周欣瑩,耿宇航,賈艷艷,孫浩男,劉冬云,李 艷

(河北農業(yè)大學園林與旅游學院,河北 保定 071000)

莎草科(Cyperaceae)苔草屬(Carex)植物種類多,分布極廣,全球約有2 000種,我國約有500種[1-2],其中,河北省內約有45種[3]。苔草屬植物種類繁多,適應性強,觀賞價值高,能夠作為優(yōu)質的草坪地被植物[4]。同時,苔草屬植物在生態(tài)修復方面也發(fā)揮著重要的作用[5]。在苔草屬的分類中,常常以小穗的單性或兩性以及鱗片、果囊的差異等特征定性,形態(tài)學鑒定較為困難。要識別特定的苔草,首先確定其亞屬定位,然后是選擇正確的分組[6],因此有必要開發(fā)分子標記來鑒定和區(qū)別苔草屬植物。

目前,用于研究苔草屬植物的分子標記較少。Nagasawa等[7]基于二代轉錄組測序開發(fā)了日本北部索爾法塔拉地區(qū)的特有植物C.angustisquama的EST-SSR分子標記,并與其近源種C.doenitzi、C.podogyna進行分析后發(fā)現(xiàn),C.angustisquama的較低多態(tài)性可能是由于種群進化關系導致。Jiménez-Mejías等[8]提出并討論了ETS、ITS、matK 3種分子標記方法開發(fā)大型系統(tǒng)發(fā)育假說,以及這3種分子標記的使用方法,提出了新定義的系統(tǒng)發(fā)育假說,這也是苔草屬植物的第一個大規(guī)模系統(tǒng)發(fā)育假說。我國學者常采用ISSR分子標記對苔草屬進行研究,ISSR分子標記技術有操作簡便、穩(wěn)定性高等優(yōu)點[9]。寧花等[10]建立了山東省苔草屬植物的ISSR最優(yōu)體系,并對28份山東省苔草屬種質資源進行遺傳多樣性分析;胡延萍等[11]使用正交優(yōu)化方法建立了黑褐苔草(C.atrofusca)的ISSR-PCR體系,擴增出了清晰穩(wěn)定的條帶。

河北省有著豐富的苔草屬種類,但尚未系統(tǒng)性地調查收集這些種質資源,《河北省植物志》目前所記錄的45種苔草中,大部分僅在花果期才能進行較為有效的區(qū)分和鑒定,極大地影響了其研究和開發(fā)利用。因此,本研究優(yōu)化并建立了適用于河北省野生苔草屬植物分類鑒定的ISSR分子標記體系,進行遺傳多樣性及親緣關系分析,旨在從分子角度上為苔草屬分類、鑒定、育種及指紋圖譜等研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料包括33種河北省野生苔草(根據(jù)《河北省植物志》及《內蒙古植物志》鑒定),采自保定市、霧靈山、小五臺山及承德等地,以及20份國外引種的苔草種質,共計53份,引種收集后栽植于河北農業(yè)大學試驗基地,并對其表型性狀進行測量和描述,詳見表1。

表1 供試苔草信息Table 1 The information of the tested Carex species

1.2 方法

1.2.1DNA的提取及目標引物的篩選 按照DNA提取試劑盒(CW0531S,康為世紀)說明書步驟提取53份苔草樣本的DNA后,用Nano Drop微量分光光度計進行DNA純度檢測并使用1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。將DNA母液稀釋至40 ng·μL-1。利用加拿大哥倫比亞大學(UBC)所公布的100條ISSR通用引物進行試驗,選取中亞苔草和異鱗苔草DNA為模板進行初篩,去除無擴增產物以及彌散嚴重的引物,篩選出擴增產物穩(wěn)定、條帶清晰且多態(tài)性較好的引物。25 μL PCR反應體系：2 μL DNA模板、2 μL引物(6 μmol·L-1)、12 μL Master Mix,用ddH2O補足。PCR反應程序：94℃預變性3 min,94℃變性30 s,退火45 s,72℃延伸1 min,38個循環(huán),72℃延伸10 min,4℃保存。試驗所用引物、Master Mix和2 000 bp DNA marker均購自北京天根生物有限公司。

