楊素華，金臨軒，牛晨雨，劉玲玲，陳豪斌，朱一星，班兆軍

（浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江省農業(yè)生物資源生化制造協同創(chuàng)新中心，浙江杭州 310023）

目前使用的包裝塑料主要來自化石原料，大部分普通塑料不能被生物降解，對地球生態(tài)系統(tǒng)造成破壞性的影響，因此迫切需要可替代的環(huán)境友好型和可生物降解的天然聚合物材料[1]。近年來，蛋白質因其安全、高效和易生物降解而引發(fā)極大的關注[2]。

在食品包裝領域，溶菌酶（lysozyme，LYZ）因其安全、無毒副作用等特點而備受關注。溶菌酶是一種胞壁質酶，可水解細菌細胞壁中的β-1,4 糖苷鍵，從而破壞細胞膜的完整性，使細胞死亡而表現出一定的抑菌活性[3-4]。Zhang 等[5]設計的溶菌酶復合包裝膜運用于巴氏殺菌牛奶包裝，能對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌起到有效的抗菌活性。魯奇林等[6]制備了溶菌酶復合涂膜對鮮棗進行保鮮儲存，結果顯示復合涂膜可延緩果實的衰老和營養(yǎng)物質流失，能有效延長鮮棗的貨架期。

溶菌酶的來源廣泛，從苦瓜、蘿卜、家禽蛋清、哺乳動物淚液、唾液以及細菌和真菌細胞壁中均可分離得到。雞蛋清中的溶菌酶含量是自然界中最豐富的[7]，蛋清溶菌酶的化學性質穩(wěn)定，在酸性和高溫條件下，仍然保持較高活性，這與其結構中的氫鍵、二硫鍵和疏水鍵有關。疏水相互作用在溶菌酶的折疊構象中起到相當重要的作用[8]。因此，蛋清溶菌酶被認為是一種硬蛋白，不能被還原為天然結構和未折疊的狀態(tài)，可用作淀粉樣纖維的形成和結構的理想模型。當外部環(huán)境改變時，蛋白質的空間構型會因此改變，由可溶的天然態(tài)轉變?yōu)椴蝗艿睦w維態(tài)，該過程被稱為蛋白質的淀粉樣纖維化。因此通過改變pH、溫度、離子濃度等外部誘導條件，溶菌酶可自我組裝形成低聚物、聚集體或淀粉樣纖維[9-12]。淀粉樣纖維的結構非常穩(wěn)定，難以分解，同時具有潛在的材料特性，如高硬度、極長徑比和集體有序特征[13-14]，因此在近年來，淀粉樣原纖維在納米材料領域顯示出良好的前景。Zhou 等[15]利用溶菌酶淀粉樣纖維作為固定化酶載體形成催化微凝膠，不僅保持了封裝酶的完整性，同時顯示出堅固的材料特性。France 等[16]制備的溶菌酶淀粉樣纖維復合薄膜表現出優(yōu)異的拉伸強度和韌性。

在本研究中，以溶菌酶為研究對象，通過在低pH 和高溫條件下進行淀粉樣纖維化蛋白自組裝，同時加入增塑劑甘油以降低薄膜脆性，最終通過流延法制得均勻光滑的抗菌纖維薄膜。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

溶菌酶（蛋清，2 萬U/mg）、甘油、胰蛋白胨、香蘭素 上海源葉生物科技有限公司；冰醋酸 分析純，上海泰坦化學有限公司；平板計數瓊脂 生物級，北京索萊寶科技有限公司；酵母提取物（生物級）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈉 分析純，天津市永大化學試劑有限公司；枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、大腸桿菌（E. coli）均保存于生物與化學工程學院C2-413。

