吳文金, 劉 洋, 王濟(jì)國(guó), 鐘安娜

[寶安中醫(yī)院(集團(tuán)), 1.檢驗(yàn)科, 2.腫瘤科, 廣東 深圳, 518133;3. 廣東省深圳市寶安區(qū)婦幼保健院, 廣東 深圳, 518133]

盡管多數(shù)乳頭狀甲狀腺癌患者經(jīng)過(guò)綜合治療后預(yù)后良好,但仍有部分患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。微小RNA在腫瘤復(fù)發(fā)中扮演著重要角色[1-2]。研究[3]表明,宮頸癌組織微小RNA-127-3p(miR-127-3p)表達(dá)降低,可抑制宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。miR-127-3p過(guò)表達(dá)可抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]。但miR-127-3p與甲狀腺癌惡性表型的關(guān)系無(wú)文獻(xiàn)報(bào)告。腫瘤細(xì)胞侵襲抑制因子(SCAI)在腫瘤組織中異常表達(dá),參與調(diào)控腫瘤的惡性表型[5-7], 但SCAI與乳頭狀甲狀腺癌的關(guān)系尚不清楚。研究[7-8]顯示, SCAI與多種微小RNA存在靶向關(guān)系,參與調(diào)控腫瘤的惡性表型。但miR-127-3p與SCAI的關(guān)系未知。本研究分析miR-127-3p對(duì)乳頭狀甲狀腺癌惡性表型的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細(xì)胞株及儀器

選取乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC1、正常人甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1(本實(shí)驗(yàn)保存)。主要試劑和儀器主要包括: 引物、miR-127-3p 過(guò)表達(dá)載體(mimics)、miR-NC(miR-127-3p過(guò)表達(dá)的空載體)、對(duì)照質(zhì)粒、si-NC、si-SCAI、突變型(MUT)-SCAI、野生型(WT)-SCAI(廣州云舟生物科技股份有限公司); 鼠抗人SCAI、β-actin、羊抗鼠二抗(沈陽(yáng)萬(wàn)類康生物有限公司); RNA提取、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒,轉(zhuǎn)染試劑盒(廣州云舟生物科技股份有限公司); 氯化丙定(PI)(廣州云舟生物科技股份有限公司); 熒光素酶檢測(cè)試劑盒(大連醫(yī)友生物有限公司); 噻唑藍(lán)(MTT, 大連醫(yī)友生物有限公司); Transwell小室(Corning,美國(guó)); 酶標(biāo)儀(杭州奧盛儀器有限公司); PCR儀(杭州奧盛儀器有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

利用完全DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃、5%CO2, 隔日傳代、換液。取生長(zhǎng)良好的TPC1細(xì)胞,將質(zhì)粒及Lip 2000一起加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分為空白組(NC組,無(wú)處理)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-127-3p過(guò)表達(dá)的空載體)、miR-127-3p組(轉(zhuǎn)染miR-127-3p-mimics)、si-NC組(轉(zhuǎn)染 SCAI 敲低空載體)和si-SCAI組(轉(zhuǎn)染si-SCAI)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-127-3p、SCAI mRNA水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,利用Trizol提取總RNA, 檢測(cè)濃度,逆轉(zhuǎn)錄cDNA: 10 mmol/L dNTP1.5 μL, 5×PCR buffer 5 μL, 反轉(zhuǎn)錄酶1 μL, DEPC水2.5 μL, 總體積25 μL。然后采用PCR擴(kuò)增,引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系: SYBR? Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL+上下游引物(10 μmol/L) 1 μL, 加DEPC水,總體積為25 μL。反應(yīng)參數(shù): 95 ℃ 1 min、90 ℃ 20 s、50 ℃ 15 s, 共40個(gè)循環(huán)。2-△△Ct法表示表達(dá)量。內(nèi)參為U6、GAPDH。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

表1 目標(biāo)引物序列

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于96孔板,培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),分別于0、48、72、96 h檢測(cè)細(xì)胞活力,檢測(cè)前加入20 μL MTT, 培養(yǎng)4 h, 然后加入150 μL DMSO, 水平搖床搖動(dòng)30 min,上機(jī)檢測(cè)光密度(OD)值。每組5個(gè)復(fù)孔。

1.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)

遷移實(shí)驗(yàn): 上室中加入1×105個(gè)細(xì)胞,用無(wú)血清培養(yǎng)基配制,下室加入含20%血清培養(yǎng)基, 48 h后去除上室未穿細(xì)胞,用4%多聚甲醛固定, 0.1%結(jié)晶紫染色,洗滌,計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn): 首先用DMEM培養(yǎng)基按照1∶8稀釋基質(zhì)膠,上室中加40 μL基質(zhì)膠,其余同上。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6 Western blot法檢測(cè)SCAI蛋白的表達(dá)

去除培養(yǎng)基,加入裂解液提取總蛋白。配制3%膠,點(diǎn)樣, SDS-PAGE電泳2 h將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上, 5%脫脂奶粉封閉1 h, 加入SCAI(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)抗體冰箱過(guò)夜,次日加入二抗(1∶1 000), 室溫1 h, 洗滌3次后上機(jī)曝光, Image J軟件分析光密度。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7 熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-127-3p與SCAI的靶向關(guān)系

分別將MUT-SCAI、WT-SCAI質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入NC組和miR-127-3p組, 48 h后檢測(cè)各組細(xì)胞熒光活性。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞、正常人甲狀腺細(xì)胞中的miR-127-3p表達(dá)