根據(jù)公式：η=1-(1-1/2)n(n為樣品數(shù),η為有多態(tài)性引物的選中概率),計算選中的有多態(tài)性引物的概率。本研究利用4個DNA樣品進行測試,則有多態(tài)性引物的選中概率為93.75%。

1.2.2ISSR反應體系單因素優(yōu)化 以U845為引物,芒髯苔草‘香草冰’的DNA作為模板,對DNA模板含量、引物濃度、Master Mix含量和循環(huán)數(shù)設定6個梯度,以單因素優(yōu)化法進行4組試驗(表2),如：當進行DNA模板優(yōu)化試驗時,其他3組因素保持不變,使用1.2.1中PCR反應體系及程序。

表2 ISSR-PCR反應體系的單因素優(yōu)化Table 2 ISSR-PCR amplification by the single factor experiment

1.2.3ISSR-PCR反應體系正交優(yōu)化 對各因素優(yōu)化篩選后,選擇能擴增出清晰條帶的3個梯度進行正交優(yōu)化,參考董如何等[12]的方法設計L9(34)正交表(表3)。

表3 ISSR-PCR反應體系的正交優(yōu)化Table 3 Orthogonal design for ISSR-PCR

1.2.4ISSR-PCR正交反應體系優(yōu)化結果評價 參照張麗[13]的方法,按照擴增出條帶的數(shù)目、亮度、清晰度及特異性分別對9個組合評分,條帶多、亮、無雜帶拖帶的得分最高,為6分,條帶少、弱、拖帶多的得1分,按照評分結果計算方差、極差,確定最佳體系與各因素對體系的影響。

1.2.5引物篩選及退火溫度的優(yōu)化 根據(jù)引物的Tm值來確定最優(yōu)退火溫度。以中亞苔草和翼果苔草的DNA為模板,設定退火溫度為46.4℃,47.6℃,48.8℃,50℃,51.2℃,51.4℃,52.1℃,53.2℃,54.4℃,55.6℃,56.8℃,58.0℃。

1.2.6ISSR-PCR反應體系正交優(yōu)化結果驗證 隨機挑選U823、U840、U845、U876這4條引物,對隨機選出的寬葉苔草、矮叢苔草、白鱗苔草、早春苔草4份苔草樣本進行擴增。驗證所得到的ISSR-PCR反應體系,觀察條帶是否清晰且多態(tài)性高。

1.2.7數(shù)據(jù)分析 按照人工讀帶的原則[10],記下所有在產物同一區(qū)域顯示出來的條帶,將清晰、無拖尾的條帶記為“1”,模糊或無條帶的顯示記為“0”,將統(tǒng)計結果輸入Excel待分析。使用NTsys軟件,采用UPGMA法繪制聚類圖,使用POPGENE軟件計算有效等位基因數(shù)(Ne)等指數(shù)。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學特征分析

由表1可知,供試苔草屬植物的小穗分為小穗兩性和小穗單性,小穗兩性即為在同一小穗中存在雌雄同序的情況,包括翼果苔草、尖嘴苔草、卵囊苔草、細葉苔草、中亞苔草、疏穗苔草、棕櫚葉苔草、寬葉苔草、紫鱗苔草、紫喙苔草、華北苔草、白頭山苔草等,其中紫鱗苔草、華北苔草、白頭山苔草均為頂生小穗雌雄順序,其余小穗均為雌性。小穗單性雌雄同株的有毛鞘苔草、早春苔草、披針葉苔草、金穗苔草等。苔草種間的雌雄小穗數(shù)量也有差異,青綠苔草、短鱗苔草、早春苔草、矮叢苔草等的花序大多頂生1個雄小穗,2～4個雌小穗,毛鞘苔草、麻根苔草、糙葉苔草等的花序上部1～3個為雄小穗,下部2～3個雌小穗。小穗形態(tài)有直立和下垂兩種形式,具短柄或無柄的小穗直立,包括青綠苔草、異鱗苔草、紅穗苔草等;小穗柄長且種子數(shù)量大的易下垂,如鴨綠苔草、麻根苔草、扁囊苔草、森林苔草等。

