閔逸雯,王小兵,2*,陳悅,汪曉麗

(1.揚(yáng)州大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225127;2.江蘇省有機(jī)固廢廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225127)

聚乙烯(Polyethylene,PE)因其生產(chǎn)成本低、耐水、耐用等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)(如農(nóng)用地膜)、生活用品(如食品袋)、建筑(如管道)等領(lǐng)域,成為日常生活中不可替代的材料[1]。我國(guó)農(nóng)業(yè)設(shè)施較多,農(nóng)用聚乙烯薄膜應(yīng)用也較多。目前,中國(guó)使用的農(nóng)用塑料薄膜主要是12 μm以下的超薄薄膜,這種薄膜非常脆弱,容易破碎,難以回收利用[2]。據(jù)農(nóng)業(yè)部門統(tǒng)計(jì),中國(guó)耕地薄膜殘留量以60～90 kg/hm2為主,最高達(dá)160 kg/hm2。中國(guó)地膜覆蓋農(nóng)作物已有40多年的歷史,累計(jì)覆蓋面積達(dá)2 000萬(wàn)km2,進(jìn)入土壤的塑料薄膜超過(guò)2 000萬(wàn)t。中國(guó)農(nóng)田塑料薄膜殘留嚴(yán)重。

目前世界上處理這些極難自然分解的聚乙烯塑料的主要方法是填埋、焚燒[3]、堆肥等比較原始的方法。但這些方法都會(huì)造成生態(tài)環(huán)境的二次污染,填埋的塑料經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)變成危害較大的微塑料[4]。當(dāng)前研究認(rèn)為塑料生物降解是塑料向礦物材料轉(zhuǎn)化,增加土壤肥力,減少塑料垃圾向環(huán)境累積以及降低廢物管理成本等方面的一種有效手段。所以利用生物降解這一環(huán)境友好處理手段能較好解決治理塑料垃圾污染問(wèn)題。

從70年代開始就有研究報(bào)告PE塑料被微生物降解的情況,以PE是唯一碳源從土壤、垃圾填埋場(chǎng)、海洋、昆蟲腸道及其他不同生境中分離到的部分菌株可用于塑料的生物降解[5-6]。以垃圾填埋場(chǎng)為例,已有研究得到2株假單胞菌RD1-3、N1-2,它們均能對(duì)PBAT塑料進(jìn)行高效地降解[7]。這為PE塑料垃圾的治理提供一種新思路。

為了緩解殘留農(nóng)用地膜聚乙烯對(duì)設(shè)施農(nóng)田土壤的影響,本論文以農(nóng)用地膜塑料(聚乙烯,PE)為唯一碳源,采用富集培養(yǎng)法從設(shè)施農(nóng)田土壤中篩選高效降解菌,并探索可能的降解機(jī)制,為緩解廢棄農(nóng)用地膜污染,改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)供試PE地膜購(gòu)置于某農(nóng)用市場(chǎng)厚度為0.004 mm的農(nóng)用地膜。降解菌從高郵某設(shè)施大棚土壤中分離。

MSM培養(yǎng)基:MgSO40.20 g,CaCl20.02 g,KH2PO410.00 g,K2HPO41.00 g,NH4NO31.00 g,FeCl30.05 g,1.00 L蒸餾水,pH值7.00,121 ℃高壓滅菌20 min。NA培養(yǎng)基:胰蛋白胨 10.00 g,牛肉粉 3.00 g,氯化鈉 5.00 g,蒸餾水1.00 L,瓊脂,pH值7.30,121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 PE降解菌的分離和篩選

農(nóng)用地膜滅菌處理:將PE地膜剪成大小為2 cm×1.5 cm的片狀,然后依次浸泡于2% SDS、75%乙醇、95%乙醇中4 h,再用無(wú)菌水沖洗干凈,置于紫外滅菌燈下滅菌15 min。

采取高郵某設(shè)施大棚內(nèi)1 g新鮮土壤,加入100 mL 無(wú)菌水充分搖勻,制得土壤稀釋液;取20 μL稀釋液接種到100 mL MSM培養(yǎng)基中并加入1片預(yù)處理過(guò)的PE地膜,于25 ℃、150 r/min培養(yǎng),待菌液濃度上升并趨于穩(wěn)定后,取1 mL菌液到100 mL NA培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng),每7 d進(jìn)行一次傳代,3次重復(fù)。取0.2 mL培養(yǎng)液涂布于NA培養(yǎng)基,放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),長(zhǎng)出菌落后,按照菌落特征挑取單菌落,純化多次直到獲得純菌株,用NA 斜面培養(yǎng)基4 ℃保存。

