王紅義 馮小明 李淵明 肖 攀 陸 璐 申棟帥 牛廷獻(xiàn) 張 萍

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730050)(2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,蘭州 730046) (3.甘肅省中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,蘭州 730070)(4.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院檢驗(yàn)科,蘭州 730050)

多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)指在重度創(chuàng)傷性感染、手術(shù)應(yīng)激、大面積燒傷等病理因素的刺激下,多個重要器官24 h以內(nèi)相繼發(fā)生功能性障礙或衰竭,最終引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡紊亂的一類疾病[1]。MODS具有發(fā)病急、進(jìn)展快及病理機(jī)制復(fù)雜等特點(diǎn),涉及免疫體系失衡、過氧化物及內(nèi)源性血管活性介質(zhì)的異常釋放等病理特征[2]。參附注射液是臨床用之有效的中藥制劑,主要有效成分為烏頭堿及人參皂苷[3],藥理學(xué)研究顯示[4],其活性成分能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)失衡,提高機(jī)體免疫功能。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein, HMGB1)通過加速調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg cell)的凋亡速率和抑制單核細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的分泌而阻斷炎性反應(yīng)與凝血障礙的惡性循環(huán),而中藥血必凈主要是通過抑制HMGB1而達(dá)到改善機(jī)體炎性反應(yīng)、免疫和凝血功能,防止膿毒癥的發(fā)生發(fā)展[5-6]。本研究以高海拔地區(qū)MODS綿羊?yàn)槟Ｐ?探討參附注射液聯(lián)合中藥血必凈對MODS血漿中血清降鈣素原(plasma calcitonin, PCT)和MHC-II類分子(human leukocyte antigen DR, HLA-DR)的影響,為參附注射液聯(lián)合中藥血必凈的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF級1歲齡綿羊24只,購自蘭州雄振羊業(yè)養(yǎng)殖廠,雌雄各半,體質(zhì)量5～7 kg,全部飼養(yǎng)于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心大動物房,設(shè)施使用許可證號【SYXK(軍)2009-022】,溫度(20±2)℃、濕度(50±5)%。麻醉藥物為速眠新Ⅱ號(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所),內(nèi)毒素(LPS,血清型號為0127:B8,批號為64H4010,Sigma公司),參附注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司,批號 991201),血必凈注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字Z20040033,規(guī)格:10 mL×5支/盒),化學(xué)發(fā)光分析儀(Brahms公司,Lumat LB 9507)。

1.2 方法

1.2.1模型建立與分組處理:方法參照文獻(xiàn)[3]制作MODS模型,除正常組外,其余18只綿羊均用速眠新Ⅱ號(1.5 mL/kg)肌內(nèi)注射麻醉后經(jīng)前肢橈靜脈泵入LPS(6 μg/kg,30 min)制作MODS模型,并隨機(jī)分為模型組、觀察1組及觀察2組,每組6只。觀察1組在常規(guī)綜合治療基礎(chǔ)上應(yīng)用參附注射液100 mL,微量泵以 20 mL/h 連續(xù)靜脈泵入,1次/日。觀察2組在常規(guī)綜合治療基礎(chǔ)上應(yīng)用參附注射液聯(lián)合靜脈滴注(Xuebijing,XBJ)(2 mL/kg),1次/日,觀察1組和觀察2組皆以1周為1療程,共計(jì)1療程。本文動物實(shí)驗(yàn)過程均嚴(yán)格按照“3R”原則設(shè)計(jì)和操作,方案通過中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院科研倫理委員會審查,倫理審批號:2022KYLL019。

