劉茉莉 王輝 季芳 劉美林 何靜云

1 國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評檢查大灣區(qū)分中心 （廣東 深圳 518000）

2 國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心 （北京 100081）

內(nèi)容提要： 結(jié)直腸癌早期診斷能夠有效提升患者的生存率，結(jié)直腸鏡檢查結(jié)合病理活檢作為結(jié)直腸癌確診的金標(biāo)準(zhǔn)，其有創(chuàng)檢測的特性存在一定的局限性，因此建立一種無創(chuàng)的早期診斷方法具有一定的臨床使用價值，是對傳統(tǒng)檢測方法的有效補充。文章重點關(guān)注結(jié)直腸癌基因甲基化試劑盒在結(jié)直腸癌檢測中的應(yīng)用，結(jié)合在體外診斷試劑注冊審評工作中的經(jīng)驗，對相關(guān)產(chǎn)品臨床性能評價給出建議。

我國結(jié)直腸癌發(fā)病率高，晚期結(jié)直腸癌病死率高，嚴(yán)重危害人民健康。2020年中國癌癥統(tǒng)計報告顯示：我國結(jié)直腸癌發(fā)病率、病死率在全部惡性腫瘤中分別位居第2及第5位，多數(shù)患者在確診時已屬于中晚期[1]。研究表明，對結(jié)直腸癌進(jìn)行早期檢測能夠有效地預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生，以及降低結(jié)直腸癌病死率[2]。多數(shù)早期結(jié)直腸癌可以治愈，5年生存率可以達(dá)到90%，而晚期則不足10%[3]。世界主要發(fā)達(dá)國家均已實施針對全國人口的結(jié)直腸腫瘤早診篩查，將其作為基本公共衛(wèi)生服務(wù)。近年來國家衛(wèi)健委以結(jié)直腸癌等高發(fā)癌癥篩查和早診早治為切入點，出臺了一系列診療規(guī)范和方案，推進(jìn)癌癥防控關(guān)口前移，促進(jìn)癌癥早預(yù)防、早篩查、早發(fā)現(xiàn)、早治療。臨床上，通過糞便潛血試驗/糞便免疫化學(xué)試驗分析糞便中的微量血液，被廣泛用于結(jié)直腸癌的早期篩查，但由于其靈敏性和特異性較低使其受到限制[4]。而結(jié)直腸鏡檢查結(jié)合病理活檢是臨床上公認(rèn)的用于結(jié)直腸癌確診的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確度高，但也有其自身的局限性：主要表現(xiàn)在其過程繁瑣且耗時，而且作為一種有創(chuàng)的侵入性檢查方法，有出血和穿孔的風(fēng)險，因此患者依從性差，不利于早期診斷[5]。近年來非侵入性的結(jié)直腸癌診斷方法發(fā)展迅速，該方法主要通過檢測糞便或血液標(biāo)本中與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)的生物標(biāo)志物，對傳統(tǒng)檢測方法是一種很好的補充手段，尤其針對特定的人群，如對結(jié)直腸鏡檢測依從性比較差的患者。

1.結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)

癌癥生物標(biāo)志物可以定義為在體液或組織中發(fā)現(xiàn)的一種客觀可測量的生物分子，例如蛋白質(zhì)、代謝物、RNA、DNA或表觀遺傳改變，它們提示癌癥的存在或提供有關(guān)癌癥預(yù)后的信息[6,7]。而異常DNA甲基化作為基于表觀遺傳的生物標(biāo)志物，由于其發(fā)生在癌癥早期，且具有癌癥特異性、生物穩(wěn)定性和在體液或組織檢測中的可及性，引起了人們的注意，成為腫瘤早期檢測強吸引力的研究目標(biāo)[7]。

DNA甲基化是指甲基基團在催化作用下被添加至胞嘧啶第5號碳的殘基上的修飾過程，目前發(fā)現(xiàn)主要存在于基因表達(dá)調(diào)控元件中的CpG島，是一種化學(xué)修飾[8]。DNA甲基化通過控制基因表達(dá)和基因組穩(wěn)定性來定義細(xì)胞類型和譜系，是細(xì)胞生長發(fā)育過程重要的調(diào)控機制。DNA甲基化控制機制的破壞會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，包括癌癥。異常的DNA甲基化被認(rèn)為發(fā)生在癌癥發(fā)展的早期階段，且特定基因甲基化似乎發(fā)生在不同的腫瘤階段[9]。癌細(xì)胞DNA異常甲基化主要表現(xiàn)為全基因組低甲基化和位點特異性高甲基化，因此特定基因位點的甲基化可作為重要的腫瘤早期檢測的分子標(biāo)志物[10,11]。

目前，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的與結(jié)直腸癌高度相關(guān)的基因甲基化位點有SDC2、Septin9、BMP3、NDRG4等。SDC2基因編碼蛋白可介導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的黏附等功能，與結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖密切相關(guān)。與正常結(jié)直腸組織相比，SDC2基因在不同分期的結(jié)直腸癌和部分腸進(jìn)展期腺瘤組織中呈現(xiàn)高度的甲基化現(xiàn)象[12]。Septin 9（SEPT9）是一種參與胞質(zhì)分裂和細(xì)胞周期控制的基因，研究表明，血清Septin9基因甲基化檢測在結(jié)直腸癌中有較高的敏感性和特異性，多項薈萃分析提示SEPT9檢測可運用于結(jié)直腸癌檢查中[13,14]。

