毛勇 宋宇 江西省藥品認(rèn)證審評(píng)中心（江西省醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心） （江西 南昌 330000）

內(nèi)容提要： 從體外診斷試劑注冊(cè)技術(shù)審評(píng)角度出發(fā)，概述液質(zhì)色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）檢測(cè)25-羥基維生素D在臨床上的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)此類產(chǎn)品的審評(píng)要點(diǎn)展開討論，重點(diǎn)討論性能研究、臨床評(píng)價(jià)研究等，以期為注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)該類產(chǎn)品在研發(fā)和注冊(cè)過程提供技術(shù)指導(dǎo)和參考依據(jù)。

維生素D又稱25-羥基維生素D（25(OH)D），為脂溶性維生素，已有研究表明其具有多重生物學(xué)作用。維生素D在人體內(nèi)主要以兩種分子形式存在，分別為維生素D2（25(OH)D2）和維生素D3（25(OH)D3），通常人體維生素D（25(OH)D）的含量即代表25(OH)D2和25(OH)D3含量的總和[1]。25(OH)D不僅在保證人體內(nèi)鈣離子和磷離子的動(dòng)態(tài)平衡方面起著關(guān)鍵作用，能和鈣離子一起促進(jìn)兒童骨骼的形成和維持成人骨骼強(qiáng)度，它的缺乏將會(huì)致使兒童佝僂病及成人軟骨病的發(fā)生[2]。此外，血清25(OH)D的濃度還與肌肉力量、大小以及非特異肌肉酸痛有關(guān)[3]。因此，半衰期長(zhǎng)、性質(zhì)穩(wěn)定的25(OH)D被認(rèn)為是評(píng)價(jià)體內(nèi)維生素D水平的重要指標(biāo)，開展高質(zhì)量的25(OH)D檢測(cè)具有非常重要的臨床意義[4]。本文重點(diǎn)關(guān)注25(OH)D液質(zhì)色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid Chromatography-Massspectrometry/Mass Spectrometry，LC-MS/MS）在臨床的應(yīng)用，并且與作者在醫(yī)療器械及體外診斷試劑產(chǎn)品注冊(cè)技術(shù)審評(píng)工作中的實(shí)際體會(huì)相結(jié)合，對(duì)25(OH)D產(chǎn)品的臨床性能評(píng)價(jià)給出一些建議。

1.25(OH)D檢測(cè)方法及應(yīng)用范圍

目前臨床上普遍應(yīng)用的25(OH)D檢測(cè)方法包括：化學(xué)發(fā)光法、免疫分析法以及LC-MS/MS等多種方法[5]。不同的診斷方法有各自的優(yōu)勢(shì)和局限性。已有研究表明，LC-MS/MS方法學(xué)與傳統(tǒng)的生化免疫方法學(xué)相比，前者用于小分子待測(cè)物的定量檢測(cè)更加準(zhǔn)確，如激素類、維生素類、各類藥物及其代謝物等小分子物質(zhì)[6]。該方法學(xué)在低濃度被測(cè)物檢測(cè)和多組分聯(lián)合檢測(cè)中具有顯著的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)2022年歐洲微量營養(yǎng)素指南，總25(OH)D的血清/血漿濃度，即25(OH)D3和25(OH)D2的總和，被認(rèn)為是維生素D狀態(tài)的有效生物標(biāo)志物；LC-MS/MS是檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)方法，因此，《臨床兒科雜志》已明確指出，在兒童維生素D有關(guān)的定量測(cè)定研究中，建議使用歐洲微量營養(yǎng)素指南中推薦的黃金標(biāo)準(zhǔn)來定量測(cè)定25(OH)D，即LC-MS/MS法[7]。

在臨床當(dāng)中，維生素D具有多種生物學(xué)作用，如可促進(jìn)小腸鈣吸收[8]；促進(jìn)腎小管對(duì)鈣、磷的重吸收[9]；調(diào)節(jié)血鈣平衡；其代謝物參與多種骨代謝途徑等[10]。因此，25(OH)D的檢測(cè)對(duì)于多類人群的健康評(píng)估與臨床診斷有良好的參考價(jià)值。研究表明，妊娠期并發(fā)癥及妊娠結(jié)局與孕婦血清25(OH)D水平具有良好的相關(guān)性[11]；血清25(OH)D可用于診斷絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，為臨床預(yù)防、干預(yù)治療提供一定的依據(jù)[12]。此外，開展25(OH)D檢測(cè)對(duì)產(chǎn)后出血預(yù)測(cè)、維生素D缺乏性佝僂病、慢性氣道疾病、老年慢性阻塞性肺疾病、妊娠糖尿病預(yù)測(cè)等多種疾病的輔助診斷或預(yù)測(cè)具有關(guān)鍵作用。因此，及時(shí)了解人體內(nèi)25(OH)D含量的狀況并實(shí)現(xiàn)對(duì)25(OH)D的個(gè)體化及時(shí)補(bǔ)充具有十分重要的意義。

