石志群 李 琳 張 潔 蔡 楠 田貽婷 馬慧萍

(1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院藥劑科全軍高原醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730050) (2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所,北京 100700)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)氧非常敏感,高原低壓低氧環(huán)境會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成一定的損傷,嚴(yán)重影響進(jìn)入高原人群的認(rèn)知能力,并引發(fā)多種嚴(yán)重的病理變化,如大腦麻痹、反應(yīng)延遲、學(xué)習(xí)能力與記憶力減退、癲癇,以及失眠頭暈情緒改變等多種精神紊亂[1]。海拔5 000 m以上的慢性缺氧會(huì)對(duì)人腦造成神經(jīng)性損傷,在返回低海拔區(qū)域之后損傷甚至?xí)掷m(xù)一年以上,即使是急性減壓1 h,人的短期記憶也會(huì)衰退[2]。

前期實(shí)驗(yàn)表明[3],本課題組采用低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙模擬高原缺氧環(huán)境對(duì)小鼠腦組織造成了嚴(yán)重的缺氧損傷,神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變、為腦組織提供能量的線(xiàn)粒體數(shù)量大幅度減少,有氧呼吸所依靠的嵴消失,線(xiàn)粒體破裂,還引起腦組織各項(xiàng)生化指標(biāo)的改變,對(duì)腦組織的正常功能造成了一定影響。為進(jìn)一步研究雪蓮黃酮膠囊對(duì)急性高原缺氧腦組織的保護(hù)能力,本實(shí)驗(yàn)選擇Morris水迷宮作為評(píng)價(jià)腦損傷小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力,并檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位及復(fù)合物活力、缺氧相關(guān)基因蛋白的表達(dá)情況,從行為學(xué)及基因表達(dá)方面評(píng)價(jià)雪蓮黃酮膠囊對(duì)急性高原病的防治能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠80只,體質(zhì)量18～22 g,購(gòu)自蘭州生物制品有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)【SCXK(甘)2017-0001】,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)【SYXK(軍)2017-0047】,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理遵守聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院審批,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批號(hào):2015GKJ017。

1.1.2試劑與儀器:乙酰唑胺(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司);雪蓮黃酮膠囊(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院);BCA蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所);線(xiàn)粒體膜電位試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);RNAiso Reagent、TaKaRa Prime ScriptTM reagent Kit、PCR擴(kuò)增試劑盒(均為大連寶生物公司),引物委托寶生物工程公司合成;HIF-1α抗體、VEGF抗體、SOD抗體(均為Abcam公司);Western BrightTM ECL(Advansta公司);DYC-3070型低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(中航工業(yè)貴州雷航空軍械有限責(zé)任公司);SpectraMax i3全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司);HP8453二級(jí)管陣列紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(惠普公司);蛋白電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(伯樂(lè)公司);Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理:取SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠共80只,飼養(yǎng)適應(yīng)3 d后隨機(jī)分成正常組(N)、模型組(M)、乙酰唑胺組(ACZ,250 mg/kg)和雪蓮黃酮膠囊組(XLJN,500 mg/kg),每組20只,單次灌胃給藥。正常組小鼠不缺氧,其余各組小鼠給藥50 min后放入模擬8 000 m海拔環(huán)境,維持缺氧9 h,小鼠完成減壓后每組隨機(jī)取10只進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練,剩下的收集腦組織,-80 ℃冰箱凍存,待用。

1.2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):將水迷宮分為4個(gè)象限,在第二象限放置一平臺(tái),進(jìn)行空間學(xué)習(xí)訓(xùn)練,并記錄小鼠潛伏時(shí)間與游泳路徑。第6天上午進(jìn)行定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn),撤離平臺(tái),將小鼠面向池壁從原平臺(tái)的對(duì)側(cè)象限入水點(diǎn)放入水中,記錄60 s內(nèi)小鼠的游泳軌跡、總搜索路程、原平臺(tái)位置穿越次數(shù)、原平臺(tái)象限進(jìn)入次數(shù)。