隨著腫瘤液體活檢技術(shù)的興起，通過在血液樣本中檢測循環(huán)腫瘤DNA，即可獲得患者體內(nèi)腫瘤的全景數(shù)據(jù)，全面反映與腫瘤組織相同的突變基因組信息。又因為腸道細(xì)胞容易脫落至腸腔，而結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞分裂速度較快且對基底膜黏附性降低，會持續(xù)不斷地脫落至糞便中，因此通過檢測血液樣本或糞便樣本中DNA甲基化成為結(jié)直腸癌主要的無創(chuàng)檢測手段。

2.結(jié)直腸癌基因甲基化輔助診斷產(chǎn)品國內(nèi)外現(xiàn)狀及臨床試驗研究建議

隨著我國國家藥品監(jiān)督管理局和美國食品藥品監(jiān)督管理局相繼批準(zhǔn)血漿SEPT9基因甲基化試劑，用于特定人群結(jié)直腸癌的輔助診斷，基因甲基化檢測產(chǎn)品處于持續(xù)的申報過程中。目前獲批的與結(jié)直腸癌檢測相關(guān)的甲基化位點主要為SEPT9基因、SDC2基因等，產(chǎn)品多為二者的單靶點檢測試劑或多個基因甲基化位點聯(lián)合檢測試劑盒。這一類產(chǎn)品目前在國內(nèi)按照體外診斷試劑第三類進(jìn)行管理，其風(fēng)險收益情況需要嚴(yán)格按照醫(yī)療器械臨床試驗管理規(guī)范的要求通過臨床試驗進(jìn)行驗證。

針對這一類產(chǎn)品在臨床試驗評價中遇到的問題以及需要實現(xiàn)的目的，本文將從審評的角度提出以下幾點建議：

該類產(chǎn)品根據(jù)預(yù)期用途分為輔助診斷類產(chǎn)品和篩查類產(chǎn)品。對于輔助診斷類產(chǎn)品，預(yù)期用途限定為：針對需要但因主觀或客觀原因不愿或不能進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查患者的結(jié)直腸癌輔助診斷，不得用于人群篩查。該類產(chǎn)品臨床試驗可以針對結(jié)直腸癌不同分期患者和非結(jié)直腸癌患者進(jìn)行富集入組，即回顧性入組的方式獲得樣本，目前已經(jīng)獲批的多個基因甲基化單靶點或多靶點檢測試劑即通過這種方式進(jìn)行臨床試驗。如已經(jīng)獲批的人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒（熒光PCR法）即通過回顧性入組的方式納入有效病例數(shù)1213例，其中結(jié)直腸癌病例374例，非結(jié)直腸癌病例839例；對于篩查類產(chǎn)品，預(yù)期用途分為針對平均風(fēng)險人群（40～74歲，無相關(guān)癥狀，無結(jié)直腸癌家族史等高風(fēng)險因素）的結(jié)直腸癌篩查和對結(jié)直腸癌高風(fēng)險的人群（40～74歲，便潛血陽性、問卷風(fēng)險評估陽性或結(jié)直腸癌家族史等）進(jìn)行“精篩”，篩查陽性者應(yīng)進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查。且篩查類產(chǎn)品對于產(chǎn)品的性能指標(biāo)有更高的要求，目前沒有單獨通過基因甲基化檢測獲批用于篩查的產(chǎn)品，美國食品藥品監(jiān)督管理局和我國國家藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)的均為糞便免疫化學(xué)試驗-DNA聯(lián)合檢測試劑盒。針對該類篩查類產(chǎn)品，則需要對預(yù)期的篩查人群進(jìn)行前瞻性入組，目前已批準(zhǔn)的KRAS基因突變及BMP3/NDRG4基因甲基化和大便潛血聯(lián)合檢測試劑盒（PCR熒光探針法-膠體金法）產(chǎn)品，即通過前瞻性隨機入組4245例結(jié)直腸癌高風(fēng)險受試者的方式進(jìn)行臨床試驗。

對于這兩類產(chǎn)品的臨床評價指標(biāo)也不一樣。對于輔助診斷類產(chǎn)品，主要通過已上市同類產(chǎn)品或者臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對，評價考核試劑的臨床靈敏度、特異度或陽性/陰性符合率等評價指標(biāo)。目前已獲批試劑的臨床性能，與臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)對比，靈敏度達(dá)在85%左右，特異度90%以上。而對于篩查類產(chǎn)品，除了評價考核試劑的臨床靈敏度和特異度，還應(yīng)對產(chǎn)品陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值進(jìn)行系統(tǒng)性評價。目前已獲批的KRAS基因突變及BMP3/NDRG4基因甲基化和大便潛血聯(lián)合檢測試劑盒（PCR熒光探針法-膠體金法）針對高風(fēng)險結(jié)直腸癌患者篩查的靈敏度達(dá)到90%以上，對進(jìn)展期腺瘤患者篩查靈敏度超過60%；結(jié)直腸癌篩查陰性預(yù)測值達(dá)到99.6%。較以往糞便/血漿DNA分子檢測產(chǎn)品靈敏度有顯著提高，特別是針對進(jìn)展期腺瘤的檢出率顯著提高。

