張玉 朱振剛

支氣管哮喘是一種慢性肺部疾病,由血漿外滲和炎性細胞(如嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和肥大細胞)內流引起的慢性氣道炎癥所致,支氣管哮喘通常被定義為可逆性氣道阻塞,但它可以演變?yōu)椴豢赡娴姆喂δ軗p害[1-2]。根據(jù)涉及的主要免疫-炎癥途徑,哮喘可分為Th2相關性哮喘、非Th2相關性哮喘和混合型。據(jù)報道,嗜酸性粒細胞浸潤肺粘膜和間質與2型免疫反應導致的哮喘的嚴重程度密切相關[3-4]。其中,Th2相關性哮喘的典型特征是氣道嗜酸性粒細胞計數(shù)升高,非Th2相關性哮喘的典型特征是氣道嗜酸性粒細胞計數(shù)正常,但氣道中性粒細胞計數(shù)升高[5]。目前人們對哮喘的分子和細胞機制已經(jīng)有了較好的認識,但仍尚未完全了解。嗜酸粒細胞胞外陷阱(eosinophil extracellular trap,EET),由活化的嗜酸性粒細胞釋放DNA纖維以及顆粒蛋白組成,并在宿主的防御中發(fā)揮效應功能,促進炎癥和/或有效消除病原體[6-7]。有實驗表明,所有哮喘患者的肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)中均觀察到了EET,并且其數(shù)量與嗜酸性粒細胞相關[8]。那么究竟EET能否成為哮喘治療新的靶點,本文就嗜酸性粒細胞胞外陷阱與哮喘的關系進行綜述。

一、嗜酸性粒細胞胞外陷阱(EET)

1 嗜酸性粒細胞以及EET

科學家將嗜酸性粒細胞最早描述為炎癥滲出液中的“顆粒細胞”,而“嗜酸性粒細胞”這個名稱則首次見于名為《關于血液的特定顆?！返恼撐闹?。人類嗜酸性粒細胞是骨髓來源的白細胞,具有特異性的形態(tài)學特征,包括雙葉核和充滿細胞毒性和免疫調節(jié)蛋白的細胞質顆粒,他們在骨髓中發(fā)育并可釋放到外周血和相應的組織中,嗜酸性粒細胞通常只占外周血白細胞的1%至3%[9-10]。

嗜酸性粒細胞通過三種主要機制(包括胞吐、細胞溶解和碎片脫顆粒)對不同刺激作出反應而脫顆粒。最近,除了脫顆粒外,嗜酸性粒細胞釋放細胞外DNA陷阱(EET釋放)的過程被描述為不同炎癥條件下嗜酸性粒激活的重要機制[11]。

EET首次由Shida Yousefi等[12]報道,當嗜酸性粒細胞被激活后,會以活性氧依賴的方式釋放DNA結構,DNA結構和顆粒蛋白會在胞外空間形成能夠在體外和體內炎癥條件下結合和殺死細菌的細胞外結構,但當其釋放過多時,則具有一定的致病性。據(jù)報道,EET有兩種形成方式,一種快速形成,另一種是緩慢形成?？焖傩纬傻腅ET由線粒體DNA網(wǎng)組成,含有陽離子蛋白,通常儲存在嗜酸性粒細胞的細胞質次級顆粒中;緩慢形成的EET由富含組蛋白的核DNA組成,其缺乏游離陽離子蛋白[13]。

并非所有的EET都是通過細胞裂解釋放的。一方面,有學者發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細胞中的EET釋放涉及其雙葉核的溶解,核膜的破裂,胞質成分的混合和細胞膜的破裂,因此EET最終可能以細胞死亡的方式結束[14]。但另一方面,亦有研究表明,肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavagefluid,BALF)中的嗜酸性粒細胞產(chǎn)生EET后卻沒有顯示任何凋亡或壞死的跡象,均保持較高的活力,這表明DNA釋放是一個活躍的過程,不引起細胞的凋亡或壞死[15]。Rodrigo-Muoz等[16]亦已經(jīng)表明,嗜酸性粒細胞在面對細菌或真菌時能夠排出其線粒體DNA而不會死亡?，F(xiàn)在人們已經(jīng)認識到所有EET的產(chǎn)生都是不同的,有些可能是從活細胞中釋放出來的,有些則是從溶解(壞死)細胞中產(chǎn)生的。

