劉宇,楊景然,熊學(xué)敏,畢文芝,周新東,張惠鋒,胡冬雄

深靜脈血栓(DVT)是血栓相關(guān)性疾病的一種,隨著現(xiàn)代生活的日益豐富及人口老齡化,血栓栓塞性疾病也呈逐年上升趨勢(shì)。血栓多繼發(fā)于各種原因?qū)е碌拈L(zhǎng)期臥床、血管內(nèi)瘤栓、血栓形成及機(jī)體血液成分改變等各種疾病[1]。血管內(nèi)皮損傷、靜脈回流減慢、血液高凝狀態(tài)至今仍被認(rèn)為是DVT形成的三大主要因素[2]。其產(chǎn)生原因較為復(fù)雜,與多種誘發(fā)因素與代謝記憶有關(guān),導(dǎo)致靜脈腔血液凝結(jié)異常、靜脈腔阻塞多及靜脈回流阻礙[3-5]。目前DVT主要的治療方法包括抗凝、溶栓、介入血管成形治療及手術(shù)直接取栓治療。但手術(shù)創(chuàng)傷大,僅適用于急性患者;藥物出血風(fēng)險(xiǎn)高,有過(guò)敏反應(yīng)或費(fèi)用昂貴,而使其使用受限。為此,基于中醫(yī)幾千年的發(fā)展歷史,及其在DVT治療中的獨(dú)特療效,已經(jīng)成為大家關(guān)注的熱點(diǎn)和研究方向。血栓的中醫(yī)分型有多種,在中醫(yī)學(xué)西漢帛書《五十二病方》中,血栓歸屬“血瘀”范疇,因此臨床上多使用活血化瘀的藥物防治血栓形成。滇南血栓丸僅針對(duì)臨床上的溫陽(yáng)化瘀型與涼血化瘀型的血栓患者,其組方依據(jù)國(guó)家經(jīng)典名方桃紅四物湯的加減裁化而來(lái),由黃芪、砂仁、紅花、丹參、桃仁、三七、木姜子和水蛭等14味中藥組成的復(fù)方制劑[6]。根據(jù)臨床用藥需要,選擇丸劑作為該藥的制劑工藝。

1 材料與方法

1.1 儀器 LC-2030plus液相色譜儀(日本島津有限公司),Polar-Phenyl色譜柱(5 μm,120 A,250 mm×4.6 mm,蘇州賽分科技有限公司),CPA225D型電子天平(賽多利斯),KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),DZF-6020真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),R501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物科技有限公司)。

1.2 試藥及試劑 黃芪、砂仁、紅花、丹參、桃仁、三七、木姜子和水蛭(云南白藥有限責(zé)任公司,所有藥材飲片符合《中國(guó)藥典》2020版檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)并提供檢驗(yàn)報(bào)告書,并經(jīng)云南省中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院專家鑒定)、黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào):110781-201616,中國(guó)食品藥品檢定研究院)。乙腈和甲醇為色譜純(色譜純,Sigma公司),其余試劑均為分析純。供試品(樣品):滇南血栓丸(云南省第一人民醫(yī)院制劑,批號(hào):20211121、20211227和20220128)。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝研究

2.1.1 正交試驗(yàn)提取工藝優(yōu)化:目前中藥的傳統(tǒng)方法以水煎為主,因此本試驗(yàn)采取水煎煮法對(duì)處方中各中藥材的有效成分進(jìn)行最大程度提取?？紤]到影響藥材提取效率的主要因素有煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)及加水量,以上述三因素作為正交試驗(yàn)的考察因素對(duì)水煎煮工藝進(jìn)行優(yōu)選,見(jiàn)表1。

表1 滇南血栓丸提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表

根據(jù)處方比例分別稱取各處方組成的藥味9份,按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn),將煎煮液過(guò)濾,濃縮至相對(duì)密度為1.1～1.2(60 ℃)。采用三因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)水煎煮工藝中的加水量、煎煮時(shí)間及煎煮次數(shù)進(jìn)行考察。黃芪作為君藥,以黃芪甲苷含量及出膏率為本試驗(yàn)考查指標(biāo),綜合評(píng)分分?jǐn)?shù)越高煎煮效果越好,利用方差分析優(yōu)化出最佳水提取工藝路線。確定水煎煮最佳工藝為A2B2C3,即加水8倍量,煎煮2次,每次1.5 h,見(jiàn)表2、表3。

表2 滇南血栓丸提取工藝優(yōu)選正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 綜合評(píng)分方差分析