不同種苔草的葉長葉寬不同,毛鞘苔草、鴨綠苔草、糙囊苔草、華北苔草等葉長較長,最長可達80.0～100.0 cm,‘寶藏島’、金穗苔草、扁囊苔草、棕櫚葉苔草等的葉長較短,為30.0 cm以下。寬葉苔草、‘寶藏島’、柄苔草、三裂苔草等的葉寬較寬,最寬可達10.0～25.0 mm,細葉苔草、矮叢苔草、烏蘇里苔草、干生苔草等的葉片較窄,在1.0～2.0 mm之間。

不同種苔草的自然叢高和花序高度也有差異。毛鞘苔草、華北苔草、鴨綠苔草、糙囊苔草等自然叢高可達50.0～80.0 cm,花序高度可達80.0 cm以上,植株較高;早春苔草、披針葉苔草、短鱗苔草、芒髯苔草‘香草冰’等自然叢高30.0～50.0 cm,花序高度20.0～50.0 cm,植株中等;而寬葉苔草、青綠苔草、矮叢苔草、金穗苔草等的自然叢高大多在30.0 cm以下,花序高度在50.0 cm以下,其中矮叢苔草花序較短為8.0～12.0 cm,隱藏于葉叢中。

2.2 DNA模板用量優(yōu)化結果

模板DNA用量對PCR反應影響結果見圖1。當模板用量過低時,擴增得到的條帶數(shù)較少、顏色較淡。模板DNA處于60～80 ng時,擴增的條帶清晰且明亮。

2.3 目標引物濃度優(yōu)化結果

不同引物濃度對PCR反應影響結果見圖2。引物濃度為3 μmol·L-1時最暗淡且不清晰,引物濃度在4～6 μmol·L-1之間時,能擴增出較為清楚的條帶。當引物濃度大于6 μmol·L-1時,擴增得到的條帶有拖帶。

圖1 DNA模板用量對ISSR-PCR反應體系的影響Fig.1 Effects of DNA dosage on ISSR-PCR reaction system注：M：DL 2000 DNA Ladder;1～6 DNA濃度分別為30,40,50,60,70,80 ngNote：M：DL 2000 DNA Ladder;1～6 DNA concentration of 1～6;30,40,50,60,70,80 ng respectively

圖2 引物濃度對ISSR-PCR反應體系的影響Fig.2 Effects of primers on ISSR-PCR reaction system注：1～6引物濃度分別為3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0 μmol·L-1Note：Primer concentration of 1～6：3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0 μmol·L-1 respectively

2.4 Master Mix體系用量優(yōu)化結果

Master Mix含量對PCR體系影響結果見圖3。Mix加入量小于11 μL時,擴增條帶淺且數(shù)量較少。含量在11～14 μL時擴增條帶變多且穩(wěn)定清晰?？紤]節(jié)約成本,11 μL為Mix最佳用量。

2.5 ISSR-PCR反應循環(huán)數(shù)優(yōu)化結果

循環(huán)數(shù)對PCR反應體系的影響見圖4。28個循環(huán)下無擴增條帶出現(xiàn),33個循環(huán)下條帶顏色淡且模糊,53個循環(huán)下條帶過亮且有拖帶。38,43和48循環(huán)下均有條帶產生,但38和43個循環(huán)擴增出的條帶少,當PCR循環(huán)數(shù)為48時,條帶清晰且穩(wěn)定,故PCR反應循環(huán)數(shù)最佳為48個循環(huán)。

圖3 Master Mix用量對ISSR-PCR反應體系的影響Fig.3 Effects of the Master Mix dosage on ISSR-PCR reaction system注：1～6 Master Mix用量：9.10.11.12.13.14 μLNote：The Master Mix dosage of 1～6：9.10.11.12.13,14 μL

2.6 ISSR-PCR反應體系的正交優(yōu)化

檢測ISSR-PCR正交優(yōu)化擴增產物,見圖5。結果表明,在9組不同組合中,組合1擴增條帶彌散不清晰;組合2,3,4,9擴增條帶極少且條帶較暗或過亮;組合5,6,7,8擴增條帶清晰且明亮,其中組合8擴增條帶效果最好。3次重復評分分別為：