1.2.2檢測指標(biāo)與方法

1.2.2.1 PCT水平檢測:采取靜脈血后離心取血清,半定量膠體金免疫結(jié)合法測定血清PCT水平。

1.2.2.2 HLA-DR水平檢測:靜脈血EDTA 抗凝,制備單核細(xì)胞懸液,測定細(xì)胞濃度,向反應(yīng)管中加入50 μL細(xì)胞懸液,再加入HLA-DR 單克隆抗體(北京博爾邁生物有限公司)10 μL,冰浴避光反應(yīng)30～45 min,再經(jīng)過洗滌、固定后懸浮待測,使用FACScan 流式細(xì)胞儀(北京御儀都環(huán)境科技有限公司)檢測陽性細(xì)胞率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 模型建立體征表現(xiàn)及死亡率

模型組綿羊靜脈泵入LPS 2 h后,出現(xiàn)呼吸困難并且頻率加快,心率快而不齊,心律失常、3 h后腹脹,尿頻,不能站立,運(yùn)動障礙,12和16 h分別有2只羊因呼吸窘迫、心衰而死亡。觀察1組和觀察2組較模型組在注入LPS后也出現(xiàn)不同程度的呼吸困難并且頻率加快、心律失常、腹脹、尿頻,所有羊均出現(xiàn)不能站立,運(yùn)動障礙等問題。其中觀察1組和觀察2組分別在20和24 h有1只羊死亡,其他羊在24 h后其體征表現(xiàn)較模型組明顯減輕。結(jié)果表明,參附注射液和聯(lián)合血必凈能明顯改善LPS誘導(dǎo)的動物體征表現(xiàn)、降低MODS死亡率。

2.2 MODS綿羊血漿PCT水平檢測比較

MODS綿羊建模成功后,模型組、觀察1組及觀察2組血漿PCT比較,F=0.430,P>0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但與正常組比較血漿PCT水平顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療0.5、1、2、3、7 d后模型組與觀察1組比較,血漿PCT水平明顯降低(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與觀察1組比較,觀察2組PCT下降水平更為顯著,尤其是治療12 h后,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組MODS綿羊血漿 PCT 水平檢測比較Table 1 Comparison of plasma PCT levels in MODS sheep among different groups (EU/mL,

表2 各組MODS綿羊血漿HLA-DR水平比較Table 2 Comparison of plasma HLA-DR levels in MODS sheep among different groups (EU/mL,

2.3 MODS綿羊血漿HLA-DR水平檢測比較

MODS綿羊建模成功后,模型組、觀察1組及觀察2組血漿HLA-DR比較,F=1.410,P>0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但與正常組比,較血漿HLA-DR水平顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組、觀察1組及觀察2組治療后12 h, 血漿HLA-DR水平檢測,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但治療后1、2、3、7 d,模型組、觀察1組和觀察2組血漿HLA-DR水平均依次升高,組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與觀察1組比較,觀察2組0.5、1、2、3、7 d血漿HLA-DR水平依次升高(P<0.05),見表 2。

3 討論

MODS是由體內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-8等炎性因子介導(dǎo)的全身自我破壞性炎性反應(yīng)過程,是眾多致命性感染疾病的終末階段[8]。當(dāng)機(jī)體受到嚴(yán)重感染(創(chuàng)傷、燒傷、胰腺炎、休克)時機(jī)體HMGB1含量升高,廣泛參與到T細(xì)胞增殖分化、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)等病理生理過程中,促進(jìn)炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等廣泛浸潤,血管內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞被激活并釋放大量介質(zhì)作用于全身重要器官誘發(fā)SIRS,而免疫系統(tǒng)由于延續(xù)效應(yīng)對持續(xù)升高的細(xì)胞因子處于麻痹和抵抗?fàn)顟B(tài),機(jī)體免疫應(yīng)答受到抑制[9-10]。