1.2.3線(xiàn)粒體膜電位的測(cè)定:取各組小鼠腦組織0.1 g左右,切碎,加入10倍量分離緩沖液[4],放置在盛有冰水混合物的器皿中充分研磨,使組織勻漿化,3 000 r/min離心2 min,棄沉淀,上清液以12 000 r/min離心,棄去上清,沉淀加入0.25 mmol/L蔗糖得到線(xiàn)粒體重懸液,按說(shuō)明書(shū)操作使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)量。

1.2.4線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ功能的測(cè)定:線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體 Ⅰ 功能測(cè)定:NADH + CoQ + H+→ NAD++ CoQH2,測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[4],30 ℃孵育5 min;600 nm連續(xù)掃描2 min。線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體 Ⅱ 功能測(cè)定:琥珀酸 + CoQ + H+→ 延胡索酸+ CoQH2,測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5],30 ℃孵育5 min,600 nm掃描2 min。線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體 Ⅲ 功能測(cè)定:CoQH2+ 2 ferricytochrome C→ CoQ + 2 ferrocytochrome C+2 H+,測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6],30 ℃孵育5 min,550 nm掃描2 min。

1.2.5RT-PCR測(cè)定mRNA表達(dá)水平:向缺氧后的小鼠腦組織中加入1 mL RNAiso Plus試劑研磨,加200 μL三氯甲烷,混勻后離心棄上清液,用75%乙醇溶液純化總RNA沉淀,再次離心棄上清進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,具體步驟參照PrimeScriptTM RT reagent Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Real-time PCR檢測(cè):步驟依照Applied Biosystems公司7300儀器說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件如下:兩步法PCR擴(kuò)增,95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃反應(yīng)5 s,60 ℃退火31 s,40個(gè)循環(huán)。引物及序列見(jiàn)表1。

表1 Real- time RT- PCR引物序列Table 1 Real-time RT-PCR primer sequences

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定HIF-1α、VEGF、SOD蛋白的表達(dá):取小鼠腦組織,按照配方提取腦組織蛋白,BCA法對(duì)總蛋白濃度進(jìn)行定量,加入上樣緩沖液,混勻,沸水煮5 min使蛋白變性。采用SDS-PAGE進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和抗體孵育。次日配制ECL發(fā)光液,進(jìn)行顯影,用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 雪蓮黃酮膠囊對(duì)低壓低氧模型小鼠行為學(xué)的影響

2.1.1空間學(xué)習(xí)結(jié)果:與正常組相比,缺氧模型組在第3天訓(xùn)練后,潛伏時(shí)間明顯延長(zhǎng),游泳路徑雜亂無(wú)序。與模型組相比,雪蓮黃酮膠囊組和乙酰唑胺組均可縮短潛伏時(shí)間,且具有顯著性差異。潛伏時(shí)間變化見(jiàn)表2,游泳路徑變化見(jiàn)圖1(以第1天和第5天為例)。

圖1 雪蓮黃酮膠囊對(duì)低壓低氧模型小鼠水迷宮游泳路徑變化的影響Fig.1 Effect of Saussurea flavone capsule on swimming path changes in water maze in low-pressure and hypoxic mice

表2 雪蓮黃酮膠囊對(duì)低壓低氧模型小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)潛伏時(shí)間的影響Table 2 Effect of Saussurea flavone capsule on latency time of water maze test in low-pressure and hypoxic

2.1.2運(yùn)動(dòng)路徑與距離的影響:與正常組相比,模型組進(jìn)入原平臺(tái)所在象限的次數(shù)減少,有效象限中的運(yùn)動(dòng)距離百分比縮短(P<0.05)。雪蓮黃酮膠囊組小鼠進(jìn)入有效象限的次數(shù)、運(yùn)動(dòng)距離百分比均顯著高于模型組(P<0.01),且與正常組無(wú)顯著性差異。乙酰唑胺也可提高小鼠在有效象限的運(yùn)動(dòng)百分比,但在次象限的運(yùn)動(dòng)距離與模型組相比并無(wú)顯著差異,如表3所示。