(1)1,2,3,3,4,4,4,6,2

(2)1,2,3,3,4,5,4,6,2

(3)1,2,3,4,4,5,5,6,2

用SPSS 22.0對評分結果進行分析,并計算各因子在4個試驗水平的極差值(T值)和δ值。T值越大表示對ISSR-PCR擴增的影響越大,各因子濃度水平的影響從大到小依次為：模板DNA>循環(huán)數(shù)>Master Mix>引物(表4)。δ值的大小可以確定對應因素水平組合。由表4可知δ31>δ21>δ11,δ22>δ31>δ11,δ13>δ33>δ23,δ34>δ24>δ14,因此組合為A3B2C1D3(ABCD表示四個因素,該組合的下標表示該因素所在的水平)得到ISSR-PCR擴增的最優(yōu)結果。由表5可知,模板DNA、引物、Master Mix、循環(huán)數(shù)對試驗結果影響顯著(P<0.05)。此時25 μL反應體系為模板DNA 80 ng,引物濃度5 μmol·L-1,Master Mix用量11 μL,循環(huán)數(shù)48個。

圖5 ISSR-PCR反應的正交優(yōu)化Fig.5 ISSR-PCR amplification by the optimal reaction system

表4 不同試驗因子極差分析表Table 4 Score of different factors

2.7 ISSR引物篩選及多態(tài)性分析

以中亞苔草和翼果苔草的DNA為模板,首先在50℃退火溫度下對100條通用引物進行擴增,初篩出條帶清晰且有多態(tài)性的12條引物,再設置12個梯度對12條引物進行擴增,部分結果見圖6。最終篩選的12條引物全部能擴增出清晰明亮且多態(tài)性良好的條帶,詳見表6。

表5 ISSR-PCR正交試驗方差分析Table 5 Optimal results of ISSR-PCR reaction

表6 ISSR引物信息Table 6 Information of 12 ISSR primers

2.8 ISSR-PCR反應體系的驗證

隨機挑選4個引物,使用優(yōu)化過的反應體系對4份苔草樣本進行擴增,結果見圖7。不同的引物在不同苔草樣本中均能擴增出清晰、明亮的條帶。因此,本研究所建立的苔草屬ISSR-PCR反應體系是穩(wěn)定、可靠的,適用于后續(xù)苔草屬的ISSR分析。

2.9 親緣關系分析

2.9.1引物多態(tài)性分析 從100條ISSR通用引物中篩選出12條引物,共擴增出197條清晰條帶,全部為多態(tài)性條帶。每個引物平均擴增出16.4個條帶,多態(tài)性百分比為100%,其中,擴增出來的多態(tài)性條帶最多為引物U807,數(shù)量為22條,擴增出來的多態(tài)性條帶數(shù)最少為引物U868和引物U873,數(shù)量為13條(表7),進一步證實了苔草屬植物變異較廣,且具有豐富的遺傳度。部分擴增結果見圖8、圖9。

圖7 ISSR-PCR優(yōu)化反應體系的驗證Fig.7 Verification of ISSR-PCR optimized reaction system注：1,寬葉苔草;2,矮叢苔草;3,白鱗苔草;4,早春苔草Note：1,C. siderosticta;2,C. callitrichos var.nana;3,C. pisiformis;4,C. subpediformi

表7 12條引物在苔草屬植物中的多態(tài)性分析Table 7 Polymorphism of tested Carex species in 12 ISSR primers

2.9.2親緣關系分析 使用POPGENE對苔草的有效等位基因數(shù)(Ne)、基因多樣性(He)、多樣性信息指數(shù)(I)進行分析,結果分別為1.153 8,0.125 7,0.236 6。

使用NTsys對人工讀帶的0,1矩陣進行分析,利用非加權平均法(UPGMA)得到苔草屬的聚類分析圖(圖10),絕大部分材料都能得到良好的劃分,僅長鞭苔草、多刺苔草不能做到有效區(qū)分。在遺傳距離為0.768處,53份苔草屬種質可初步被分成6大類,與苔草屬下的分組有一定關聯(lián)。