TPC1細(xì)胞中的miR-127-3p表達(dá)水平低于Nthy-ori 3-1細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

與TPC1細(xì)胞比較,??P<0.01。圖1 各組細(xì)胞中miR-127-3p的表達(dá)

2.2 乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞及正常甲狀腺細(xì)胞中SCAI蛋白、SCAI mRNA表達(dá)

TPC1細(xì)胞中SCAI蛋白、SCAImRNA表達(dá)均低于Nthy-ori 3-1細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

2.3 miR-127-3p過(guò)表達(dá)對(duì)TPC1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

miR-127-3p組細(xì)胞中的miR-127-3p表達(dá)水平高于NC組、miR-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 但NC組、miR-NC組的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miR-127-3p組48、72 h 細(xì)胞OD值、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量低于NC組、miR-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); NC組、miR-NC組的細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲數(shù)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

A: Western blot檢測(cè)SCAI蛋白; B: 各組SCAI蛋白表達(dá)水平; C: 各組SCAI mRNA表達(dá)水平。與TPC1細(xì)胞比較, ??P<0.01。圖2 TPC1細(xì)胞和Nthy-ori 3-1細(xì)胞中SCAI蛋白、SCAI mRNA的表達(dá)

2.4 抑制SCAI表達(dá)對(duì)TPC1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

si-SCAI組細(xì)胞中SCAI蛋白及SCAImRNA水平低于NC組、si-NC 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 但NC組、miR-NC組細(xì)胞中SCAI蛋白及SCAImRNA水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。si-SCAI組48、72 h細(xì)胞OD值、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量高于NC組、si-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

A: 各組miR-127-3p表達(dá)水平; B: MTT結(jié)果; C: 遷移實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)。與miR-127-3p組比較, ?P<0.05。圖3 miR-127-3p過(guò)表達(dá)對(duì)TPC1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.5 各組細(xì)胞SCAI蛋白表達(dá)

miR-127-3p組SCAI蛋白表達(dá)水平高于NC組、miR-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

A: Western blot檢測(cè)SCAI蛋白; B: 各組SCAI蛋白水平。與miR-127-3p組比較, ?P<0.05。圖5 各組細(xì)胞SCAI蛋白表達(dá)水平

2.6 miR-127-3p與SCAI的靶向關(guān)系

生物信息分析顯示, miR-127-3p與SCAI存在互補(bǔ)堿基。轉(zhuǎn)載WT-SCAI的 miR-127-3p組細(xì)胞熒光素酶活性高于轉(zhuǎn)載WT-SCAI的NC組細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

A 互補(bǔ)堿基對(duì); B熒光素酶實(shí)驗(yàn)。與NC組比較, ?P<0.05。圖6 miR-127-3p與SCAI的靶向關(guān)系

3 討 論

大量文獻(xiàn)[9-12]報(bào)道,微小RNA在乳頭狀甲狀腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。miR-127-3p在多種腫瘤組織中高表達(dá)。研究[13]表明,下調(diào)miR-127-3p能抑制肝癌進(jìn)展。miR-127-3p可抑制黑色素瘤細(xì)胞的惡性行為,促進(jìn)凋亡[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn),卵巢癌患者血清miR-127-3p與臨床病理特征有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞中miR-127-3p呈低表達(dá),提示miR-127-3p可能是乳頭狀甲狀腺癌的抑癌基因。為了進(jìn)一步研究miR-127-3p在乳頭狀甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,本研究構(gòu)建了miR-127-3p過(guò)表達(dá)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞,并分析了其對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性表型的影響。結(jié)果顯示, miR-127-3p過(guò)表達(dá)的細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力顯著降低。研究[16-20]發(fā)現(xiàn), miR-127在前列腺癌、膀胱癌及結(jié)腸癌組織中呈低表達(dá),機(jī)制可能是miR-127啟動(dòng)子區(qū)域的異常甲基化,通過(guò)去甲基化藥物激活miR-127表達(dá),并抑制其靶標(biāo) B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞6(Bcl-6)抑制腫瘤發(fā)生。

miR-127-3p靶向多個(gè)基因行使其功能,如miR-127-3p可通過(guò)靶向MAPK4抑制卵巢癌腫瘤的生長(zhǎng)[21]。另外, miR-127-3p可通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[22]。SCAI是一種抑癌基因,參與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。另外,在多種腫瘤中SCAI可被多種微小RNA抑制[23-24]。本研究結(jié)果顯示,乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞中SCAI呈高表達(dá),抑制SCAI后增強(qiáng)了細(xì)胞惡性生物學(xué)行為,提示SCAI與腫瘤進(jìn)展有關(guān)。許娟秀等[25]研究發(fā)現(xiàn), miR-135a可靶向SCAI抑制宮頸癌糖酵解。研究[26]發(fā)現(xiàn),在肝癌細(xì)胞中SCAI可作為miR-425-5p的靶基因,當(dāng)其被miR-425-5p抑制后可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和轉(zhuǎn)移。上述結(jié)果證實(shí),miR-127-3p通過(guò)負(fù)向調(diào)控SCAI的表達(dá)抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移。

綜上所述,乳頭狀甲狀腺癌中miR-127-3p呈低表達(dá),可抑制細(xì)胞惡性生物學(xué)行為,機(jī)制可能與靶向SCAI有關(guān),但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。