王育民,宋惠芳,趙晨,夏遠(yuǎn),張星光

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院 兒內(nèi)科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

呼吸道過敏性疾病是全球最常見的慢性疾病之一,造成國家衛(wèi)生保健系統(tǒng)資源消耗的主要負(fù)擔(dān)之一。國際兒童哮喘和變態(tài)反應(yīng)研究(international study of asthma and allergies in childhood,ISAAC)對(duì)56個(gè)國家和地區(qū)兒童哮喘與過敏性疾病橫斷面調(diào)查發(fā)現(xiàn),6～7歲和13～14歲兒童變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)的患病率分別波動(dòng)于2.2%～24.2%和4.5%～45.1%[1]。目前國內(nèi)相關(guān)的流行病學(xué)調(diào)查資料還十分有限,不同城市兒童AR的患病率不盡相同[2-4],受遺傳因素、生活習(xí)慣、居住地環(huán)境與植被等因素影響。通常AR患兒發(fā)展成過敏性哮喘的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)提高4～5倍,而繼發(fā)過敏性哮喘與其致敏成分、病程等相關(guān)。在世界范圍內(nèi)主要的氣傳致敏原為氣傳花粉[5],而我國引起季節(jié)性呼吸道過敏性疾病的主要花粉種屬中,蒿屬花粉的關(guān)聯(lián)指數(shù)最高,研究表明蒿屬花粉是中國、尤其是內(nèi)蒙古地區(qū)引起呼吸系統(tǒng)過敏性疾病最主要的室外致敏原之一[6-9]。在內(nèi)蒙古地區(qū)夏秋季蒿花粉濃度逐年攀高,我國多項(xiàng)研究證實(shí)大籽蒿和黃花蒿花粉是致敏率最高的花粉之一[10-11]。

變應(yīng)原組分診斷是在生物分子層面明確變應(yīng)原致敏組分蛋白的新型診斷技術(shù),應(yīng)用提取天然變應(yīng)原組分、重組變應(yīng)原分子,了解變應(yīng)原分子與免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)的結(jié)合力,可高效準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)變應(yīng)原分子及致敏特征[12],其在診斷及免疫治療中具有更高的效力[13-14]。本研究旨在獲取AR患兒夏末和秋季有關(guān)黃花蒿、大籽蒿花粉變應(yīng)原分子致敏性的特征,為花粉致呼吸道過敏性疾病的預(yù)防和變應(yīng)原免疫治療提供重要線索。

1 材料與方法

1.1 患者的選擇

每年8～9月份是季節(jié)性AR高發(fā)期,根據(jù)可靠的臨床病史、夏秋季艾蒿花粉過敏史以及符合AR、兒童哮喘診斷和治療指南[15-16]的診斷標(biāo)準(zhǔn),共收集27例AR患兒血清進(jìn)行后續(xù)檢測(cè),男20例,女7例,年齡2～13歲,平均(5.85±3.02)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):受試者艾蒿特異性IgE抗體(酶聯(lián)免疫法)檢測(cè)為陽性;12個(gè)月內(nèi)未接受免疫治療;4周內(nèi)未服用糖皮質(zhì)激素;有季節(jié)性過敏癥狀或癥狀加重。排除標(biāo)準(zhǔn):過敏原特異性IgE抗體檢測(cè)陰性;12個(gè)月內(nèi)接受過免疫治療;4周內(nèi)服用過糖皮質(zhì)激素;過敏癥狀非季節(jié)性發(fā)作或加重;非呼吸道過敏患兒;排除患有癌癥、自身免疫性疾病和寄生蟲病的患兒。所有患兒樣本均在監(jiān)護(hù)人知情同意的情況下采集,本研究經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 蒿屬植物和蛋白質(zhì)提取物

兩種蒿屬植物的花粉于花開季節(jié)采集自內(nèi)蒙古呼和浩特市市郊區(qū),花粉去除雜質(zhì)、分樣過篩,-20 ℃低溫保存?zhèn)溆?。提取花粉蛋白全程冰上操?使用花粉蛋白提取試劑盒(上海貝博),花粉蛋白提取液在4 ℃、2 000×g離心10 min,取上清后4 ℃、14 000×g離心10 min,棄沉淀取上清分裝-80 ℃存儲(chǔ)備用。使用 BCA 蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù))測(cè)定樣本蛋白濃度。

1.3 花粉蛋白提取物免疫印跡實(shí)驗(yàn)

大籽蒿、黃花蒿蛋白提取液根據(jù)所測(cè)蛋白濃度按等質(zhì)量配平,將蛋白提取液與SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 蛋白上樣緩沖液(5×)4∶1混勻。SDS-PAGE分離花粉蛋白組分, 12.5%分離膠、5%濃縮膠的PAGE凝膠在電泳緩沖液中以100 V 運(yùn)行1.5 h。