表3 雪蓮黃酮膠囊對(duì)有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)路徑與距離的影響Table 3 Effect of Saussurea flavone capsule on movement path and distance in effective region

2.1.3穿越平臺(tái)情況的影響:與正常組相比,模型組小鼠進(jìn)入有效區(qū)域次數(shù)、穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.05)。雪蓮黃酮膠囊組有效區(qū)域次數(shù)、穿越平臺(tái)次數(shù)均顯著高于模型組(P<0.05),與正常組無(wú)顯著性差異,如表4所示。

表4 定位航行實(shí)驗(yàn)有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)Table 4 Entry times of effective area for

2.2 雪蓮黃酮膠囊對(duì)低壓低氧模型小鼠腦組織線(xiàn)粒體膜電位的影響

與正常組膜電位(0.442±0.027)相比,模型組線(xiàn)粒體膜電位(0.281±0.022)下降,線(xiàn)粒體膜電位去極化程度增強(qiáng),線(xiàn)粒體膜電位降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比,乙酰唑胺組(0.384±0.057)和雪蓮黃酮膠囊組(0.407±0.031)的線(xiàn)粒體膜電位上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

2.3 雪蓮黃酮膠囊對(duì)低壓低氧模型小鼠腦組織線(xiàn)粒體復(fù)合物電位的影響

與正常組相比,模型組腦組織線(xiàn)粒體復(fù)合物I的活性顯著降低,復(fù)合物Ⅱ缺氧后無(wú)顯著變化,復(fù)合物Ⅲ活力降低但與正常組相比無(wú)顯著性差異;與模型組相比,乙酰唑胺與雪蓮黃酮膠囊預(yù)防給藥組的復(fù)合物I活性與模型組相比顯著提高(P<0.01),乙酰唑胺與雪蓮黃酮膠囊預(yù)防給藥未能使復(fù)合物Ⅱ、復(fù)合物Ⅲ的活性發(fā)生顯著變化,如表5所示。

表5 雪蓮黃酮膠囊對(duì)腦組織線(xiàn)粒體復(fù)合物的影響Table 5 Effect of Saussurea flavone capsule on mitochondrial complex in brain

2.4 雪蓮黃酮膠囊對(duì)低壓低氧模型小鼠腦組織缺氧相關(guān)mRNA的影響

與正常組相比,缺氧小鼠腦組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)水平顯著提高,SOD mRNA、CAT mRNA水平顯著提降低(P<0.01);與缺氧模型組相比,雪蓮黃酮膠囊組和乙酰唑胺組腦組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)水平均有所下降,SOD、CAT mRNA表達(dá)水平均有所提高(P<0.01)(表6)。

表6 雪蓮黃酮膠囊對(duì)模擬高原缺氧小鼠心肌組織HIF-1α、VEGF、SOD、CAT mRNA的影響Table 6 Effects of Saussurea flavone capsule on HIF-1α,VEGF, SOD, CAT mRNA in myocardial tissue of mice with simulated altitude

2.5 雪蓮黃酮膠囊對(duì)低壓低氧模型小鼠腦組織缺氧相關(guān)蛋白含量的影響

與正常組相比,缺氧模型組小鼠腦組織HIF-1α、VEGF含量顯著提高,SOD含量顯著降低(P<0.01,P<0.05);與缺氧模型組相比,雪蓮黃酮膠囊組和乙酰唑胺組小鼠腦組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01,P<0.05),SOD蛋白表達(dá)顯著提高(P<0.01)(圖2,表7)。

圖2 雪蓮黃酮膠囊對(duì)缺氧小鼠腦組織缺氧相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoretic diagram of hypoxic-related protein expression in brain tissues of hypoxic mice induced by Saussurea flavone capsules

表7 雪蓮黃酮膠囊對(duì)模擬高原缺氧小鼠腦組織缺氧相關(guān)蛋白表達(dá)量的比較Table 7 Comparison of brain tissues hypoxic-related protein expression levels of Saussurea flavone capsules in mice with simulated altitude