綜上可知，在現(xiàn)有的認(rèn)知下，LC-MS/MS法檢測(cè)試劑在25(OH)D檢測(cè)中的優(yōu)點(diǎn)和大量的臨床應(yīng)用已得到廣泛認(rèn)可。在臨床應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)條件選擇更優(yōu)的檢測(cè)方法并規(guī)范應(yīng)用，對(duì)于有條件的檢測(cè)機(jī)構(gòu)，盡可能采取準(zhǔn)確性高的檢測(cè)方法，提高檢測(cè)結(jié)果和臨床診斷的準(zhǔn)確性[13]。

2.分析性能研究

LC-MS/MS方法測(cè)定25(OH)D試劑的注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)確保原材料和工藝技術(shù)已在確認(rèn)的條件下進(jìn)行驗(yàn)證及測(cè)試，并且在質(zhì)量管理系統(tǒng)有效運(yùn)行以及確保產(chǎn)品質(zhì)量符合要求的前提下，進(jìn)一步對(duì)擬申報(bào)產(chǎn)品進(jìn)行其性能分析及評(píng)估[14]。對(duì)于分析及評(píng)估性能的樣本，應(yīng)保持其與實(shí)際臨床中使用的樣本一致，一般來說，產(chǎn)品質(zhì)控品和參考品不能作為性能評(píng)估的樣本[15]。

2.1 校準(zhǔn)品及質(zhì)控品性能評(píng)估（如適用）

校準(zhǔn)品是體外診斷試劑產(chǎn)品成分的重要部分，一般情況下它的用途是在試劑進(jìn)行檢測(cè)時(shí)對(duì)檢測(cè)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)。在申請(qǐng)人申報(bào)資料內(nèi)，闡述校準(zhǔn)品溯源性的技術(shù)文件應(yīng)詳細(xì)描述校準(zhǔn)品溯源鏈的詳細(xì)信息以及該校準(zhǔn)品溯源鏈頂端所用的參考測(cè)量程序，同時(shí)也應(yīng)包括溯源鏈頂端傳遞至下一級(jí)時(shí)所符合的標(biāo)準(zhǔn)、計(jì)算方法以及不確定度的影響因素等[15]。針對(duì)25(OH)D檢測(cè)試劑的校準(zhǔn)品和質(zhì)控品，申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)對(duì)其性能進(jìn)行合理的評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)內(nèi)容應(yīng)至少應(yīng)當(dāng)包含外觀、準(zhǔn)確度和均一性。

2.2 準(zhǔn)確度

體外診斷試劑產(chǎn)品的準(zhǔn)確度性能代表的是該檢測(cè)試劑針對(duì)待測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果與待測(cè)物質(zhì)的真實(shí)值之間的接近程度，LC-MS/MS方法檢測(cè)25(OH)D試劑的準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)方法主要有以下幾種：回收試驗(yàn)、參考物質(zhì)檢測(cè)、比對(duì)試驗(yàn)等。在上述方法中，建議申請(qǐng)人優(yōu)先使用參考物質(zhì)檢測(cè)方法。通常用相對(duì)偏差來評(píng)估準(zhǔn)確度性能，針對(duì)25(OH)D國家已經(jīng)發(fā)布了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，注冊(cè)申請(qǐng)人在研究和評(píng)價(jià)該試劑的準(zhǔn)確度性能時(shí)，可以考慮使用國家標(biāo)準(zhǔn)品[16]。在使用國家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行性能評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)當(dāng)著重考量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的偏差值。申報(bào)試劑對(duì)25(OH)D國家標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)測(cè)值與相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)際值相對(duì)偏差≤±15%。

2.3 精密度

體外診斷試劑的精密度性能反映的是檢測(cè)試劑多次測(cè)定某物質(zhì)的不同結(jié)果之間的相近程度，精密度評(píng)價(jià)結(jié)果通常受到隨機(jī)測(cè)量誤差大小的影響。重復(fù)性、中間精密度和再現(xiàn)性是精密度性能的三個(gè)重要組成部分。重復(fù)性一般反映同一測(cè)試人員在同一測(cè)試背景下（如實(shí)驗(yàn)環(huán)境、測(cè)試儀器、測(cè)量系統(tǒng)、產(chǎn)品批次等）對(duì)同一產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)所獲得的結(jié)果，此結(jié)果也稱為室內(nèi)精密度。中間精密度通常反映測(cè)試人員在同一測(cè)試實(shí)驗(yàn)室不同條件下（如實(shí)驗(yàn)時(shí)間、操作員、儀器、設(shè)備參數(shù)等）獲得的測(cè)量結(jié)果。而再現(xiàn)性通常表示在不同的測(cè)試地點(diǎn)、不同實(shí)驗(yàn)者及不同條件下針對(duì)目標(biāo)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果的精密度，該性能通常代表室間精密度。申請(qǐng)人對(duì)25(OH)D試劑進(jìn)行精密度研究時(shí)，應(yīng)將試驗(yàn)者、檢測(cè)儀器、試劑的生產(chǎn)批次、校準(zhǔn)信息（校準(zhǔn)品的批次，校準(zhǔn)的周期）、試驗(yàn)地點(diǎn)、試驗(yàn)時(shí)間、試驗(yàn)環(huán)境和條件等因素貫穿精密度研究的整個(gè)過程中[16]。

