蔡卜磊 楊璐穎 王樂 曹鋒 鮑涵 劉亞 佘建禎 孔亮

710032 西安, 口頜系統(tǒng)重建與再生全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 空軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院頜面外科

組織修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜有序的動(dòng)態(tài)過程。組織損傷后,機(jī)體將啟動(dòng)一系列反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行自我修復(fù),包括免疫細(xì)胞的募集,受損細(xì)胞的清除,干細(xì)胞等修復(fù)相關(guān)細(xì)胞的遷移,損傷區(qū)細(xì)胞的增殖分化以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和重塑等[1]。這些階段的精確調(diào)控很大程度上依賴于免疫細(xì)胞的作用,而機(jī)體反應(yīng)多是以級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)向下傳導(dǎo)的,因此早期免疫細(xì)胞對修復(fù)結(jié)局的影響可能更大[2]。

中性粒細(xì)胞是一種多形核白細(xì)胞,是體內(nèi)最豐富的免疫細(xì)胞,約占人體血液中所有白細(xì)胞的 60%至70%,也是先天性免疫的第一反應(yīng)者。它們對抗入侵病原體的殺菌功能已得到了充分證實(shí),包括吞噬作用、釋放細(xì)胞毒性顆粒物、產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen senthesis,ROS)和形成中性粒細(xì)胞胞外陷阱(neutrophil extrocellular traps,NETs)等。但在此過程中,中性粒細(xì)胞引發(fā)的急性炎癥也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解和組織損傷,并抑制組織再生[3-4]。因此,多年來,中性粒細(xì)胞一直被認(rèn)為是一種引發(fā)急性炎癥的急性炎癥細(xì)胞。近年來,隨著研究的深入,大量證據(jù)表明中性粒細(xì)胞在組織修復(fù)和再生中也發(fā)揮著重要作用。作為最早被募集到損傷部位的細(xì)胞,他們在組織損傷部位啟動(dòng)的初始炎癥對組織修復(fù)的效果影響重大[5]。本團(tuán)隊(duì)最早發(fā)現(xiàn)了中性粒細(xì)胞在骨損傷/再生初期介導(dǎo)了干細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞的募集,并在后續(xù)觸發(fā)了修復(fù)相關(guān)細(xì)胞的增殖、血管網(wǎng)絡(luò)的重建和細(xì)胞外基質(zhì)的重塑等多個(gè)組織修復(fù)重要進(jìn)程[5-7]。

本文重點(diǎn)關(guān)注了中性粒細(xì)胞在組織修復(fù)領(lǐng)域的新興作用,并從組織損傷后中性粒細(xì)胞如何被募集與激活、如何促進(jìn)局部血管網(wǎng)絡(luò)形成,如何參與組織修復(fù)并最終影響組織修復(fù)結(jié)局這4 個(gè)方面概述中性粒細(xì)胞在組織修復(fù)過程中的關(guān)鍵作用(圖1)。

注:以骨組織損傷修復(fù)為例: ①組織損傷后,受損細(xì)胞釋放損傷相關(guān)分子模式(DAMPs),直接募集中性粒細(xì)胞,同時(shí)誘導(dǎo)局部巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞釋放白介素8(IL8)等趨化因子及受損內(nèi)皮細(xì)胞釋放白介素33(IL-33),IL-33與IL-8等趨化因子產(chǎn)生趨化因子梯度,引導(dǎo)中性粒細(xì)胞的局部浸潤; ②進(jìn)入損傷區(qū)的中性粒細(xì)胞通過基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)打通壞死區(qū)的屏障,清除細(xì)胞碎片; ③合適濃度的IL8可以促進(jìn)大量N2極化的中性粒細(xì)胞募集至缺損區(qū), N2型中性粒細(xì)胞分泌的促血管生成因子(VEGF)、金屬蛋白酶9(MMP9)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF2)等,其中FGF2會(huì)刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生MMPs,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞及血管外周細(xì)胞的遷移,重建受損區(qū)的血管網(wǎng)絡(luò),而且N2中性粒細(xì)胞可釋放基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)募集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)參與組織修復(fù)再生; ④中性粒細(xì)胞作為一種“短命”的細(xì)胞,其參與修復(fù)后的結(jié)局有壞死、NETosis、凋亡和反向遷移,細(xì)胞的結(jié)局對組織修復(fù)的結(jié)局影響巨大,其中,中性粒細(xì)胞反向遷移重新進(jìn)入脈管系統(tǒng),穿過肺部后回到骨髓,在骨髓中被清除被認(rèn)為是最利于組織修復(fù)第一種結(jié)局。本圖使用BioRender.com創(chuàng)建圖1 中性粒細(xì)胞在無菌損傷組織修復(fù)中的作用