第Ⅱ類由糙葉苔草與索蘭德苔草組成,原產于中國和新西蘭,分別屬于苔草亞屬沼生苔草組和苔草亞屬(Carexsubg.Carex),兩種苔草的小穗單性,常具1～4個雄小穗,其余小穗為雌小穗,雌花鱗片棕色,三棱形,但二者在形態(tài)上也有一定區(qū)別,索蘭德苔草的葉寬為0.1～0.2 cm,基部小穗有較長柄,果囊淺棕或深棕色;糙葉苔草的葉寬為0.2～0.4 cm,基部小穗常無柄,果囊淡黃綠色。

圖8 引物U840的部分PCR擴增電泳圖譜Fig.8 The electrophoretogram of PCR amplified patterns by ISSR primer U840

第Ⅲ類僅有柄苔草一種,屬于苔草亞屬中脹囊苔草組。第Ⅳ類僅有三裂苔草,屬于苔草亞屬(Carexsubg.Carex)。第Ⅴ類由紅穗苔草和矮叢苔草組成,屬于苔草亞屬中沼生苔草組和指狀苔草組,兩種苔草的小穗單性,雌雄同株,果囊較小,果囊無喙或有短喙,喙口部截形或微凹,這兩種苔草的花序高度和形態(tài)不同,紅穗苔草的花序長于葉片,花序上部1～3個為雄小穗,雌花鱗片暗粟色;矮叢苔草花序短于葉片,常隱藏于葉叢中,頂生1個雄小穗,雌花鱗片中間綠色,兩側栗紫色。第Ⅵ類僅有麻根苔草,屬于苔草亞屬中膜囊苔草。

圖9 引物U876的部分PCR擴增電泳圖譜Fig.9 The electrophoretogram of PCR amplified patterns by ISSR primer U876

其余46個材料皆屬于第Ⅰ類,同時包括二柱亞屬(Carexsubg.Vignea)、苔草亞屬(Carexsubg.Carex)和二柱苔草亞屬中烈味苔草組和藪苔草組、苔草亞屬中苔草組、寬葉苔草組、溪水苔草組等,二柱亞屬(Carexsubg.Vignea)和苔草亞屬(Carexsubg.Carex)為Villaverde等對苔草屬亞屬進行重新分類得出的新亞屬,二柱亞屬(Carexsubg.Vignea)形態(tài)特征為小穗2至多數(shù),兩性,聚集成穗狀花序,柱頭通常2個,與二柱苔草亞屬的形態(tài)相似,苔草亞屬(Carexsubg.Carex)形態(tài)特征為小穗通常單性,雌雄同株,柱頭3個,與苔草亞屬形態(tài)相似。且原產于不同國家的苔草聚在一起,表明地域性特點不突出。

3 討論

12條引物對53種苔草屬植物材料中共擴增出197個位點,多態(tài)性位點占100%,平均基因遺傳多樣性指數(shù)為0.1257 ,其中,33種河北省野生苔草屬植物的平均遺傳多樣性指數(shù)為0.140 7,雖略低于山東省苔草種質[14],但整體上高于目前市面上較為流行的栽培種質。33種河北省野生苔草屬植物在引種后發(fā)現(xiàn),絕大部分都具有良好的適應性,雖在觀賞特性上遜色于部分園藝品種,但仍有潛力用于后續(xù)開發(fā)成為良好的鄉(xiāng)土植物,并結合一定育種手段篩選極具觀賞特性的種質。

本研究收集了29種《河北省植物志》(1991)包含的苔草種質,與《河北省植物志》相比新增了4種苔草屬植物,分別是扁囊苔草、干生苔草、灰脈苔草、瘤囊苔草,對于這4份苔草種質的鑒定均參考了《內蒙古植物志》。灰脈苔草、黃囊苔草等6種苔草為黃金祥等[15]在塞罕壩地區(qū)發(fā)現(xiàn)的新分布。新增材料全部是在河北省承德市塞罕壩北部壩上地區(qū)調查時發(fā)現(xiàn),該地區(qū)與內蒙古交界,壩上屬于內蒙古高原的東南緣[16],交界地區(qū)氣候特點相似,具有相同的生境。且灰脈苔草與瘤囊苔草均屬于苔草亞屬中急尖苔草組,在形態(tài)學分類上關系較近,僅苞片與果囊不同。干生苔草與黃囊苔草同屬于苔草亞屬中黃囊苔草組,僅果囊形態(tài)與顏色略有不同,在以前的種質鑒定中有可能將其誤判。Villaverde等[17]利用轉錄組測序對苔草屬亞屬的分類進行檢驗并重新分類,得到六個亞屬分支：(1)寬葉亞屬(Carexsubg.Siderostica);(2)蚤苔草亞屬(Carexsubg.Psyllophorae);(3)尖苞亞屬(Carexsubg.Euthyceras);(4)鉤穗苔亞屬(Carexsubg.Uncinia);(5)二柱亞屬(Carexsubg.Vignea);(6)苔草亞屬(Carexsubg.Carex),《中國植物志》將苔草屬分為二柱苔草亞屬、苔草亞屬和復序苔草亞屬。我國目前對苔草屬下的分類是依據(jù)形態(tài)學進行分類,對于全國苔草屬植物分子標記的系統(tǒng)分類還不完整,苔草屬內鑒定與分類工作還需進行。