通過半干轉(zhuǎn)方式將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,封閉膜15 min,然后以AR患兒血清作為一抗孵育。TBST洗滌液沖洗膜3次,然后以HPR標(biāo)記的山羊抗人IgE二抗孵育,清洗膜后Affinity Bioscience ECL發(fā)光液均勻覆蓋膜并成像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和構(gòu)成比表示,兩組之間陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)。采用雙側(cè)檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 花粉蛋白提取物免疫印跡分析

以27例AR患兒血清作為一抗與2種蒿屬植物分別進(jìn)行免疫印跡檢測(cè),所有結(jié)果中可以看到3個(gè)主要條帶:12、25 和70 kDa的IgE結(jié)合率高。其中7例患兒僅表現(xiàn)出對(duì)黃花蒿單一植物過敏,20例患兒對(duì)2種植物花粉均過敏,黃花蒿和大籽蒿花粉過敏陽性率分別為100.00%和74.07%。見表1。

表1 27例過敏患兒一般信息和2種花粉過敏組分資料

黃花蒿免疫印跡結(jié)果顯示:27例AR患兒血清中,對(duì)12 kDa條帶識(shí)別 4例(37.04%),25 kDa條帶識(shí)別10例(14.81%),70 kDa條帶識(shí)別23例 (85.19%)。大籽蒿免疫印跡結(jié)果顯示:12 kDa條帶識(shí)別4例(37.04%),25 kDa條帶識(shí)別10例(14.81%),70 kDa條帶識(shí)別14例(51.85%)。見圖1、表2。此外,黃花蒿提取物免疫印記檢測(cè)顯示N14患兒在35～40 kDa有1條微弱條帶,N23患兒在55 kDa條帶位置識(shí)別顯影。

圖1 AR患兒對(duì)2種蒿屬植物主要致敏組分的陽性率

表2 黃花蒿和大籽蒿變應(yīng)原分子結(jié)果分析 [例(%)]

2.2 個(gè)體致敏差異

部分個(gè)體血清IgE對(duì)2種植物提取物的同1條帶位置陽性反應(yīng)不一致,如33.33%(9/27)顯示黃花蒿提取物70 kDa條帶陽性,而大籽蒿陰性;另外,1份血清IgE可能表現(xiàn)為與某一蒿屬植物中的1種或2種組分蛋白相結(jié)合,個(gè)體差異明顯。見表1、圖2。

圖2 N23、N24患兒免疫印跡圖 注:Marker(預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn))。

3 討論

蒿屬植物花粉濃度高峰在8月中旬至9月底,季節(jié)性致敏特點(diǎn)十分明顯,蒿屬植物種類繁多,目前已分離鑒定出多種變應(yīng)原,且致敏性存在差異。近年來AR患病率、發(fā)展為哮喘的人群大幅度提升,年齡段逐漸幼齡化,甚至于幼兒期就出現(xiàn)明顯的季節(jié)性呼吸道過敏癥狀,給患兒及家長(zhǎng)在生活質(zhì)量、學(xué)業(yè)、心理上都帶來承重負(fù)擔(dān)。在王曉艷等[17]的研究中表明艾蒿花粉特異性IgE的濃度在兒童和青少年組顯著高于成人組。因此,我們需要在兒童人群中尋找致敏變應(yīng)原成分、了解致敏模式,在精確診斷和免疫治療上年齡段關(guān)口前移。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃花蒿、大籽蒿2種植物花粉提取物的變應(yīng)原進(jìn)行研究,分別與每一個(gè)體血清檢測(cè),以了解個(gè)體差異性,2種植物花粉表現(xiàn)出相似的變應(yīng)原譜,結(jié)果顯示2種蒿屬植物12、25、70 kDa組分條帶明顯,但二者帶譜陽性反應(yīng)存在差異,一些患兒對(duì)2種植物提取物的同一條帶位置陽性反應(yīng)不一致,不同患兒對(duì)其中1種或多種變應(yīng)原分子敏感,蒿過敏AR患兒對(duì)這3種變應(yīng)原分子陽性結(jié)合率較高,為主要變應(yīng)原,這與 Gao等[18]和來自歐洲的變應(yīng)原免疫印跡結(jié)果基本一致。同樣我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與李興永等[19]對(duì)大籽蒿花粉、楊慧等[20]對(duì)艾蒿花粉過敏原進(jìn)行分離鑒定出的主要致敏原是62 kDa的變應(yīng)原分子結(jié)果亦相同。黃花蒿變應(yīng)原分子70 kDa蛋白的致敏率在所有檢測(cè)的變應(yīng)原分子中最高,該變應(yīng)原分子在西班牙與荷蘭的人群中致敏率分別為92%和95%,在2018年Fu 等[21]實(shí)驗(yàn)中確定70 kDa蛋白條帶位置的變應(yīng)原是一種相對(duì)分子量為62 kDa的半乳糖氧化酶分子,現(xiàn)在被IUIS變應(yīng)原命名小組指定為Art an 7,該實(shí)驗(yàn)樣本中Art an 7分子的致敏率為85%。我們亦認(rèn)為變應(yīng)原分子70 kDa為蒿屬氣傳植物花粉的主要致敏原,那么含有變應(yīng)原分子70 kDa的免疫試劑可能對(duì)相關(guān)過敏性疾病診斷及特異性免疫治療更有效。