1 組織損傷區(qū)中性粒細(xì)胞的募集

組織損傷后,損傷區(qū)將釋放一系列分子信號(hào),包括來自受損細(xì)胞啟動(dòng)的損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMP)或外來侵入物引發(fā)的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP),使得循環(huán)中的中性粒細(xì)胞迅速募集到損傷部位[8]。作為涌入損傷區(qū)的第一波免疫細(xì)胞,中性粒細(xì)胞表面表達(dá)多種受體,包括G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)、Fc受體、黏附受體、細(xì)胞因子受體和模式識(shí)別受體等,并通過這些受體對損傷和感染進(jìn)行識(shí)別和反應(yīng)[9-10]。

PAMP被免疫細(xì)胞識(shí)別后,經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子活化,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞產(chǎn)生分泌IL-1、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子,引發(fā)具有強(qiáng)烈中性粒細(xì)胞浸潤的急性炎癥來抵御外來侵入物的同時(shí)造成組織損傷[11-12]。其中兩種重要的方式為大量釋放核糖核酸外的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)NET,限制微生物擴(kuò)散以及釋放髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)等的脫顆粒作用殺滅/抑制微生物[13]。

而DAMP引發(fā)的中性粒細(xì)胞募集級(jí)聯(lián)反應(yīng)是一個(gè)受到機(jī)體精細(xì)調(diào)控的過程,在中性粒細(xì)胞參與(無菌性)組織損傷修復(fù)的過程中,不同募集因子會(huì)引發(fā)不同的免疫反應(yīng),甚至同一因子的不同刺激濃度都可能導(dǎo)致導(dǎo)致不同的組織修復(fù)結(jié)局[4]。從損傷組織釋放的 DAMP 可直接募集中性粒細(xì)胞,這些DAMP分子包括DNA、組蛋白、高遷移率蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)、N-甲?；摹⑷姿嵯佘?ATP)、白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)等[14]。這些DAMP可以作為化學(xué)引誘劑,通過激活中性粒細(xì)胞表面受體GPCRs快速募集中性粒細(xì)胞至損傷區(qū)[10]。此外,受損細(xì)胞釋放的DAMPs也可以激活周圍組織駐留細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)并誘導(dǎo)其釋放大量的趨化分子引導(dǎo)中性粒細(xì)胞向損傷區(qū)募集,包括生物活性脂類代謝物、N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl methionyl-leucyl-phenylalanine,fMLP,第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞趨化性肽)、補(bǔ)體成分以及多種細(xì)胞因子[4,15]。早期涌入損傷區(qū)的中性粒細(xì)胞通過清除壞死的細(xì)胞/組織和促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,為組織修復(fù)早期微環(huán)境的構(gòu)建打下良好基礎(chǔ),是組織損傷修復(fù)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[16]。

1.1 白細(xì)胞介素8(IL-8,CXCL8)