HCJ-4G 磁力攪拌水浴鍋 常州朗越儀器制造有限公司；Zetasizer Nano 納米粒度儀 英國Malvern 公司；Multimode SPM 原子力顯微鏡 美國Veeco 公司；Chirascan 圓二色譜儀 英國Apllied Photophysics 公司； F-4500 熒光分光光度計 日本Hitachi 公司；TA-XT2i 質構儀 北京超技儀器技術有限公司；生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶菌酶淀粉樣纖維溶液制備 稱取5 g 溶菌酶溶于50 mL 醋酸溶液（40% v/v），調節(jié)溶液pH 至2.0。將配制好的溶液置于磁力攪拌水浴鍋90 ℃加熱5 h 得到溶菌酶淀粉樣纖維（A-LYZ）溶液，靜置備用。以天然溶菌酶（O-LYZ）溶液作為對照，溶解于去離子水中并攪拌2 h[2]。

1.2.2 溶菌酶薄膜制備 稱取1.5 g 甘油分別溶于A-LYZ 溶液和O-LYZ 溶液中，攪拌均勻后采用流延法制備薄膜，取10 mL 樣品溶液于聚四氟乙烯平皿，室溫干燥，揭膜，得到A-LYZ 薄膜和O-LYZ 薄膜，置于RH=40%干燥器保存待用。

1.2.3 粒度測定 采用馬爾文粒度分析儀測定溶菌酶的平均粒徑和粒度分布。將A-LYZ 溶液用醋酸溶液（pH2.0）稀釋至0.5 mg/mL。O-LYZ 溶液用0.01 mol/L 的PBS 緩沖溶液（pH7.0，由磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉配制）進行稀釋[17]。

1.2.4 淀粉樣纖維微觀形態(tài) 溶菌酶經過纖維化前后的顆粒形貌通過原子力顯微鏡（AFM）觀察得到。A-LYZ 溶液用醋酸溶液（pH2.0）稀釋至25 μg/mL，O-LYZ 溶液用去離子水稀釋。取20 μL 稀釋后的溶液滴加在新鮮剝離的云母片表面，等待自然風干[18]。在輕敲模式下進行測量，AFM 觀測到的圖像用NanoScope Analysis 1.9 軟件進行圖像處理和分析。

1.2.5 二級結構測定 用去離子水將樣品溶液稀釋至0.2 mg/mL，并用透析袋去除醋酸減少對檢測的干擾。使用圓二色譜儀在190～260 nm 之間進行掃描，掃描速度20 nm/min，帶寬 1 nm[19]。二級結構含量的分析和計算根據在線網站http:// dichroweb.cryst.bbk.ac.uk 獲得。

1.2.6 熒光猝滅 溶菌酶與香蘭素之間的相互作用通過蛋白質內源熒光光譜分析。O-LYZ 溶液和ALYZ 溶液分別用0.01 mol/L 的PBS 緩沖溶液稀釋至0.5 mg/L，香蘭素溶解于熱水中使其濃度達到2.5 mmol/L。在每根試管中分別加入5 mL 的樣品溶液，同時加入一定量的香蘭素溶液，使香蘭素最終濃度分別為0～50 μmol/L?；旌暇鶆蚝笥萌樟-4500熒光分光光度計測定，參數設定激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長300～450 nm，狹縫寬度5 nm，光電倍增管的電壓設置為700 V[17]。

1.2.7 薄膜性能測定

1.2.7.1 機械性能 薄膜機械性能主要測定抗拉強度（TS）和斷裂伸長率（E）。將薄膜裁剪成20 mm×60 mm 的規(guī)格，用夾具固定進行測量，初始夾距30 mm，拉伸速度50 mm/min[20]。

式中，TS-抗拉強度（MPa），F-最大拉力（N），a-試樣的寬度（mm），b-試樣的厚度（mm）。

式中，E-斷裂伸長率（%），L0-試樣的原始標線間的距離（mm），L-試樣斷裂時距離標線間的距離（mm）。

1.2.7.2 水蒸氣透過率（WVP） 采用修正的ASTM法進行WVP 的測定[21]。干燥器內放入BaCl2飽和溶液使其濕度保持在90%。選擇敞口玻璃容器作為透濕杯放入烘干至恒重的CaCl2并將裁剪的薄膜覆蓋在玻璃容器表面，用礦脂密封后置于干燥器中，每隔一段時間稱量玻璃容器的重量，并按下式計算薄膜的WVP。

