王世云,馮金華,黃思玉,徐秋彤

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué),河北,秦皇島 066003)

蝦青素是一種天然的類(lèi)胡蘿卜素。蝦青素具有強(qiáng)烈的抗氧化性,能被氧化劑氧化為蝦青素醌和其它衍生物,在市場(chǎng)上的應(yīng)用范圍廣闊。蝦青素在水產(chǎn)養(yǎng)殖、藥用、食用等方面主要應(yīng)用蝦青素的抗氧化和增強(qiáng)免疫力的能力。另外,在日本也已推出含有蝦青素成分的眼保護(hù)劑[1]。由Mara公司研發(fā)的紅球藻蝦青素產(chǎn)品(AstaFactor),比其他26種著名的抗炎產(chǎn)品具有更顯著的抗炎抗感染作用[2]。蝦青素已被研究用于包括對(duì)眼睛、心臟和大腦健康的臨床應(yīng)用[3]。

蝦青素來(lái)源有兩大類(lèi):化學(xué)合成和天然蝦青素。合成蝦青素具有與天然蝦青素相同的分子結(jié)構(gòu),為含有不同立體異構(gòu)體的混合物[4]。動(dòng)物體對(duì)化學(xué)合成的蝦青素吸收能力較弱,與天然蝦青素相比其著色能力和生物效價(jià)低得多,美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)已經(jīng)禁止化學(xué)合成的蝦青素進(jìn)入食品和膳食補(bǔ)充劑市場(chǎng)[5],這種來(lái)源蝦青素隨著天然來(lái)源蝦青素產(chǎn)業(yè)的興起終將被淘汰。天然蝦青素來(lái)源廣泛,可從紅發(fā)夫酵母、粘紅酵母、雨生紅球藻、銅綠小球藻以及蝦、蟹殼等多種生物中提取。雨生紅球藻中蝦青素含量可高達(dá)細(xì)胞干重的4%,被公認(rèn)為生產(chǎn)天然蝦青素的最佳來(lái)源。目前有多種雨生紅球藻蝦青素提取物在售賣(mài),有效成分蝦青素含量在1%～10%左右。

雙水相體系萃取蝦殼中蝦青素已有報(bào)道[6]。乙醇-硫酸銨雙水相能夠使蝦殼蝦青素乙醇提取液中80%以上蝦青素包括游離蝦青素及蝦青素酯形成沉淀,而集中于雙水相的上下兩相之間。該法具有分相快速、處理量大、環(huán)境友好、不用加熱等優(yōu)點(diǎn),有利于蝦青素的濃縮和蝦青素固體的制備,在工業(yè)生產(chǎn)蝦青素中具有一定的應(yīng)用潛力。但是將乙醇-硫酸銨雙水相系統(tǒng)用于從雨生紅球藻蝦青素提取物中純化蝦青素還未有報(bào)道。本試驗(yàn)采用乙醇-硫酸銨雙水相體系從含蝦青素5%的雨生紅球藻蝦青素粉中提取蝦青素,可以為雙水相體系在蝦青素制備中的更廣泛應(yīng)用提供一些試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料 5%雨生紅球藻蝦青素粉,購(gòu)買(mǎi)于濟(jì)南魯源生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器 721型可見(jiàn)分光光度計(jì),上海舜宇恒平科技有限公司生產(chǎn);FA2104N型精密分析電子天平,上海菁海儀器有限公司生產(chǎn);IC-20A型島津高效液相色譜儀,Shimadzu島津公司生產(chǎn);DKE-3雙功能水浴恒溫振蕩器,金壇市杰瑞爾電器有限公司生產(chǎn);80-2離心機(jī),江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司生產(chǎn);UV-1800PC全波長(zhǎng)掃描型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),濟(jì)南歐威騰生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要試劑及耗材 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(S13036-250 mg,≥98.0%),由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn);硅膠板(規(guī)格50×100 mm;厚度0.20～0.25 mm),由青島海洋化工有限公司生產(chǎn);無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、正己烷,丙酮,分析純,由天津市鑫鉑特化工有限公司生產(chǎn);硫酸銨,分析純,由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);甲醇,色譜純,由天津歐博凱化工有限公司生產(chǎn);四氫呋喃,色譜純,由天津賽孚瑞科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雨生紅球藻蝦青素粉中蝦青素的提取 制備兩種濃度的蝦青素提取液。分別取0.4 g和0.5 g雨生紅球藻蝦青素粉加入10 mL無(wú)水乙醇,室溫避光提取30 min,然后4 000 r/min離心10 min,取上清液,沉淀重復(fù)此操作3次,分別合并4次上清液,作為濃度為C1和C2的雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液。