2.4 檢測(cè)限

體外診斷試劑產(chǎn)品的檢測(cè)限指標(biāo)通常包含空白限、檢出限以及定量限等，而對(duì)于25(OH)D而言，其在正常人群樣本中的測(cè)量值區(qū)間約為30～60ng/mL。因此，最低檢測(cè)限值過小可能沒有實(shí)際臨床意義。因此，針對(duì)25(OH)D檢測(cè)試劑，申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)至少對(duì)定量限性能進(jìn)行建立及驗(yàn)證。定量限性能應(yīng)充分考慮可能出現(xiàn)的異常值和精密度要求，并確保定量限的檢測(cè)值符合預(yù)設(shè)的準(zhǔn)確度指標(biāo)。

2.5 線性范圍

對(duì)于LC-MS/MS法25(OH)D檢測(cè)試劑產(chǎn)品而言，產(chǎn)品的線性范圍的下限應(yīng)大于零，產(chǎn)品申請(qǐng)人可使用不同濃度的臨床樣本，配制一系列具有濃度梯度的臨床樣本，以研究和驗(yàn)證樣本的線性范圍，在檢驗(yàn)方法中，應(yīng)當(dāng)明確配制不同濃度臨床樣本的個(gè)數(shù)，濃度應(yīng)覆蓋線性范圍的最高值和最低值。在進(jìn)行線性范圍的驗(yàn)證時(shí)，可以選擇5～7個(gè)濃度水平樣本進(jìn)行驗(yàn)證[16]。此時(shí)選用的5～7個(gè)濃度水平應(yīng)能夠覆蓋全部預(yù)期的檢測(cè)范圍，并且能夠包括與臨床意義直接相關(guān)的重要評(píng)價(jià)濃度，如試劑的最小測(cè)定濃度或線性范圍的最低限、試劑的最大測(cè)定濃度或線性范圍的高限等。申請(qǐng)人應(yīng)采用申報(bào)的25(OH)D檢測(cè)試劑對(duì)每個(gè)濃度的臨床樣本最低重復(fù)測(cè)試3次，并且計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的平均值，將檢測(cè)結(jié)果的平均值和稀釋比例用最小二乘法進(jìn)行線性擬合，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)r。一般而言，25(OH)D檢測(cè)試劑的線性范圍應(yīng)當(dāng)覆蓋[8.1, 70.0]ng/mL，且在申請(qǐng)人聲稱的區(qū)間內(nèi)，r應(yīng)≥0.99。保證產(chǎn)品能滿足臨床檢測(cè)的需要。

3.臨床評(píng)價(jià)研究

臨床評(píng)價(jià)和臨床試驗(yàn)是體外診斷試劑的主要評(píng)估途徑，25(OH)D檢測(cè)試劑的反應(yīng)原理和預(yù)期用途明確，生產(chǎn)工藝及流程已經(jīng)完善，并且產(chǎn)品已列入《免于臨床試驗(yàn)的體外診斷試劑目錄》[6]。因此，申請(qǐng)人可以將25(OH)D檢測(cè)試劑和同類產(chǎn)品的方法學(xué)進(jìn)行比較，來驗(yàn)證25(OH)D檢測(cè)試劑的安全性和有效性。截止2023年6月，我國境內(nèi)已有大量生產(chǎn)企業(yè)獲得了包括LC-MS/MS方法學(xué)在內(nèi)各類25(OH)D檢測(cè)試劑注冊(cè)證書，申請(qǐng)人可依據(jù)自身產(chǎn)品特點(diǎn)選擇合適的境內(nèi)已上市同品種產(chǎn)品進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)。如申請(qǐng)人對(duì)申報(bào)產(chǎn)品臨床評(píng)價(jià)資料有特定要求或申報(bào)的25(OH)D檢測(cè)試劑有特殊的臨床用途，申請(qǐng)人也可以采用在兩家或兩家以上臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展臨床試驗(yàn)的方式進(jìn)行25(OH)D檢測(cè)試劑的臨床評(píng)價(jià)，臨床試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)符合《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》，臨床試驗(yàn)的過程需要遵守《醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求。臨床評(píng)價(jià)過程中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。