2 影響因素

據(jù)報道,眾多因素或物質會影響EET的形成,或抑制或參與EET的釋放。對于抑制其形成的物質,如表面活性劑蛋白-D(SP-D),這是一種具有免疫調節(jié)作用的氣道上皮細胞的產(chǎn)物,SP-D可以直接結合到嗜酸性粒細胞膜上,并以濃度依賴性方式抑制人和鼠嗜酸性粒細胞的細胞外DNA陷阱形成。SP-D還抑制嗜酸性粒細胞陽離子蛋白誘導的遷移、脫顆粒[17]。而參與EET形成過程的則有自噬、活性氧(ROS)、重組人脫氧核糖核酸酶(rhDNase)、溶血磷脂酰絲氨酸(LysoPS)等。其中,細胞自噬會參與EET釋放及肺部炎癥。Silveira等人證明,當小鼠用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)治療可減少氣道中EET的形成,因此研究者認為3-MA治療可以成為減少哮喘中肺部炎癥、氧化應激、線粒體損傷和EETs形成的一種替代方案[18]。此外,Silveira等人還發(fā)現(xiàn)活性氧(ROS)是哮喘中EETs形成所必需的,當用卵清蛋白(OVA)鼻內激發(fā)之前,用兩種活性氧抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)或二苯碘(DPI)治療小鼠時,發(fā)現(xiàn)DPI和NAC治療可降低肺嗜酸性粒細胞過氧化物酶(EPO)以及各種促炎細胞因子,并且減少了氣道中的EET釋放[19]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽以氧化酶依賴性方式誘導EET形成[20]。最近有實驗證明,重組人脫氧核糖核酸酶(rhDNase)改善了肺功能和DNA細胞外陷阱,rhDNA酶顯著降低了氣道阻力,減少了EETs的形成和球狀細胞增生[21]。

Kim等[22]的研究則表明溶血磷脂酰絲氨酸(LysoPS)誘導的EET與所檢測的幾種信號通路(如EGFR-MAPKs、PI3K、NF-γB)無關,但依賴于精氨酸脫氨酶蛋白4(PAD4);并且LysoPS以濃度依賴而不是時間依賴的方式誘導EET。除此之外,不同濃度的胸腺基質淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin ,TSLP)刺激純化的血液嗜酸性粒細胞時,發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細胞以時間和濃度依賴的方式釋放細胞外DNA[23]。

3 DNA的來源

對于EET釋放DNA的來源一方觀點認為來自于線粒體DNA,一方認為來自于核DNA。更早之前的研究認為其是線粒體來源[24],學者發(fā)現(xiàn)當哮喘小鼠感染呼吸道合胞病毒(RSV)時,可以在體外肺泡灌洗液中誘導EET,并且RSV以濃度依賴性方式誘導EET的釋放,并且證明其釋放的DNA為線粒體起源[25];近年來,多數(shù)研究學者證明大多數(shù)EET由起源于細胞核的組蛋白結合DNA組成,人類嗜酸性粒細胞含有很少的線粒體,表明可以釋放的線粒體DNA很少[26]。亦有研究表明,EET-DNA含有(8.72±1.99)%的線粒體DNA,表明EET-DNA主要來源于染色體DNA[4]。半乳糖凝集素-10的帽樣積累出現(xiàn)在嗜酸性粒細胞的核葉前,很可能是為了準備與DNA相關的半乳糖凝集素-10的噴射記錄噴射的EET含有組蛋白,進一步證實EET由核而不是線粒體DNA組成[13]。而Kim等[22]人的實驗發(fā)現(xiàn)即使在EET形成后,完整的線粒體也僅存在于細胞內部,釋放的DNA中發(fā)現(xiàn)瓜氨酸H3,表明染色質去凝聚,線粒體DNA 不太可能存在于EET中。盡管目前研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了EET中DNA結構的釋放可能來源于不同的結構,但嗜酸性粒細胞究竟在何種刺激下有選擇的釋放DNA機構,仍需要進一步的研究探索。

4 嗜酸性粒細胞陷阱與中性粒細胞陷阱

胞外陷阱包括中性粒細胞胞外陷阱、嗜酸性粒細胞胞外陷阱、嗜堿性粒細胞胞外陷阱、肥大細胞胞外陷阱、巨噬細胞胞外陷阱、單核細胞胞外陷阱以及漿細胞樣樹突狀細胞胞外陷阱[27],目前的研究發(fā)現(xiàn)中,與哮喘聯(lián)系較多的當屬中性粒細胞胞外陷阱與嗜酸性粒細胞胞外陷阱。那么二者在形成過程中究竟有何異同呢?

Brinkmann及其同事[28]首次在中性粒細胞中描述了DNA胞外陷阱釋放(neutrophil extracellular traps, NETs)現(xiàn)象。NET是由脫縮染色質組成的纖維網(wǎng)狀結構,裝飾有抗菌顆粒成分,包括中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)和髓過氧化物酶(MPO),在NET形成過程中,核染色質被縮聚,加載顆粒狀蛋白質并最終釋放到細胞外空間[29]。

NET和EET在穩(wěn)定性方面具有不同的屬性,與中性粒細胞相比,嗜酸性粒細胞含有更少的蛋白酶,因此嗜酸性粒細胞染色質免于內源性蛋白酶消化[30],性質較為穩(wěn)定。亦有研究稱,由于嗜酸性粒細胞顆粒中蛋白酶的活性較低,這些嗜酸性粒細胞DNA纖維比中性粒細胞更厚、更穩(wěn)定,這表明EETs可能比NETs產(chǎn)生更持久的效果[31]。