1.2.2 雙水相萃取蝦青素

采用雙水相萃取蝦殼中蝦青素探索的乙醇-硫酸銨雙水相體系[6]。共包括8個(gè)體系,分別為:

無(wú)水乙醇∶20% (NH4)2SO4(v/v)=1∶1、1∶1.25、1∶1.5;無(wú)水乙醇∶30%(NH4)2SO4(v/v)=1∶1.5、1∶1.75、1∶2、1∶2.25、1∶2.5,其中(NH4)2SO4溶液為質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)。

在進(jìn)行蝦青素萃取試驗(yàn)時(shí),將上述成相體系中的無(wú)水乙醇換成1.2.1中制備的雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液。取3 mL蝦青素提取液,按比例加入相應(yīng)體積的20%或30%硫酸銨溶液,混勻,避光靜置1 h,至體系分相完全。

分別記錄各分相體系上下相體積。將上相取出后,避光-15 ℃保存,待檢測(cè)。中間相用移液槍抽取出來(lái)后,加水,8 000 r/min離心10 min,取沉淀,乙酸乙酯溶解,避光-15 ℃保存,待檢測(cè)。

1.2.3 蝦青素的高效液相色譜檢測(cè)

高效液相色譜檢測(cè)條件為:C18(250 mm×4.6 mm)色譜柱,室溫,進(jìn)樣量10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為476 nm,采用甲醇(B)和四氫呋喃(A)梯度洗脫,流速0.8 mL/min。

在檢測(cè)雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液中是否含有蝦青素酯時(shí),采用馮金華等[6]的梯度洗脫條件。

在確定原料中不含蝦青素酯后,后續(xù)檢測(cè)的洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相洗脫條件

在檢測(cè)上相蝦青素含量時(shí),為去除硫酸銨對(duì)樣品檢測(cè)的影響,取100 μL各樣品溶液加2 mL水,然后再加入1 mL乙酸乙酯,將蝦青素及其他色素萃取入乙酸乙酯相,取乙酸乙酯相進(jìn)行高效液相測(cè)定。

1.2.4 蝦青素的薄層色譜測(cè)定 薄層板為50×100 mm的硅膠板,展開(kāi)劑:25%丙酮和75%正已烷。

1.2.5 蝦青素的紫外可見(jiàn)光譜檢測(cè) 檢測(cè)樣品在300～800 nm的吸收光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 雨生紅球藻蝦青素粉中蝦青素的鑒定

2.1.1 紫外-可見(jiàn)光譜 如圖1所示,蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品乙酸乙酯溶液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜只有一個(gè)吸收峰,在476 nm。雨生紅球藻蝦青素粉提取液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜有兩個(gè)主要吸收峰,分別在490 nm和440 nm附近,與蝦青素的最大吸收峰在476 nm相比相差很大,說(shuō)明在雨生紅球藻蝦青素粉中含有比較多的不同于蝦青素的雜色素。

1:蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品

2.1.2 高效液相色譜

以蝦青素的最大吸收波長(zhǎng)476 nm為檢測(cè)波長(zhǎng),進(jìn)行雨生紅球藻蝦青素粉乙酸乙酯提取液的HPLC檢測(cè)。如圖2所示,游離蝦青素的吸收峰在5.3 min左右。

圖2 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖

雨生紅球藻中蝦青素含有70%的單酯和25%的雙酯形式的蝦青素,只有不到5%的游離蝦青素[7]。在前期檢測(cè)蝦殼中蝦青素時(shí)[6],游離蝦青素出峰時(shí)間5.3 min左右,蝦青素單酯和蝦青素雙酯出現(xiàn)在14.0～45.0 min之間。當(dāng)采用相同的檢測(cè)方式檢測(cè)雨生紅球藻蝦青素提取液中蝦青素的類(lèi)型時(shí),如圖3所示,所有吸收峰都出現(xiàn)在10 min之前,在14.0～45.0 min之間沒(méi)有出現(xiàn)吸收峰,所以雨生紅球藻蝦青素粉中基本不含蝦青素單酯和蝦青素雙酯,5.3 min左右出現(xiàn)了游離蝦青素的吸收峰,但除此之外,在2～5 min之間出現(xiàn)了多個(gè)雜色素的吸收峰,在6.5～7.0 min之間出現(xiàn)了小的雜色素吸收峰。圖3告訴我們,雨生紅球藻蝦青素粉中含有游離蝦青素,不含有蝦青素酯,游離蝦青素的含量不是很高,含有多種雜色素,雜色素的含量比較高。