式中，WVP-透濕系數（g·mm/m2·d·kPa）， Δmt 時間內質量增量（g），X-膜的厚度（mm），A-透濕杯的有效測定面積（m2），t-時間間隔，h；ΔP-試樣兩側水蒸氣壓差（kPa）。

1.2.7.3 水溶性 （WS） 將薄膜裁剪成20 mm×20 mm的規(guī)格，在105 ℃下干燥至恒重m1。加入50 mL去離子水在室溫下溶解24 h，將水倒掉后干燥至恒重為m2，根據質量變化計算薄膜的WS[20]。

式中，WS-水溶性（%），m1-第一次干燥至恒重時薄膜的質量（g），m2-第二次干燥至恒重時薄膜的質量（g）。

1.2.8 抑菌性測定 采用培養(yǎng)基擴散法-抑菌圈法[22]測定樣品薄膜對E. coli 和B. subtilis的抑菌效果。取100 μL 菌懸液（由胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉配制）接種到熔融的平板計數瓊脂中，使細菌濃度達到1×104CFU/mL。將樣品薄膜切割成20 mm×20 mm大小的薄膜并用紫外線燈消毒20 min 進行試驗，將薄膜放置在培養(yǎng)基平板的中心，37 ℃培養(yǎng)24 h 后測定抑菌圈大小（除去薄膜所占面積）。

1.3 數據處理

所有樣品重復測定三次，利用SPSS 軟件對實驗數據進行方差分析和顯著性分析（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 溶菌酶淀粉樣纖維溶液和薄膜的外觀

如圖1 所示，O-LYZ 溶液外觀基本澄清，內部混有少許不溶性蛋白（圖1A）。由此制備的薄膜透明度高，但表面粗糙，具有一定的粘性和蛋白析出的現象（圖1C）?？赡艿脑蚴荗-LYZ 溶解度較低且與甘油相互結合作用較弱，使得在薄膜干燥過程中附著在表面。而經過淀粉樣纖維化處理后得到的A-LYZ溶液顏色明顯加深、黏度增大，在室溫條件下可凝固成凝膠狀（圖1B）。由此得到的薄膜表面光滑平整（圖1D）。

圖1 淀粉樣纖維化處理前后溶菌酶溶液和薄膜的外觀Fig.1 Lysozyme solution and appearance of films before and after amyloid fibrosis

2.2 溶菌酶淀粉樣纖維溶液的粒度測定

O-LYZ 和A-LYZ 溶液的粒度分布和平均粒徑如圖2 所示。兩個對比樣品均呈現單峰形態(tài)，說明粒徑的分布較為集中。O-LYZ 粒徑主要分布在40～250 nm，峰值為106 nm，而A-LYZ 的粒度分布明顯變寬（530～950 nm），峰值為752 nm（圖2 A）。另外，圖2 B 顯示了淀粉樣纖維化處理前后溶菌酶的平均粒徑（Dz）?？梢悦黠@看到經過酸熱誘導處理之后溶菌酶的Dz 顯著增大，從174 nm 增大786 nm，這與Bolisetty 等[23]的發(fā)現一致。該研究指出溶菌酶在酸熱處理后發(fā)生水解，使得蛋白質單體在疏水作用和靜電斥力作用下轉化成更大的纖維聚集體。

圖2 淀粉樣纖維化處理前后溶菌酶溶液的粒度分布（A）和平均粒徑（B）Fig.2 Volume distribution (A) and Dz (B) of lysozyme before and after amyloid fibrosis

2.3 溶菌酶淀粉樣纖維的微觀形態(tài)

如圖3 所示，在AFM 的輕敲模式下觀察到除顆粒大小外，蛋白質顆粒的形態(tài)隨酸熱處理有較大變化。在天然狀態(tài)下觀察到粒徑約為20～240 nm 的球形低聚物（圖3A），分散良好，高度約為0.8～5.4 nm（圖3B），與DLS 結果一致。在加熱5 h 后，呈現典型的蛋白質纖維聚集體，長而細，無分支，但部分彎曲，呈蠕蟲樣的卷曲狀，長度約為450～920 nm（圖3C），高度0.7～3.6 nm（圖3D）。Mishra 等[24]發(fā)現蛋清溶菌酶在低pH 和65 ℃下加熱后發(fā)生水解最終形成成熟的淀粉樣纖維。在Xiang 等[25]的研究中也發(fā)現了大豆分離蛋白進行纖維化處理后，出現了以扭曲的形式存在的蠕蟲樣原纖維，這與本文得到的結果一致。