3 討論

在高原環(huán)境下,氧分壓隨海拔升高而降低,進(jìn)而形成天然的低壓低氧環(huán)境。這一獨(dú)特的環(huán)境特點(diǎn),對(duì)于高原值守作業(yè)的部隊(duì)官兵以及工作、生活的人們來(lái)說(shuō),時(shí)常要面臨缺氧的風(fēng)險(xiǎn),影響人們觀察、感知、記憶、思維等方面,更嚴(yán)重會(huì)造成反應(yīng)遲緩、記憶困難、注意力下降等,最終造成大腦不可逆性損傷[7]。缺氧條件下,神經(jīng)元細(xì)胞的線(xiàn)粒體數(shù)量減少,線(xiàn)粒體膜腫脹、破損,呼吸鏈電子傳遞發(fā)生障礙,進(jìn)而酶活性受到抑制,致使ATP合成減少、自由基產(chǎn)生增多,造成神經(jīng)元壞死或凋亡,從而出現(xiàn)臨床認(rèn)知功能下降[8]。水迷宮行為學(xué)表明,模型組小鼠學(xué)習(xí)能力顯著降低,空間記憶力受損,線(xiàn)粒體膜電位去極化程度增強(qiáng),線(xiàn)粒體膜電位降低,線(xiàn)粒體復(fù)合物I活性顯著降低,復(fù)合物Ⅱ缺氧后無(wú)顯著變化,復(fù)合物Ⅲ活力降低但與正常組相比無(wú)顯著性差異;而乙酰唑胺或雪蓮黃酮膠囊預(yù)防給藥后,小鼠的學(xué)習(xí)能力與模型組相比明顯提高,線(xiàn)粒體膜電位升高,復(fù)合物I活性與模型組相比顯著提高,復(fù)合物Ⅱ、復(fù)合物Ⅲ的活性未發(fā)生顯著變化,表明雪蓮黃酮膠囊可減輕過(guò)量自由基造成的損傷,維持ATP酶活性,從而防止高原病的發(fā)生,對(duì)低壓低氧所造成的腦認(rèn)知損傷具有良好的預(yù)防保護(hù)作用。

缺氧誘導(dǎo)因子-l(HIF-1)是高度特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子,是專(zhuān)一調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵介質(zhì)[11],其作為活性氧受體,感受環(huán)境中的低氧程度,同時(shí)又對(duì)起效應(yīng)器作用的低氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用[12]。表皮生長(zhǎng)因子(VEGF)為HIF-1的下游基因,它的增多使毛細(xì)血管通透性增強(qiáng),水腫加重[13]。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)缺氧相關(guān)基因,缺氧可造成腦組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)明顯升高,而雪蓮黃酮膠囊可使HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)降低,說(shuō)明雪蓮黃酮膠囊通過(guò)降低小鼠腦對(duì)于缺氧的敏感性,延緩組織水腫來(lái)抵抗缺氧造成的損傷。SOD與CAT是機(jī)體清除自由基的主要酶,是抗缺氧能力的重要指標(biāo)。缺氧可造成模型組SOD、CAT mRNA表達(dá)與蛋白含量降低,而雪蓮黃酮膠囊給藥后,缺氧小鼠的SOD、CAT mRNA表達(dá)、蛋白含量顯著提高,證明其能夠通過(guò)增加缺氧小鼠腦SOD與CAT的含量,提高腦組織的抗氧化能力。

綜上所述,雪蓮黃酮膠囊對(duì)低壓性缺氧小鼠所造成的腦認(rèn)知損傷具有良好的預(yù)防保護(hù)作用,其保護(hù)機(jī)制可能與影響HIF-1α、VEGF mRNA的表達(dá)、線(xiàn)粒體調(diào)節(jié)、小鼠組織內(nèi)部氧平衡、血管生成、提高抗氧化酶含量有關(guān)。