黃花蒿和大籽蒿提取物中70 kDa蛋白分子的IgE陽性結(jié)合率差異明顯,前者更高,考慮可能為2種變應(yīng)原分子生物學(xué)信息的差異、序列位點(diǎn)的改變與致敏性差異相關(guān)。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)同源物異構(gòu)體對(duì)IgE結(jié)合有潛在影響,完成生物學(xué)信息的比對(duì)及進(jìn)一步純化,在大樣本人群中評(píng)估致敏差異性[22]。同源變應(yīng)原致敏差異需要在不同地理區(qū)域的大量具有代表性的血清樣本中進(jìn)行評(píng)估,以獲得更為全面的數(shù)據(jù)與觀點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)中黃花蒿花粉提取物與AR兒童血清IgE抗體識(shí)別度更高,而大籽蒿較弱,與Zhao 等[22]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃花蒿和北艾的IgE結(jié)合能力顯著高于大籽蒿、鐵桿蒿、野艾蒿的結(jié)果一致,也與于睿莉等[11]對(duì)內(nèi)蒙古錫林郭勒黃花蒿、大籽蒿及艾蒿3種蒿屬花粉的致敏性研究所顯示的黃花蒿致敏性強(qiáng)于大籽蒿結(jié)果亦一致。對(duì)大多數(shù)蒿過敏患兒而言,研究顯示黃花蒿花粉提取物的IgE結(jié)合率最高[23]。盡管黃花蒿在20世紀(jì)80年代即被認(rèn)為是一種重要的變應(yīng)原,但一直以來中國用于皮膚點(diǎn)刺的商業(yè)蒿花粉提取物主要來自大籽蒿[24]。艾蒿提取物也是我國目前主要蒿屬植物過敏診斷商品,普遍適用于體外試驗(yàn)。2020年Lou等[6]研究證實(shí)黃花蒿提取物可被選擇作為季節(jié)性AR的舌下免疫治療產(chǎn)品,2021年全球首個(gè)用于治療黃花蒿/艾蒿花粉過敏引起的AR(或伴有結(jié)膜炎)的標(biāo)準(zhǔn)化脫敏藥物—黃花蒿花粉變應(yīng)原舌下滴劑(商品名:暢皓)獲批上市。同時(shí)研究顯示多變應(yīng)原組分過敏的人群更易患過敏性哮喘,在中國北方人群較南方人群更易患哮喘,近一半的秋季花粉AR患者在9年內(nèi)發(fā)展為季節(jié)性過敏性哮喘[25-26],對(duì)2種以上變應(yīng)原致敏增加了患過敏性哮喘的風(fēng)險(xiǎn),其中Art v 1、Art v 3、Art an 7導(dǎo)致致敏患者發(fā)生過敏性哮喘的風(fēng)險(xiǎn)增加約3倍[17]。

實(shí)驗(yàn)中變應(yīng)原分子12、25、70 kDa與AR患兒血清IgE的結(jié)合率高,且免疫印跡結(jié)果顯示陽性結(jié)合反應(yīng)基本集中在這3種變應(yīng)原分子中,為主要致敏組分,2種變應(yīng)原組分同時(shí)致敏率易偏高,因此認(rèn)為作為商品蒿過敏診斷試劑或免疫制劑建議包含這3種變應(yīng)原組分,將提高精準(zhǔn)診斷及特異性免疫效率,當(dāng)然仍需大樣本人群檢測(cè)來篩查潛在致敏原及更準(zhǔn)確了解致敏組分信息。免疫治療是目前唯一可能影響過敏性疾病自然病程的醫(yī)療干預(yù),對(duì)于過敏人群意義重大,明確真正的致敏組分蛋白后針對(duì)性的免疫制劑可以有效降低免疫治療中的不良反應(yīng),減少社會(huì)醫(yī)療經(jīng)濟(jì)成本消耗。