參附注射液是從傳統(tǒng)中藥人參和附子中提取有效成分而制成的,具有“回陽救逆、益氣固脫”的作用,人參為大補(bǔ)元?dú)?、培固后天之?附子可溫壯元陽,回陽固脫,兩藥相配共達(dá)救逆回陽、溫陽益氣之功效[11]。有關(guān)研究[12-14]表明,參附注射液能降低MODS模型大鼠血漿HMGB1表達(dá),抑制T淋巴細(xì)胞分化速率及降低花生四烯酸和肌酸水平,從而有效調(diào)節(jié)了機(jī)體血管內(nèi)皮增殖及血液動力學(xué)變化,糾正并預(yù)防臟器功能衰竭的發(fā)生。本研究中觀察1組MODS模型組綿羊治療后0.5、1、2、3、7 d后血漿PCT水平明顯降低、尤其是治療后12 h變化最為明顯(P<0.01),提示參附注射液對MODS模型綿羊的治療效果明顯。血必凈注射液是由王今達(dá)教授以王清任活血化瘀名方血府逐瘀湯組方為基礎(chǔ),并辨證加減化裁而研制的中藥靜脈制劑,其中有效成分為紅花、赤芍、丹參等提取物,包括紅花黃色素A、川芎嗪、阿魏酸等,該注射劑具有活血化瘀、清熱解毒的功效,可抑制MODS炎性介質(zhì)的彌漫性浸潤,內(nèi)毒素的釋放及清除體內(nèi)氧自由基而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[15-16]。血必凈通過抑制T淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)集聚而釋放炎性介質(zhì)、抑制肺上皮細(xì)胞過度活化而導(dǎo)致肺功能障礙,減少氧自由基釋放而對急性肺損傷有一定的保護(hù)作用[17]。

PCT為降鈣素蛋白質(zhì)的前體,易被LPS、病原菌等受體識別,介導(dǎo)全身炎性反應(yīng),是檢測機(jī)體炎性感染的重要檢測指標(biāo)[18]。生理情況下機(jī)體血清中 PCT含量極低,而LPS誘導(dǎo)的MODS綿羊通過激活TLR信號通路釋放多種細(xì)胞因子,廣泛浸潤導(dǎo)致局部炎性反應(yīng)加劇,而且PCT 較其他細(xì)胞因子產(chǎn)生及釋放更早。國內(nèi)研究指出對于感染性休克等重度感染疾病,PCT診斷的特異性要優(yōu)于腫瘤壞死因子TNF-α、白細(xì)胞介素IL-6 等指標(biāo)[19]。在本研究中MODS綿羊建模成功后,模型組、觀察1組、觀察2組血漿PCT比較,治療0.5、1、2、3、7 d后模型組與觀察1組比較,血漿PCT水平明顯降低(P<0.05),與觀察1組比較,觀察2組下降水平更為明顯,尤其是治療12 h后(P<0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此參附注射液聯(lián)合血必凈可以抑制和控制過強(qiáng)的全身炎性反應(yīng),保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)從而防治多臟器功能障礙綜合征,重建免疫平衡。HLA-DR是體內(nèi)表達(dá)水平最高的組織相溶性抗原MHC,MHC類抗原在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的抗原遞呈作用,一方面發(fā)揮誘導(dǎo)和增強(qiáng)免疫應(yīng)答的作用,另一方面如果HLA-DR的體內(nèi)表達(dá)水平減少或抗原遞呈作用受到阻礙,機(jī)體就不能產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答,從而導(dǎo)致多臟器功能的障礙[20]。與本研究中得出的結(jié)論是相一致的,即治療后24 和48 h,對照組、觀察1組和觀察2組血漿 HLA-DR水平均依次升高(P<0.05)。

綜上所述,單獨(dú)注射參附注射液或參附注射液和血必凈聯(lián)用均可顯著降低血漿PCT水平、升高HLA-DR水平,表現(xiàn)出良好的對高海拔地區(qū)內(nèi)毒素致綿羊多臟器功能障礙綜合征的治療前景。此外,參附注射液和血必凈聯(lián)合注射相比單獨(dú)注射參附注射液對上述兩項(xiàng)指標(biāo)作用更加顯著,說明兩藥聯(lián)用是針對高海拔地區(qū)內(nèi)毒素致綿羊多臟器功能障礙綜合征的一種更優(yōu)用藥方案,為該綜合征的治療提供新的用藥思路。