對于基因甲基化檢測試劑盒，在進(jìn)行臨床試驗時，應(yīng)重點考慮選擇新基因位點的臨床意義，應(yīng)有充分的證據(jù)證明該基因位點與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展具有直接的關(guān)系，對于多靶點聯(lián)合檢測的產(chǎn)品，應(yīng)充分論證多靶點組合的臨床意義，對于其陽性判斷值的設(shè)置應(yīng)科學(xué)合理。而為了充分評價產(chǎn)品性能，應(yīng)納入所有分期及病理分型的結(jié)直腸癌樣本，特別是應(yīng)納入進(jìn)展期腺瘤和早期結(jié)直腸癌患者樣本，以驗證基因甲基化試劑盒對結(jié)直腸癌早期診斷的臨床性能。同時，為了評估產(chǎn)品的特異性，還應(yīng)納入一定例數(shù)的消化道腫瘤患者樣本（如胃癌、食管癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌等），非消化道腫瘤患者樣本以及臨床常見的消化道良性疾?。ㄈ缃Y(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸息肉、結(jié)直腸炎癥、痔瘡等），應(yīng)考慮不同癌種對試劑盒檢測性能的干擾。樣本例數(shù)的估算應(yīng)參考體外診斷試劑臨床試驗指導(dǎo)的要求，建議通過單組目標(biāo)值法進(jìn)行估算。該類產(chǎn)品作為一類比較新的產(chǎn)品，臨床意義還需通過臨床試驗進(jìn)行驗證，因此，臨床試驗分為兩部分，一部分驗證產(chǎn)品的臨床意義，即判斷產(chǎn)品檢測結(jié)果與疾病狀態(tài)的關(guān)系；一部分驗證試劑盒檢測生物標(biāo)志物的準(zhǔn)確性。對于第一部分，推薦使用臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)，即結(jié)直腸鏡和病理診斷方法作為對比方法；對于第二部分，則推薦使用已上市產(chǎn)品或者實驗室參考方法如sanger測序等對不同的基因位點進(jìn)行同源樣本的準(zhǔn)確性驗證，對于已有同類產(chǎn)品上市的，也可直接與同類產(chǎn)品進(jìn)行比較。對于新驗證的基因甲基化位點，建議補充考核試劑對結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后的樣本進(jìn)行連續(xù)檢測的結(jié)果，以驗證該基因位點與疾病狀態(tài)的直接關(guān)系。如已經(jīng)獲批的人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒（熒光PCR法）即對40例結(jié)直腸癌切除根治術(shù)前、后的受試者進(jìn)行了短期隨訪。使用考核試劑對符合短期隨訪要求的受試者糞便樣本進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示39例檢測陽性全為術(shù)前與病理結(jié)果相符，術(shù)后陰性與結(jié)直腸癌手術(shù)后的結(jié)果相符。

3.小結(jié)

盡管基因甲基化檢測具有無創(chuàng)檢測的優(yōu)點，但由于通過無創(chuàng)方法獲取體液和糞便中脫落細(xì)胞的DNA樣本量往往含量比較低，分離純化存在一定的難度，且正常細(xì)胞來源的DNA還會對檢測結(jié)果造成干擾，因此該方法檢測的靈敏度可能不太高，同時相關(guān)基因甲基化在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的機制尚未十分明確，需要補充短期或長期隨訪數(shù)據(jù)及其他臨床證據(jù)以驗證該基因甲基化與結(jié)直腸癌的關(guān)系。因此該類產(chǎn)品有其限定的預(yù)期用途，并不適用于愿意并能夠接受結(jié)直腸癌相關(guān)診療指南推薦的常規(guī)篩查試驗如結(jié)直腸鏡檢測或組織病理活檢的患者。如美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的Epi proColon?，該產(chǎn)品用于檢測來自患者全血標(biāo)本的乙二胺四乙酸血漿中甲基化Septin 9 DNA，明確該產(chǎn)品也不適用于有結(jié)直腸息肉、結(jié)直腸癌或相關(guān)癌癥、炎癥性腸病、慢性潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、家族性腺瘤性息肉病病史的結(jié)直腸癌高風(fēng)險患者。高危人群還包括有結(jié)直腸癌家族史的人，特別是有兩個或兩個以上的一級親屬患有結(jié)直腸癌，或一個或多個未滿50歲的一級親屬患有結(jié)直腸癌等。因此，在開發(fā)這類產(chǎn)品時，相關(guān)企業(yè)應(yīng)明確產(chǎn)品的臨床定位，從而根據(jù)產(chǎn)品的臨床定位針對性地開展臨床試驗。