圖3 淀粉樣纖維化處理前后溶菌酶溶液的原子力顯微鏡成像圖Fig.3 Tapping mode AFM images of lysozyme before and after amyloid fibrosis treatment

2.4 溶菌酶淀粉樣纖維的二級結構

蛋白質淀粉樣纖維化過程通常伴隨著分子構象的變化，尤其是高度有序的β-折疊二級結構的形成[26]。如圖4 所示，O-LYZ 在206 nm 處具有明顯的負平均殘基橢圓率，表明其在天然狀態(tài)下的二級結構以α-螺旋為主。經過酸熱處理后，A-LYZ 的波長從206 nm 移到205 nm，同時最大負平均殘基橢圓率增加，表明形成了更多的β-折疊結構。另外，利用BeStSel 軟件計算得到二級結構相對含量如表1 所示，在纖維化處理過程中，α-螺旋和無規(guī)卷曲含量減少，β-折疊和β-轉角逐漸增加。其中，α-螺旋含量由24.00%減少到21.70%，β-折疊含量由28.50%顯著提高到35.60%（P<0.05），表明有淀粉樣纖維的形成。

表1 淀粉樣纖維化處理前后溶菌酶溶液的二級結構相對含量Table 1 Relative contents of secondary structures of lysozyme before and after amyloid fibrosis

圖4 淀粉樣纖維化處理前后溶菌酶溶液的遠紫外光譜圖Fig.4 Far-UV CD spectra of lysozyme before and after amyloid fibrosis

2.5 溶菌酶淀粉樣纖維與香蘭素相互作用

疏水氨基酸殘基（Trp，Tyr 和Phe）是蛋白質的主要熒光基團，使其具有內源性熒光。通常認為，當蛋白質的色氨酸（Trp）發(fā)色團處于極性微環(huán)境中時，熒光發(fā)射最大值（λm）會發(fā)生轉移或當發(fā)色團與溶劑中的猝滅劑相互作用時，熒光的量子產率會降低[27]。因此，可以通過蛋白質內源性熒光猝滅來研究蛋白質與疏水生物活性物質之間的相互作用[28]。

如圖5A 所示，O-LYZ 的內源熒光光譜在338 nm處達到最大熒光強度，說明Trp 所處的微環(huán)境具有較高的疏水性。經過酸熱誘導處理后發(fā)生了明顯的紅移（從338 nm 到343 nm），并且熒光強度下降，表明酸熱處理后蛋白質結構發(fā)生變化，疏水基團轉移到更極性的環(huán)境中，進一步證實了淀粉樣纖維的形成。為了進一步驗證A-LYZ 與香蘭素絡合作用的產生，圖5B 顯示了香蘭素濃度（0～50 μmol/L）增加對蛋白本征熒光發(fā)射光譜的影響?？梢杂^察到，隨著香蘭素濃度的增加，A-LYZ 的最大熒光強度逐漸降低并且λm 發(fā)生紅移（343～347 nm），表明溶菌酶的固有熒光被香蘭素絡合猝滅。在Chen 等[29]的研究中，發(fā)現了大豆蛋白和姜黃素之間的熒光猝滅現象?？讗蹣s[30]也在研究中發(fā)現，香蘭素對溶菌酶內源熒光的影響，隨著不同濃度的香蘭素的加入，溶菌酶特征峰的熒光強度逐漸降低，推測兩者結合形成了復合物。

圖5 溶菌酶溶液的內源熒光光譜Fig.5 Endogenous fluorescence spectrum of lysozyme

2.6 薄膜性能分析

2.6.1 機械性能分析 抗拉強度用于反映薄膜的變形抗力，拉伸延長率用于描述薄膜的韌性。如表2所示，纖維化處理對溶菌酶薄膜的抗拉強度影響較為顯著（P<0.05），A-LYZ 的抗拉強度為2.96±0.25 MPa，比O-LYZ 提高了一倍，但薄膜的拉伸延長率在處理前后沒有太大的差異。主要的原因是在加熱和酸處理過程中，蛋白質內部結構展開，巰基和疏水性基團暴露在分子表面。在隨后的膜干燥階段，新的疏水基團相互作用并形成新的氫鍵，從而形成堅固致密的網狀結構，得到具有一定機械強度的薄膜[31]。