IL-8過去又稱中性粒細(xì)胞趨化因子,是已知的對中性粒細(xì)胞趨化活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子,可由多種細(xì)胞釋放[17-18]。損傷區(qū)細(xì)胞釋放DAMPs后,誘導(dǎo)局部組織細(xì)胞和局部巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞釋放IL-8等強(qiáng)效中性粒細(xì)胞趨化因子。損傷區(qū)釋放的IL-8可以與細(xì)胞壁和細(xì)胞外基質(zhì)上的糖胺聚糖結(jié)合,從而產(chǎn)生趨化因子梯度,通過與2 個(gè)異三聚體G蛋白偶聯(lián)受體CXCR1和CXCR2結(jié)合,引導(dǎo)中性粒細(xì)胞的局部浸潤,這種血管內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合的趨化因子梯度可高達(dá)650 μm[19-20]。而最新的研究還發(fā)現(xiàn)只有適當(dāng)濃度的IL-8才能誘導(dǎo)小鼠肌內(nèi)異位軟骨內(nèi)成骨,IL-8濃度過低無法引導(dǎo)再生,IL-8濃度過高甚至?xí)斐删植拷M織破壞,造成這一結(jié)果的原因可能與中性粒細(xì)胞的募集后的極化方向(激活水平)直接相關(guān)[7]。

此外,IL-8還可通過引導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮前體細(xì)胞遷移加速新血管的形成以及誘導(dǎo)干細(xì)胞軟骨向分化等促進(jìn)組織修復(fù)的功能也被逐漸被發(fā)現(xiàn)[21-22]。

1.2 白細(xì)胞介素-33(IL-33)

IL-33是白細(xì)胞介素-1家族成員之一,由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌,在機(jī)體免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。組織損傷時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能和完整性受到破壞,IL-33會(huì)作為“警報(bào)信號(hào)”被損傷的內(nèi)皮細(xì)胞大量釋放[23]。IL-33通過激活ST2受體,在促進(jìn)中性粒細(xì)胞粘附的同時(shí)加強(qiáng)其募集[24]。此外,IL-33可以激活局部血管下的肥大細(xì)胞和T細(xì)胞,肥大細(xì)胞在激活后產(chǎn)生TNF、IL-1和IL-6等細(xì)胞因子,以增加內(nèi)皮細(xì)胞上ICAM-1的表達(dá)來促進(jìn)中性粒細(xì)胞的粘附,并通過釋放CXCL1、CXCL2、CXCL8等趨化因子增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的募集[23,25-28]。IL-33可募集并激活T細(xì)胞,T細(xì)胞通過接觸依賴機(jī)制,在中性粒細(xì)胞的引導(dǎo)下分化為 Foxp3+CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,調(diào)節(jié)局部免疫反應(yīng)的同時(shí)分泌 IL-8 來募集中性粒細(xì)胞[29]。激活的中性粒細(xì)胞又可釋放CCL-5等趨化因子募集T細(xì)胞進(jìn)一步分泌IL-8來募集中性粒細(xì)胞,從而形成正向聯(lián)級(jí)放大反應(yīng),維持損傷區(qū)中性粒細(xì)胞的濃度,為組織修復(fù)早期提供充足的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[30]。組織修復(fù)中形成的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)為組織修復(fù)所需多種功能細(xì)胞的時(shí)空募集創(chuàng)造了條件,進(jìn)一步提示在損傷修復(fù)早期進(jìn)行調(diào)控是一種更高效的治療策略。然而,組織修復(fù)又是復(fù)雜的,其中形成的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)在后期是如何被調(diào)控和抑制的,目前仍不清楚,但已發(fā)現(xiàn)如級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)調(diào)控不當(dāng)則會(huì)造成中性粒細(xì)胞的過度活化,最終導(dǎo)致器官纖維化[31]。

2 組織損傷區(qū)中性粒細(xì)胞促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)重建

損傷區(qū)的血管網(wǎng)絡(luò)重建是組織修復(fù)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),新生血管網(wǎng)絡(luò)參與臨時(shí)肉芽組織的形成,為損傷組織的修復(fù)再生提供養(yǎng)分,也為循環(huán)干細(xì)胞的遷移募集提供路徑[32-33]。血管網(wǎng)絡(luò)重建是一個(gè)受環(huán)境信號(hào)高度調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)過程[32],而越來越多的證據(jù)表明,中性粒細(xì)胞可通過改建損傷區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)和構(gòu)建再生微環(huán)境促進(jìn)損傷區(qū)血管網(wǎng)絡(luò)重建,從而促進(jìn)組織修復(fù)。