1.2.2 PE降解菌對(duì)PE地膜降解效率

PE降解菌對(duì)PE地膜降解效率采用PE地膜失重率來(lái)計(jì)算。從初篩的PE降解菌斜面培養(yǎng)基接種到50 mL NA液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)18 h,再以0.5 μL接種量分別接種到50 mL含0.1 g 滅菌的PE地膜的MSM培養(yǎng)基中。于35 ℃、150 r/min培養(yǎng)28 d,將不接種菌懸液的含有PE農(nóng)用地膜的MSM培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng),作為空白對(duì)照(CK)。稱重培養(yǎng)前處理過(guò)的PE地膜質(zhì)量,記為m0。過(guò)濾回收降解實(shí)驗(yàn)后的PE地膜,采用70%乙醇進(jìn)行四階段清洗,放入50 ℃烘箱中過(guò)夜干燥后稱重,記為m1。計(jì)算公式如下:

PE地膜失重率=(m0-m1)/m0×100%

(1)

1.2.3 以PE為唯一碳源培養(yǎng)基中降解菌生長(zhǎng)曲線和pH值變化特征

取活化0.5 μL降解菌培養(yǎng)液接種于含有 2 g PE地膜的 100 mL MSM培養(yǎng)基中,27 ℃,120 r/min 振蕩培養(yǎng)28 d,每隔3 d對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行OD值和pH值測(cè)定。

1.2.4 降解菌對(duì)PE地膜的表面特征影響

將經(jīng)降解菌處理 28 d 后的塑料地膜樣品用蒸餾水洗滌 3 次,再用 75%乙醇沖洗,去除表面的細(xì)菌,使最大表面暴露出來(lái),以便觀察。在25 mA、0.3 MPa氬氣氣氛下濺射金微塑料涂層,使用S-4800掃描電子顯微鏡(SEM,株式會(huì)社日立制作所)進(jìn)行分析。

1.2.5 降解菌對(duì)PE地膜的表面官能團(tuán)的影響

用 Nexus 670 FTIR 光譜儀(美國(guó) Nicolet)對(duì)PE地膜進(jìn)行FTIR表征,長(zhǎng)度范圍為 4 000～400 cm-1,分辨率為 4 cm-1,掃描次數(shù)為 20 次。

1.2.6 降解菌株16S rDNA測(cè)定

降解菌基因組 DNA的提取方法均按常規(guī)方法操作[8]。用Power Soil DNA Isolation Kit(MO BIO)試劑盒提取降解菌DNA,采用微生物通用引物515FmodF(5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') 806RmodR(5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3') 對(duì)16S rRNA基因V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增程序如下:95 ℃預(yù)變性3 min,27個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s),然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min,最后在4 ℃進(jìn)行保存,檢測(cè)合格后使用Illumina Miseq平臺(tái)測(cè)序。在EzBioCloud網(wǎng)站進(jìn)行Blast序列比對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹分析,鑒定菌株種屬?；驕y(cè)序委托南京生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 PE降解菌的篩選

以PE農(nóng)用地膜為唯一碳源,通過(guò)富集培養(yǎng)法從設(shè)施大棚土壤中獲得四種不同菌落形態(tài)的菌株,將四株菌株命名為BP1、BP2、BP3和BP4。采用PE地膜失重率來(lái)計(jì)算PE降解菌對(duì)PE地膜降解效率,結(jié)果見圖1。結(jié)果表明,BP1、BP2、BP3和BP4四株菌降解率分別為9.99%,6.98%,8.35%和6.43%。BP1降解效果顯著高于其他三株菌株。

圖1 不同菌株培養(yǎng)基中微塑料的降解率

在NA培養(yǎng)基上,BP1菌株菌落呈現(xiàn)出奶白色、濕潤(rùn)的圓形,表面光滑濕潤(rùn)且有光澤,邊緣光滑,中心有凸起(圖2)。

圖2 BP1菌落形態(tài)

2.2 以PE為唯一碳源培養(yǎng)基中BP1菌株生長(zhǎng)曲線和pH值變化特征

以PE地膜為唯一碳源,BP1生長(zhǎng)曲線見圖3。0～3 d,BP1菌株適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境,開始代謝繁殖,增長(zhǎng)較為緩慢;3～15 d,BP1菌株增長(zhǎng)速率顯著提高,說(shuō)明細(xì)菌可以利用PE地膜作為唯一碳源來(lái)進(jìn)行自身的生長(zhǎng)繁殖;15～28 d,BP1繁殖速度下降,生物量趨于平緩。