3.1 比對(duì)方法的選擇

由于25(OH)D檢測(cè)項(xiàng)目廣泛應(yīng)用于臨床各個(gè)領(lǐng)域，有大量境內(nèi)及進(jìn)口產(chǎn)品已在國內(nèi)上市，并且包含各類方法學(xué)的檢測(cè)試劑一應(yīng)俱全。因此對(duì)申請(qǐng)人來說，最經(jīng)濟(jì)、最合理的研究方法是在方法學(xué)比較試驗(yàn)中使用已上市的同類產(chǎn)品。在選擇同類產(chǎn)品時(shí)，申請(qǐng)人應(yīng)盡可能選擇方法學(xué)與性能近似待檢測(cè)試劑的產(chǎn)品作為比對(duì)試劑。如申請(qǐng)人認(rèn)為自身所申報(bào)的25(OH)D檢測(cè)試劑產(chǎn)品優(yōu)于同方法學(xué)的已獲證試劑，也可以采用準(zhǔn)確性、線性范圍等性能指標(biāo)相近的其他方法學(xué)的檢測(cè)試劑作為比對(duì)試劑，由于LC-MS/MS方法是小分子物質(zhì)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于LC-MS/MS法25(OH)D檢測(cè)試劑而言，應(yīng)盡可能優(yōu)先與LC-MS/MS方法學(xué)已上市試劑進(jìn)行比對(duì)。

3.2 研究樣本的選擇

申請(qǐng)人在臨床評(píng)價(jià)試驗(yàn)中使用的樣本應(yīng)包括以下信息：樣本來源、樣本類型、樣本儲(chǔ)存狀態(tài)、可追溯編號(hào)、臨床診斷信息（樣本濃度超出參考范圍的患者）等，樣本總數(shù)也應(yīng)符合統(tǒng)計(jì)和法規(guī)要求。在所有被使用的臨床樣本中，應(yīng)含有合理數(shù)量包含干擾物的樣本，同時(shí)所有被使用的臨床樣本的25(OH)D濃度應(yīng)能夠覆蓋具有臨床意義的25(OH)D濃度范圍。在進(jìn)行臨床樣本選擇時(shí)，應(yīng)當(dāng)充分考慮到年齡、性別的差異，所使用的臨床樣本盡可能覆蓋產(chǎn)品預(yù)期適用的各類人群。

3.3 檢測(cè)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

在臨床評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)后，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)過程的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和分析，首先應(yīng)繪制散點(diǎn)圖和差異圖，可直觀地體現(xiàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)是否覆蓋了具有臨床意義的25(OH)D濃度范圍、檢測(cè)數(shù)據(jù)在25(OH)D濃度范圍內(nèi)的分布情況以及是否存在離群值等，一般情況下，離群值的個(gè)數(shù)不應(yīng)超過2.5%。同時(shí)，申請(qǐng)人應(yīng)明確回歸分析方法和對(duì)申報(bào)試劑和比對(duì)試劑偏倚的評(píng)價(jià)。偏倚的評(píng)價(jià)一般將醫(yī)學(xué)決定水平處的預(yù)期偏倚及其95%可信區(qū)間與申報(bào)產(chǎn)品的可接受偏倚的限值進(jìn)行比較。

4.小結(jié)

在前人的研究中，已證明25(OH)D具有多重生物學(xué)作用，因此，對(duì)該項(xiàng)目開展準(zhǔn)確的臨床檢測(cè)，亦具有重要的意義。檢測(cè)25(OH)D方法有多種，其中LC-MS/MS方法學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品因其方法的優(yōu)點(diǎn)而具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。相關(guān)產(chǎn)品的注冊(cè)申請(qǐng)人可通過嚴(yán)格篩選原材料，優(yōu)化產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝，保證25(OH)D檢測(cè)試劑產(chǎn)品具備良好的性能，成為臨床中多種相關(guān)疾病有效的輔助診斷和療效評(píng)價(jià)的工具。作者根據(jù)現(xiàn)行的體外診斷試劑相關(guān)法規(guī)和注冊(cè)申報(bào)的相關(guān)信息要求，總結(jié)分析了LC-MS/MS測(cè)定25(OH)D檢測(cè)試劑的注冊(cè)申報(bào)過程中相關(guān)技術(shù)文件的技術(shù)審評(píng)方向。并且對(duì)分析性能研究及臨床研究等方面作了概述，希望本文可為L(zhǎng)C-MS/MS法測(cè)定25(OH)D檢測(cè)試劑的注冊(cè)申請(qǐng)人在研發(fā)、注冊(cè)過程中提供技術(shù)指導(dǎo)，同時(shí)為藥品監(jiān)督管理部門審評(píng)人員提供參考依據(jù)。