高雯琬 王鵬森 楊伏萍 廖傳玉 黃正谷 陳玉 李曉旭 韓梅 李同心

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)是機(jī)會(huì)致病病原體。最近幾年,NTM感染導(dǎo)致的非結(jié)核分枝桿菌肺病(NTM-PD)在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家和低負(fù)擔(dān)國家的患病率都急劇升高,NTM-PD正在成為一種具有全球威脅性的疾病[1-3]。由于多種因素的影響,在臨床上完全區(qū)分NTM-PD與肺結(jié)核是具有挑戰(zhàn)性的,這將導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)目菇Y(jié)核治療[4]。因此,準(zhǔn)確鑒別分枝桿菌的種類對(duì)患者的診斷和治療至關(guān)重要。此外NTM分布具有地理多樣性,在中國南方地區(qū)流行率高,北方地區(qū)流行率低[2]。雖然已有研究分析了NTM的流行情況和風(fēng)險(xiǎn)因素[5-7],但每個(gè)國家和地區(qū)由于自然環(huán)境以及人群生活習(xí)慣等不同,可能還是會(huì)產(chǎn)生差異。因此,本研究將探索重慶及周邊地區(qū)的716例痰涂片抗酸染色陽性患者中非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定情況及其宿主風(fēng)險(xiǎn)因素。

資料與方法

一、臨床資料

收集2020年1月到2020年6月在重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心收治的716例痰涂片抗酸染色陽性患者的臨床資料,包括住址、性別、年齡、結(jié)核病史和是否具有其他病癥(HIV、COPD、肝炎、糖尿病和腫瘤)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)不設(shè)年齡限制。(2)患者的痰涂片抗酸染色陽性,并均具有呼吸道不適癥狀。(3)影像學(xué)表現(xiàn):肺部有陰影,和(或)鈣化、滲出、增殖、結(jié)節(jié)、空洞、淋巴結(jié)腫大等。(4)NTM的診斷參考《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療指南(2020年版)》[8]和《NTM病治療指南》[9],即從同一患者的兩份痰液標(biāo)本中是否分離出相同的菌種,來判斷NTM為定植菌還是致病菌。肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis, PTB)診斷參照國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布的現(xiàn)行肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 288—2017)。排除標(biāo)準(zhǔn):菌種鑒定為MTB/NTM雙重感染的患者和NTM為定植菌的患者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019-015-01-KY)。

二、研究方法

采用廈門致善生物科技公司生產(chǎn)的NTM菌株分型試劑盒(熒光PCR溶解曲線法)對(duì)716例患者連續(xù)兩次間隔24小時(shí)的晨痰標(biāo)本進(jìn)行菌種鑒定。按試劑說明書進(jìn)行操作。采用廠家配套的提取試劑盒對(duì)患者痰液進(jìn)行核酸提取,取25 μL核酸提取物或陰陽性質(zhì)控對(duì)照品至預(yù)干粉PCR反應(yīng)管中,蓋緊PCR八連管管蓋。瞬時(shí)離心數(shù)秒,進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析。PCR反應(yīng)體系為25 μL,具體擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?UNG酶處理50 ℃,2 min;預(yù)變性95 ℃,10 min;變性95 ℃,15 s,退火57 ℃,20 s,延伸78 ℃,20 s,共55個(gè)循環(huán);保溫40 ℃,30 min。溶解分析程序?yàn)?0 ℃～95 ℃,采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道熒光信號(hào),連續(xù)采光,升溫速率為0.04 ℃/S。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。采用非條件邏輯回歸分析與NTM感染相關(guān)的因素,相關(guān)因素包括性別,年齡,結(jié)核病史和并發(fā)癥(COPD,糖尿病,肝炎,腫瘤和HIV)。以NTM感染作為因變量(PTB=0,NTM-PD=1),建立單因素二元Logistic模型。在該模型中,將P<0.05的因素再進(jìn)行多因素二元Logistic分析,計(jì)算優(yōu)勢比(OR)及其95%置信區(qū)間(CI),P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 分枝桿菌菌種鑒定情況