圖10 53種苔草屬植物遺傳距離的ISSR聚類圖Fig.10 ISSR dendrogram of 53 species of Carex

植物的交配方式中很少為單純的自交或異交[18]。苔草屬植物的小穗有兩性和單性的區(qū)別,在兩性小穗中又可分為雄雌順序和雌雄順序,小穗開花時雌花先成熟,雄花花藥散粉后,花粉幾乎全部灑落在雌花柱頭上,這種特征極大的增加了自交的概率[19]。長期的自交或近交會降低種群的遺傳多樣性[20]。在對苔草屬植物進行野外調查時發(fā)現(xiàn)其生境相似,大多分布在林下、水邊等。其小穗開花數(shù)目多,且花粉粒體積小、質量輕、較干燥有利于隨風傳播,以風作為授粉媒介[21]。苔草屬植物也具有易雜交的特性[22],因此,在同一生境下,花期相遇的近緣種可能會產生自然雜交,導致種間遺傳多樣性降低,日本[23]、烏克蘭[24]、新西蘭[25]等國家均發(fā)現(xiàn)苔草屬植物的天然雜交種。但自然環(huán)境因素、氣候因子、人為因素也是影響遺傳分化的重要因素[26]。

根據(jù)位點分析得到的UPMGA聚類圖可將53份供試材料分為6大類,苔草屬植物分子標記聚類結果與傳統(tǒng)聚類結果基本相符,但兩者也存在一定程度的分歧,傳統(tǒng)聚類方式是依據(jù)形態(tài)學性狀對其分類,形態(tài)學性狀是由基因與環(huán)境共同調控的,而分子標記的結果直接反應供試材料基因水平差異[27]。荷蘭引種的‘寶藏島’‘小矮人’與德國引種的多花苔草、索蘭德苔草分別與河北省野生苔草屬材料遺傳距離較近,其原因可能是苔草的遺傳多樣性與原產地分布沒有顯著差異,符合劉凌云等[28]得出地域對苔草的遺傳多樣性沒有顯著差異的規(guī)律。對于一些親緣關系較近的種質,很多分子標記難以對其進行區(qū)分,本研究使用的ISSR引物為通用引物,顯示的結果會存在部分偏差。篩選出的12條引物可以將河北省野生苔草區(qū)分開,但是對于部分國外栽培種質區(qū)分不開,其中長鞭苔草與多刺苔草的遺傳距離為1,但是兩者小穗的形態(tài)和結構完全不同,因此在實際應用中需將形態(tài)學標記與分子標記充分結合才能對苔草屬的分類進行更加準確的描述或區(qū)分。

4 結論

本研究首次建立并優(yōu)化了適用于河北省野生苔草屬的ISSR-PCR反應體系。25 μL反應體系采用模板DNA用量80 ng,引物濃度5 μmol·L-1,Master Mix用量11 μL,循環(huán)數(shù)48個。12條ISSR引物擴增出197條清晰明亮的條帶,全部為多態(tài)性條帶?？捎行^(qū)分33種河北省野生苔草。在遺傳距離為0.768時可將53份苔草種質劃分為6類,聚類結果與形態(tài)學分類的結果基本吻合,種間親緣關系與地理環(huán)境有一定的相關性。本研究從分子角度上為苔草屬植物的分類鑒定、構建指紋圖譜及育種等提供了理論參考。