2.1.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):按A2B2C3提取,對(duì)該工藝進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,測(cè)定干膏得率及黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率,表明其具有重現(xiàn)性,證明優(yōu)選條件可行,見(jiàn)表4。

表4 水提工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 丸劑起模條件考察

2.2.1 潤(rùn)濕劑濃度及用量考察:以不同濃度乙醇為潤(rùn)濕劑,過(guò)100目篩,鍋轉(zhuǎn)速控制在 20 r/min,篩取一定粒徑的顆粒,測(cè)定其粒徑分布及收率,于55 ℃干燥12 h;測(cè)圓整度、溶散時(shí)限、堆密度及脆碎度。表明乙醇濃度以70%為宜,見(jiàn)表5。

表5 潤(rùn)濕劑濃度考察結(jié)果

2.2.2 起模藥粉細(xì)度及用量考察:以70%乙醇為潤(rùn)濕劑,分別過(guò)80目、100目、120目篩,鍋轉(zhuǎn)速控制在20 r/min,篩取一定粒徑的顆粒,測(cè)定其粒徑分布及收率;取1.0～2.0 mm丸粒,55 ℃干燥12 h,測(cè)溶散時(shí)限、圓整度、堆密度及脆碎度。結(jié)果100目、120目篩藥粉起模效果相當(dāng),故選用100目篩,見(jiàn)表6。

表6 起模藥粉細(xì)度考察結(jié)果

2.3 成藥性與質(zhì)量控制[7-11]

2.3.1 色譜條件與適用性試驗(yàn):2020版藥典附錄項(xiàng)下高效液相色譜法的技術(shù)要求。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;乙腈—甲醇—0.2 mol/L磷酸緩沖液(20∶9∶71)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm,流速1.0 ml/min,進(jìn)樣量10 μl。理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)≥2 500。

2.3.2 回收率考察:精密吸取含量為19.03 mg/g的滇南血栓丸(批號(hào)20211121)5份,每份0.1 g,分別置具塞錐形瓶中,精密加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液2 mg,按“2.3.3”項(xiàng)下方法操作,即得加樣回收溶液。精密吸取加樣回收溶液10 μl,注入液相色譜儀中,按“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 黃芪甲苷的加樣回收試驗(yàn) (n=5)

2.3.3 精密度考察:精密吸取同一供試品溶液,批號(hào)為20211121,按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣操作,分別測(cè)定6次,記錄峰面積,黃芪甲苷的RSD為1.6%,表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn):按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液,批號(hào)為20211121;按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,黃芪甲苷的RSD為2.4%,表明本方法的重現(xiàn)性較好。

2.3.5 穩(wěn)定性考察:批號(hào)為20211121的供試品溶液于0、1、2、4、6、8、12、16 h,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定其色譜峰面積。色譜峰面積在8 h內(nèi)基本無(wú)變化,RSD為2.5%,表明試驗(yàn)條件下供試品溶液較穩(wěn)定。

2.3.6 樣品含量測(cè)定:取3個(gè)批號(hào)的滇南血栓丸每批取2份,精密稱取6份,按“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定,見(jiàn)表8。

表8 黃芪甲苷的含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

中醫(yī)藥在DVT的治療中有其獨(dú)特的療效,中醫(yī)的陰陽(yáng)辨證觀點(diǎn)認(rèn)為血栓性疾病為因寒致瘀,瘀血阻于血脈,痹而不通,水津外溢導(dǎo)致。血栓栓塞性疾病的中醫(yī)分型盡管名目繁多,從陰陽(yáng)辨證上歸根結(jié)底分為兩型:陰寒凝滯和瘀熱互結(jié)[11]。在血瘀病因上,《內(nèi)經(jīng)》最強(qiáng)調(diào)因寒致瘀,《素問(wèn)·調(diào)經(jīng)論》指出:“寒獨(dú)留,則血凝泣,凝則血脈不通。”目前,很多學(xué)者均主張采用涼血散瘀的方法治療。但筆者認(rèn)為靜脈血栓性疾病的本質(zhì)是一種因寒導(dǎo)致的疾病,故主張用活血化瘀的治療方法。為此在藥味組成上選用了黃芪、三七、木姜子和水蛭等中藥,在實(shí)際成藥性的過(guò)程中,以多個(gè)因素水平進(jìn)行考察,并對(duì)其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化,依據(jù)中醫(yī)理論基礎(chǔ),突出君藥黃芪中黃芪甲苷作為質(zhì)控參照評(píng)價(jià)指標(biāo),為進(jìn)一步的質(zhì)量控制和系統(tǒng)性研究做好基礎(chǔ)準(zhǔn)備工作。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突。