716例患者中有632例患者的痰液經(jīng)鑒定為MTB(88.268%),37例為NTM(5.168%),10例(1.397%)為NTM和MTB雙重感染,37例為定植菌(5.168%)。37例NTM患者中包含11例胞內(nèi)分枝桿菌,12例膿腫分枝桿菌,6例鳥分枝桿菌,3例堪薩斯分枝桿菌,3例其他分枝桿菌,1例偶發(fā)/豬分枝桿菌和1例蘇加分枝桿菌。胞內(nèi)分枝桿菌(1.536%,11/716)、膿腫分枝桿菌(1.676%,12/716)和鳥分枝桿菌(0.838%,6/716)是本地NTM主要流行菌種(見圖1)。

圖1 NTM菌種流行情況

二、NTM宿主風(fēng)險(xiǎn)因素的單因素分析

對(duì)所有變量進(jìn)行單因素分析,結(jié)果顯示,地區(qū)(OR=7.586,95%CI:1.029～55.921)、COPD(OR=4.852,95%CI:1.966～11.971)、糖尿病(OR=0.107,95%CI:0.015～0.790)、HIV(OR=3.361,95%CI:1.095～10.316)和腫瘤(OR=5.488,95%CI:1.443～20.868)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(見表1)。

三、NTM宿主風(fēng)險(xiǎn)因素的多因素分析

由于重慶地區(qū)病人比例較大(77.7%,559/719),所以本研究中將不對(duì)“地區(qū)”這一變量進(jìn)行多因素分析。對(duì)篩選出來的變量(COPD、糖尿病、HIV和腫瘤)進(jìn)行多因素分析,賦值變量表(見表2)。結(jié)果顯示,與非糖尿病患者相比,糖尿病患者(OR=0.104, 95%CI:0.014～0.793)可能感染NTM的風(fēng)險(xiǎn)較低(P<0.05);COPD(OR=5.018,95%CI:1.966～12.804)、HIV(OR=3.855, 95%CI:1.224～12.143)和腫瘤(OR=6.226, 95%CI: 1.509～25.691)是NTM感染的高風(fēng)險(xiǎn)因素(P<0.05)(見表3)。

表2 NTM感染風(fēng)險(xiǎn)因素的賦值情況

表3 非結(jié)核分枝桿菌患者基本特征的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

討 論

近年來,NTM感染的發(fā)病率正在不斷增加。大約30%的NTM感染者錯(cuò)誤地接受結(jié)核病治療,而且大多數(shù)NTM菌株對(duì)常規(guī)一線抗結(jié)核藥物具有天然耐藥性,導(dǎo)致治療失敗[10]。因此,NTM的流行是全球公共衛(wèi)生面臨的一個(gè)新挑戰(zhàn)。NTM感染其臨床和影像學(xué)表現(xiàn)與結(jié)核分枝桿菌有相似之處,尚未有明確的診斷辦法,此外,NTM菌種的分類正在迅速更新和變化。所以,準(zhǔn)確和及時(shí)的診斷NTM并鑒定其亞種對(duì)臨床治療和防止誤診具有重要作用[11]。

16S rRNA基因測序法是基于核酸序列的NTM菌種鑒定方法中最直接可靠的方法。有研究表明[12],本研究中所采用的熒光PCR溶解曲線法試劑與16S rRNA基因測序法的一致率能達(dá)到97%。熒光PCR溶解曲線的檢測步驟較基因芯片法和PCR反向點(diǎn)雜交法更簡單,人工耗時(shí)更少,不需要特殊的儀器。因此,本研究中所采用的熒光PCR溶解曲線法NTM分型試劑盒,適合配備熒光定量PCR儀器的各級(jí)實(shí)驗(yàn)室使用。