2.1.3 薄層色譜 由圖4可知,雨生紅球藻蝦青素粉中蝦青素主要為游離蝦青素,除此之外,在游離蝦青素下方出現(xiàn)比較長(zhǎng)的紫紅色的雜色素帶。也說(shuō)明雨生紅球藻蝦青素粉中只含有游離蝦青素,不含有蝦青素酯,含有比較多的紫紅色的雜色素。

2.2 雨生紅球藻蝦青素粉中蝦青素的雙水相分離

2.2.1 雙水相的分相情況

經(jīng)試驗(yàn),雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液∶20% (NH4)2SO4(v/v)=1∶1、1∶1.25、1∶1.5及雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液∶30%(NH4)2SO4(v/v)=1∶1.5、1∶1.75、1∶2、1∶2.25、1∶2.5組成的8個(gè)體系都能快速分相。而且,分相完全后,8個(gè)體系的上相都為紫紅色,下相無(wú)色澄清,上下相交界面上有固體顆粒存在。

同文獻(xiàn)[6]所述相同,8個(gè)體系都有沉淀聚集在上下相之間,但上相是非常明顯的紫紅色,說(shuō)明8個(gè)體系都不能將提取液中所有色素都沉淀下來(lái),只有少量色素沉淀。為確定中間沉淀出來(lái)的色素是蝦青素,還是蝦青素與雜色素的混合物,還是雜色素,需要進(jìn)一步檢測(cè)。在進(jìn)一步的檢測(cè)時(shí),因?yàn)樯刂饕嬖谟谏舷嗪椭虚g相,因此主要就這兩相進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.2 高效液相色譜蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 如圖5所示,游離蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為:y=36 308x-5 794.6,R2=0.999 4。

2.2.3 蝦青素沉淀率

制備的兩個(gè)濃度的雨生紅球藻蝦青素提取液中蝦青素濃度分別為:C1=14.09 μg/mL;C2=18.24 μg/mL。

雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液與20%硫酸銨形成的分相體系主要有3個(gè)。如表2所示,隨著硫酸銨體積的增加,上相體積逐漸增加。在兩個(gè)檢測(cè)濃度下,3個(gè)雙水相體系上相中的蝦青素與萃取前相比,都減少,說(shuō)明提取液中的蝦青素在中間相有一定的沉淀。從沉淀率看,隨著20%硫酸銨體積的增加,蝦青素在中間相的沉淀率逐漸增大。2個(gè)濃度的蝦青素提取液,表現(xiàn)出相同的趨勢(shì),都是蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5時(shí)沉淀率最高,都大于70%。

表2 20%硫酸銨和蝦青素提取液的雙水相體系對(duì)蝦青素的沉淀效果

雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液與30%硫酸銨形成的分相體系主要有5個(gè)。如表3所示,5個(gè)體系在兩個(gè)檢測(cè)濃度下,上相中殘留的蝦青素與萃取前相比,總量都減少,說(shuō)明提取液中的蝦青素在中間相都有一定的沉淀。如表3所示,隨著硫酸銨體積的增加,上相體積逐漸減少,蝦青素在中間相的沉淀率基本呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)。兩個(gè)個(gè)濃度的蝦青素提取液,表現(xiàn)出相同的趨勢(shì),且都是蝦青素粉乙醇提取液∶30%硫酸銨(v/v)=1∶2.5時(shí),蝦青素在中間相的沉淀率最高,沉淀率大于70%。

表3 30%硫酸銨和蝦青素提取液的雙水相體系對(duì)蝦青素的沉淀效果

蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5和蝦青素粉乙醇提取液∶30%硫酸銨(v/v)=1∶2.5兩個(gè)雙水相體系相比,蝦青素在中間相的沉淀率比較接近,都大于70%。本著降低成本的角度,采用蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5體系從雨生紅球藻蝦青素粉中沉淀蝦青素更有利。