表2 淀粉樣纖維化處理前后溶菌酶薄膜的機械性能、水蒸氣透過率和水溶性Table 2 Mechanical properties, water vapor permeability and water stability of lysozyme films before and after amyloid fibrosis

2.6.2 阻隔性能 由于蛋白質固有的親水性質，通常會表現出較差的水蒸氣滲透性。本文對薄膜的WVP進行了連續(xù)7 d 的測試，結果如表2 所示。與O-LYZ薄膜相比，A-LYZ 薄膜的WVP 有明顯的下降，從71.27±1.70 g·mm/m2·d·kPa 降為43.11±3.28 g·mm/m2·d·kPa，說明淀粉樣纖維化后薄膜擁有更強的阻水性能。同樣的，Peydayesh 等[2]將乳清蛋白進行淀粉樣纖維化處理制備得到的薄膜也表現出比原始薄膜更低的WVP。

WS 在一定程度上反映了薄膜在水中的溶解度，如表2 所示，A-LYZ 薄膜的WS（12.79%）明顯低于O-LYZ 薄膜的值（36.69%）。在被浸泡24 h 后，OLYZ 薄膜的溶脹顯著，水分子不斷滲透進蛋白膜內部，而淀粉樣纖維化的過程改變了蛋白質的內部結構，親水基團不斷減少，同時疏水基團從分子內部大量暴露。因此變性后的蛋白質在疏水作用和靜電斥力下不斷靠近，發(fā)生了蛋白質的熱聚集[32]，由此能有效地隔絕水分。并且Peydayesh 等[2]在研究中證明了薄膜在水中釋放的主要成分是增塑劑，干燥后的薄膜比浸水前的薄膜表現的更脆。

2.7 抑菌性

表3 顯示了樣品薄膜對大腸桿菌（E. coli）和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）的抗菌活性測試結果。結果表明，O-LYZ 表現出良好的抑菌效果，抑制區(qū)域明顯，但薄膜存在膨脹和融化的現象，這與天然蛋白質的親水性有關。相比之下，A-LYZ 薄膜的完整性較好，但抑菌效果較天然狀態(tài)下會變差，主要的原因是在酸熱誘導處理下，酶活性降低使溶菌酶的抑菌效果變差[8]。在周欽育等[33]的研究中也發(fā)現，溶菌酶在過酸和過高的溫度下會使其酶活性下降，抑菌效果減弱，同時溫度越高，溶菌酶變性失活程度越高，失活速度越快。但是在孔愛榮[30]的研究中發(fā)現香蘭素與溶菌酶可結合生成復合物，并且香蘭素的加入可提高溶菌酶的酶活力，因此在含有香蘭素的A-LYZ 薄膜表現出優(yōu)異的抑菌效果，并且香蘭素在較低pH 下抑菌效果也會增強[34]。

表3 淀粉樣纖維化處理前后溶菌酶薄膜對試驗微生物的抑菌活性測定Table 3 Bacteriostatic activity against test microorganisms of lysozyme films before and after amyloid fibrosis

3 結論

在本研究中，通過對溶菌酶進行淀粉樣纖維化處理，以此作為開發(fā)高性能蛋白質的策略。AFM、CD 和熒光猝滅實驗分析表明在酸熱誘導處理下有淀粉樣纖維的形成，并且由淀粉樣纖維得到的薄膜外觀均勻平整，沒有裂紋和氣泡。重要的是，纖維化處理改善了機械性能和阻隔性能。A-LYZ 薄膜表現出優(yōu)異的WVP 和WS，同時TS 也有一定提高。溶菌酶在經過處理后對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌仍能保持一定的抑菌效果，香蘭素的加入提高了薄膜的協同抗菌性能。