC50為0.024 ng/mL，與乳品中可能與美洛昔康聯(lián)合用藥的15 種藥物無交叉反應(yīng)；結(jié)合膠體金免疫層析技術(shù)，研制了一種快速檢測(cè)乳品中美洛昔康殘留的膠體金免疫層析試紙條，制備的檢測(cè)乳品中美洛昔康殘留試紙條，檢測(cè)限為0.05 μg/L。

不僅關(guān)鍵指標(biāo)優(yōu)于現(xiàn)有文獻(xiàn)， 并且美洛昔康半抗原改造方法具有創(chuàng)新性，因此，本研究于2023年9 月4 日向國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局申請(qǐng)了發(fā)明專利 《一種檢測(cè)美洛昔康的試紙條及其應(yīng)用》， 專利號(hào)為2023111298704。

該試紙條成本低廉，穩(wěn)定性良好，檢測(cè)范圍廣，樣品前處理簡(jiǎn)單檢測(cè)限為0.05 μg/L，符合GB 2763規(guī)定的最大殘留限量要求，且優(yōu)于現(xiàn)有文獻(xiàn)水平。該試紙條可準(zhǔn)確檢測(cè)出陽(yáng)性樣品，對(duì)于陰性樣本，還可以通過使用膠體金讀數(shù)儀來對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析， 以提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。該方法作為一種快速篩查手段，可廣泛用于乳品中美洛昔康殘留的現(xiàn)場(chǎng)篩查， 很好地彌補(bǔ)了儀器分析法的不足， 具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。