2.2.4 雙水相沉淀蝦青素樣品的純度檢測(cè) 對(duì)采用蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5體系制備的中間相沉淀進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.4.1 高效液相色譜檢測(cè)

如圖2所示,游離蝦青素在5.0～5.5 min之間出峰。如圖6所示,雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液中除游離蝦青素外,在5.0 min之前出現(xiàn)多種雜色素吸收峰,為提取液中主要雜色素,6.5～7.0 min之間也出現(xiàn)少量色素。

圖6 雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液

如圖7所示,雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5體系中間相主要含兩種成分,出現(xiàn)在5.0～5.5 min之間的游離蝦青素為主要成分,另一種為6.5～7.0 min的物質(zhì)。原提取液中在5.0 min之前出現(xiàn)的雜色素在中間相中基本沒(méi)有。說(shuō)明中間相中沉淀出的主要為蝦青素。

圖7 雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5體系中間相

如圖8所示,雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5體系的上相,主要為出峰時(shí)間為5.0 min之前的雜色素,游離蝦青素的含量很少。

由以上可知,采用雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5體系可以使蝦青素很好地在中間相沉淀,不僅沉淀率可達(dá)70%以上,而且純度相對(duì)較高,可把提取液中的主要雜色素留在上相。

2.2.4.2 薄層色譜檢測(cè)如圖9所示,1∶1.5(20%硫酸銨)雙水相萃取體系中間相(2)中色素基本都為游離蝦青素,基本沒(méi)發(fā)現(xiàn)雜色素帶;而上相(4)主要為雜色素帶,基本沒(méi)有游離蝦青素的色帶。

注:1:標(biāo)準(zhǔn)品;2:中間相;3:雨生紅球藻蝦青素粉提取液;4:上相

2.2.4.3 紫外-可見(jiàn)光譜檢測(cè)

如圖10所示,雨生紅球藻蝦青素粉的提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5雙水相萃取體系中間相與蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的吸收光譜很相似,只有一個(gè)大的吸收峰,在473 nm,蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的吸收峰在476 nm,二者很相近,說(shuō)明中間相蝦青素純度比較高。上相的吸收峰主要有兩個(gè),在431 nm和531 nm,與蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的吸收峰相差比較大,基本可以看成是雜色素的吸收峰。

圖10 紫外-可見(jiàn)吸收光譜

從高效液相色譜、薄層色譜、紫外-可見(jiàn)光譜分析都可以看出:雨生紅球藻蝦青素粉的提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5體系中間相沉淀為純度比較高的蝦青素,雜色素則被分配于上相。

3 討論

隨著天然蝦青素越來(lái)越受到大眾的歡迎,天然蝦青素的提取純化工藝成為研究的熱點(diǎn)。天然蝦青素的分離純化方法有很多,如:超臨界流體萃取、柱色譜法等[8-9],但存在著成本高或操作復(fù)雜等問(wèn)題。

雙水相萃取法具有分相速度快、低溫、耗能小、適合大規(guī)模操作等優(yōu)點(diǎn)。但雙水相用于色素分離,主要是利用色素在雙水相上下兩相的分配不同,從而將色素萃取到上相或下相來(lái)進(jìn)行分離的[10-11]。在前期研究中發(fā)現(xiàn),采用乙醇/硫酸銨雙水相體系萃取蝦殼中蝦青素,可使蝦青素以固相的形式沉淀在兩相之間,采用蝦青素乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.25的體系可以使88.0%以上的蝦殼蝦青素沉淀下來(lái)[6]。

本研究原料是5%雨生紅球藻蝦青素粉,是皂化后的蝦青素粉。研究發(fā)現(xiàn),乙醇-硫酸銨雙水相體系可以使蝦青素粉提取液中的游離蝦青素沉淀下來(lái)。采用雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5的體系可以使70%以上的游離蝦青素沉淀下來(lái)而聚集在上下兩相之間,而絕大多數(shù)的雜色素分配在上相。所以可以采用乙醇-硫酸銨雙水相體系從雨生紅球藻蝦青素粉中制備蝦青素沉淀,不僅提取率高,而且純度比較高。該研究進(jìn)一步表明乙醇-硫酸銨雙水相體系在蝦青素純化方面具有潛力。