圖3 降解過(guò)程中菌株生物量變化

pH值的變化表明細(xì)菌在進(jìn)行新陳代謝,這使微生物能夠繼續(xù)生長(zhǎng)。每隔3 d測(cè)量一次液體培養(yǎng)基的pH值,結(jié)果見圖4。培養(yǎng)基在第14 d達(dá)到最低的pH值8.6,然后逐漸上升并穩(wěn)定下來(lái);Gong等人[9]認(rèn)為,與塑料一起培養(yǎng)的微生物能逐漸緩慢地降解塑料,降解過(guò)程中改變了塑料聚合物基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu),分泌出酸性副產(chǎn)品,使培養(yǎng)基的pH值降低。而在這個(gè)過(guò)程具有代謝活性微生物分泌多種胞內(nèi)和胞外酶到培養(yǎng)基中,這些酶可能在聚合物降解中發(fā)揮了作用。在聚合物降解過(guò)程中,復(fù)雜的聚合物首先被外酶分解成短鏈或單體,這些外酶足夠小,可以穿透細(xì)胞壁,在解聚過(guò)程中被用作碳或能量來(lái)源[10]。

圖4 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的pH值變化

2.3 微塑料表征

2.3.1 SEM結(jié)果分析

通過(guò)掃描電鏡(SEM)分析降解菌BP1處理后PE農(nóng)用地膜的表面變化情況。在經(jīng)過(guò)BP1菌株處理28 d后,PE農(nóng)用地膜表面發(fā)生一些凹槽、生物侵蝕,未經(jīng)過(guò)BP1菌株處理PE地膜表面光滑平整(圖5);從圖5中很清楚可以看到有菌落黏附在薄膜表面,這可能是由于微生物菌種處理塑料薄膜后發(fā)生的酶解過(guò)程。經(jīng)過(guò)BP1菌株處理后,薄膜的表面產(chǎn)生破損,增加了薄膜的粗糙度,表明降解菌已經(jīng)對(duì)地膜進(jìn)行了生物降解。

圖5 PE地膜塑料降解前后表面形態(tài)特征

2.3.2 FTIR結(jié)果分析

FTIR可以觀察到化學(xué)分子的變化,任何官能團(tuán)的形成或消失,任何氧化劑或填充物的存在。通過(guò)FTIR對(duì)BP1降解菌處理前后PE農(nóng)用地膜表明官能團(tuán)變化進(jìn)行分析(圖6)。

圖6 PE地膜塑料降解前后FTIR光譜特征

當(dāng)微生物引入氧化基團(tuán)時(shí),非極性鍵轉(zhuǎn)化為極性鍵,導(dǎo)致不穩(wěn)定性增加,并為微生物定居和酶斷裂提供場(chǎng)所[11]。BP1菌株處理后的PE農(nóng)用地膜與對(duì)照相比,出現(xiàn)一些波長(zhǎng)峰的消減,從圖6中可以發(fā)現(xiàn),1 305,2 900 cm-1的振動(dòng)峰有明顯削弱和位置偏移,其中C-H伸縮振動(dòng)峰在2 900 cm-1處削弱,1 740 cm-1處酯羰基指數(shù)降低。PE是一種線性飽和碳?xì)浠衔?C-H 伸縮振動(dòng)峰與酯羰基指數(shù)的變化間接說(shuō)明降解菌株已在攻擊利用PE而導(dǎo)致 C-H 減弱,表明接種菌株使PE農(nóng)用地膜發(fā)生了生物降解,導(dǎo)致其表面的化學(xué)功能團(tuán)發(fā)生了變化。

2.4 PE降解菌的分子生物學(xué)鑒定

將BP1進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定。將擴(kuò)增片段送往南京生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序,顯示擴(kuò)增子序列長(zhǎng)度為1 490 bp(獲得序列登錄號(hào) ON545815),將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast對(duì)比,利用MEGA11.0構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹如圖7所示。結(jié)合BP1的形態(tài)特征與形態(tài)特性,結(jié)果表明BP1菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。鑒定該菌為芽孢桿菌屬的一種。

圖7 BP1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

(1)以PE農(nóng)用地膜為唯一碳源篩選到BP1、BP2、BP3和BP4四株P(guān)E降解菌,其中BP1菌株降解效率達(dá)到9.99%。

(2)經(jīng)過(guò)BP1菌株降解后,PE農(nóng)用地膜產(chǎn)生了孔洞、裂痕和凹坑,PE農(nóng)用地膜表面酯羰基指數(shù)降低。

(3)通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分析表明,BP1菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilissp.),BP1菌株顯著提高PE農(nóng)用地膜的降解速率,這為緩解廢棄農(nóng)用地膜污染問(wèn)題,改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境提供理論支撐。