由于戈登分枝桿菌一般不具有致病性或致病性弱,分離到該菌株可能為污染或短暫的定植[8]。在本研究中,37例患者的兩份痰液中僅一份分離鑒定為戈登分枝桿菌,以《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療指南(2020年版)》[8],《NTM病治療指南》[9]和患者的臨床診斷為依據(jù),故37例戈登分枝桿菌判定為非致病菌。因此,在重慶及其周邊地區(qū),肺部NTM感染者占5.168%,胞內(nèi)分枝桿菌(1.536%)、膿腫分枝桿菌(1.676%)和鳥分枝桿菌(0.838%)是主要流行菌種。在2019年有文章指出,在重慶地區(qū)NTM流行的主要菌種分別是膿腫分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和偶發(fā)/豬分枝桿菌[13]。這與本研究所得結(jié)果有所不同,可能有兩種原因造成該結(jié)果,一是由于本研究所收集的病人信息和樣本時(shí)間段為新冠疫情初始階段,這必將導(dǎo)致許多病人因?yàn)橐咔樵虿荒芗皶r(shí)到院治療。二是前者的研究中所用的方法學(xué)為PCR反向點(diǎn)雜交法,兩種方法的檢測原理不同,其敏感度也可能不同。

在不同地區(qū)與國家,NTM菌種的流行分布情況是不同的。在歐洲和北美,鳥分枝桿菌、蟾分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌是主要流行菌種。而在南美,NTM流行的菌種主要是鳥分枝桿菌、戈登分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌[14]。這主要是因?yàn)镹TM菌種流行具有地理多樣性,例如溫度、濕度和人群生活習(xí)慣的不同。

本研究在NTM感染的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素分析中發(fā)現(xiàn)COPD是NTM感染的高風(fēng)險(xiǎn)因素。COPD可通過引起黏膜損傷和局部免疫損傷而導(dǎo)致NTM易感性增加,包括分泌物清除障礙、氣道表面液體成分異常、痰液成分異常以及持續(xù)性炎癥引起的氣道損傷[15]。Piersimoni C.[16]也指出在免疫功能正常的成人中,NTM肺病多繼發(fā)于先前有呼吸道阻塞和/或呼吸道結(jié)構(gòu)破壞的慢性基礎(chǔ)肺病患者中。這些患者的粘液纖毛清除功能和氣道分泌物排除功能明顯受損,因此為NTM的定植和發(fā)展提供了合適的微環(huán)境,從而導(dǎo)致機(jī)會(huì)感染[17]。同時(shí),NTM感染也可能導(dǎo)致COPD患者的疾病進(jìn)展和肺功能惡化[18]。

免疫系統(tǒng)受損導(dǎo)致無法清除體內(nèi)的非結(jié)核分枝桿菌,是NTM感染的關(guān)鍵因素。因此T細(xì)胞數(shù)量低下或功能缺陷的患者面臨NTM感染的風(fēng)險(xiǎn)更大。HIV感染者,特別是CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)低于50/uL的患者,更容易感染NTM[19]。在本研究中,我們也證實(shí)了這一點(diǎn)。相較于非腫瘤患者,腫瘤患者也可能因?yàn)轶w內(nèi)免疫系統(tǒng)受到破壞而導(dǎo)致NTM感染。而與非糖尿病患者相比,糖尿病患者的NTM感染風(fēng)險(xiǎn)可能較低,與其他研究報(bào)道一致[5]。目前對(duì)于糖尿病是否為NTM感染的低風(fēng)險(xiǎn)因素,并未有詳細(xì)的研究。

綜上所述,在本研究中NTM主要流行的菌種是胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和鳥分枝桿菌。此外,COPD、HIV和腫瘤是NTM感染的高風(fēng)險(xiǎn)因素。在臨床工作中,臨床醫(yī)生應(yīng)該多意識(shí)到這些相關(guān)因素與NTM的關(guān)聯(lián),并使用所有可用的診斷工具來確認(rèn)或排除NTM感染。但本研究仍然存在一定的局限性,如患者納入數(shù)量不夠多、時(shí)間不夠長等,未來我們將繼續(xù)收集NTM和MTB的相關(guān)信息,進(jìn)一步完善本研究。