在結構上,中性粒細胞DNA陷阱中DNA絲的直徑為15～17nm,許多直徑約為25nm的球形物質(很可能是蛋白質)與DNA結合[32],相比之下,嗜酸性粒細胞DNA陷阱主要由25～35nm染色質纖維組成,核心組蛋白是DNA陷阱中最豐富的蛋白質,將近2米的DNA包裝成一個小細胞核,是豐富酶的靶標[33]。

完整顆粒的釋放而非顆粒化蛋白的釋放被認為是嗜酸性粒細胞和中性粒細胞DNA陷阱的主要區(qū)別[22]。

二者除不同點外還存在著一些共性。研究發(fā)現(xiàn),嗜酸性粒細胞和中性粒細胞都通過釋放細胞毒性蛋白、活性氧,以及可能的細胞外陷阱參與氣道上皮損傷。并且NETs和EETs均具有抗感染和促炎特性的網(wǎng)狀DNA結構,其都會參與哮喘的病理生理學[34]。而且EET和NET的形成都取決于NADPH氧化酶的活化[35]。

二、EET與哮喘及嚴重哮喘的關系

研究發(fā)現(xiàn),EETs使用藥物和遺傳方法增強實驗性非感染相關性哮喘中的杯狀細胞增生、粘液產(chǎn)生、炎癥細胞浸潤和2型細胞因子的表達。多種臨床相關的變應原部分通過體內胸腺基質淋巴細胞生成素觸發(fā)EET形成。在機制上,EET通過CCDC25-ILK-PKCα-CRTC1途徑激活肺神經(jīng)內分泌細胞,該途徑由嗜酸性粒細胞過氧化物酶增強[36]。在EETs中所含的各種顆粒蛋白中,嗜酸性粒細胞陽離子蛋白能夠引起哮喘患者的組織損傷[37]。

嚴重哮喘(SA)患者的嗜酸性粒細胞比來自非嚴重哮喘(NSA)患者的嗜酸性粒細胞更活躍,形成EET的嗜酸性粒細胞與基線FEV1%呈負相關預測值,并與哮喘患者的血清EDN水平呈正相關。從SA患者中分離的外周血嗜酸性粒細胞在以ROS依賴性方式激活IL-5和LPS后表現(xiàn)出EET產(chǎn)生增加[38]。最近一項研究表明,當哮喘患者分為SA患者和NSA患者時,血清細胞角蛋白(CK)18水平顯著升高,并且SA患者的CK18特異性IgG水平明顯高于NSA患者,CK18特異性抗體能夠誘導嗜酸性粒細胞脫顆粒,導致EET形成。這些EET進一步刺激AEC釋放CK18,增強SA中的嗜酸性粒細胞炎癥,導致形成惡性循環(huán)[39]。此外,EETs可以通過介導SA的自身免疫反應來誘導哮喘進展;從嚴重哮喘患者收集的痰液自身抗體可觸發(fā) SA 患者的嗜酸性粒細胞溶解和EET形成[40]。

有學者發(fā)現(xiàn),重癥哮喘患者釋放的EET誘導了上皮細胞衍生的細胞因子,如IL-1α、IL-1β、CXCL-1、CCL24、IL-33和TSLP,而這些因子都會加重哮喘的發(fā)生。此外,EET治療后肺ILC2的數(shù)量及活化增加,通過產(chǎn)生IL-5和IL-13導致2型氣道炎癥[41]。重度哮喘患者的循環(huán)NET水平高于輕度或中度哮喘患者或健康對照組,與NET水平相反,循環(huán)EET水平與哮喘嚴重程度無關[42]。最近的研究亦表明,嗜酸性粒細胞釋放的細胞外陷阱和囊泡,可以增強與氣道上皮相互作用的2型免疫反應,在嚴重嗜酸性粒細胞性哮喘的發(fā)病機制中起重要作用[43]。

而EET不僅與哮喘關系密切,在慢性鼻炎-鼻竇炎[15]、塑型性支氣管炎[44]、特異性皮炎[45]等疾病的發(fā)生有一定的關聯(lián),這里我們不再一一敘述。

三、結語

綜上所述,來自活化嗜酸性粒細胞的EET是哮喘診斷和治療的新靶點。進一步了解 EET 的形成機制將有助于更好地診斷和治療哮喘及嚴重哮喘。同時一些研究者也提出了關于EET的進一步研究方向,如關于EET的更準確的觸發(fā)因素[47];不同的嗜酸性細胞亞型是否同樣會導致EET的釋放;預防或溶解EET的方法;EET釋放的DNA網(wǎng)狀結構與蛋白顆粒之間的關系等,這些問題仍需要進一步探索。而隨著技術的不斷進步,對EET研究力度的不斷加強,EET可能成為哮喘的新的潛在治療靶點,將更好的指導哮喘的臨床治療。