2.1 中性粒細(xì)胞通過基質(zhì)金屬蛋白酶打通損傷區(qū)屏障

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是由一系列蛋白溶解酶組成且結(jié)構(gòu)高度保守的一類酶,因其依賴于鋅或鈣等金屬離子而得名,其中MMP9是目前已知在改建基質(zhì)及促進(jìn)血管形成方面具有非常重要作用的MMPs家族成員之一[34]。 MMP9不僅可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì),將細(xì)胞外基質(zhì)改建成更利于細(xì)胞遷移、增殖和血管生成的低密度原始狀態(tài),而且 MMP9還可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì),釋放與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合的VEGF和其他生長因子,促進(jìn)血管生成及組織生長[35]。而作為最早到達(dá)損傷區(qū)的中性粒細(xì)胞,能將高活性的MMP9輸送到組織損傷區(qū),加速局部細(xì)胞外基質(zhì)的改建及血管網(wǎng)絡(luò)的再通[34]。2015年的《Science》有報(bào)道發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞在肝組織損傷中可以通過分泌多種MMPs打通損傷肝臟周圍屏障,引導(dǎo)新生血管長入損傷區(qū),最終促進(jìn)損傷肝臟的修復(fù)[36]。因此,中性粒細(xì)胞在組織損傷早期通過分泌大量高活性MMP9打通損傷區(qū)與正常組織之間的屏障的同時(shí)引導(dǎo)新生血管長入損傷區(qū)域,為修復(fù)相關(guān)細(xì)胞進(jìn)入損傷區(qū)創(chuàng)建通道。MMP9還可并改建損傷區(qū)的細(xì)胞外基質(zhì),將細(xì)胞外基質(zhì)改建為較為疏松的原始狀態(tài),為損傷區(qū)血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及組織再生創(chuàng)造良好局部微環(huán)境。

2.2 中性粒細(xì)胞通過激活VEGF促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

中性粒細(xì)胞是機(jī)體不可或缺的促血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的免疫細(xì)胞之一。有研究在小鼠損傷模型中發(fā)現(xiàn),最早進(jìn)入損傷區(qū)的中性粒細(xì)胞和局部的內(nèi)皮細(xì)胞均會(huì)高表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF), 加速血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建[37]。而當(dāng)耗竭中性粒細(xì)胞時(shí)損傷局部的血管生成因子被完全抑制,內(nèi)皮細(xì)胞也不再表達(dá)VEGF[38]。說明中性粒細(xì)胞一方面可以直接分泌促血管生成因子VEGF,另一方面可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生VEGF,使局部高表達(dá)VEGF,加速血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,進(jìn)而促進(jìn)損傷修復(fù)。

2.3 促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的中性粒細(xì)胞亞型

近年來,腫瘤病理學(xué)定義了兩種中性粒細(xì)胞亞型,其在表型和功能存在差異:抗腫瘤形成的N1表型和促腫瘤形成的N2表型;又根據(jù)它們脫顆粒、釋放細(xì)胞因子和遷移的能力,分為促炎型(N1)和抗炎型(N2),其中有免疫調(diào)節(jié)作用的N2中性粒細(xì)胞在血管重塑階段發(fā)揮重要作用[39-42]。盡管目前對于中性粒細(xì)胞極化的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步明確,但研究發(fā)現(xiàn)N2型中性粒細(xì)胞分泌的促血管生成因子VEGF、MMP9、FGF2等顯著高于N1型,其中FGF2會(huì)刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生MMPs,并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞及血管外周細(xì)胞的遷移,表明存在專門執(zhí)行促進(jìn)血管生成的中性粒細(xì)胞亞群[43]。2017年《Nat Biomed Eng》的研究表明,宿主的N2中性粒細(xì)胞在促進(jìn)植入物與宿主之間的血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中發(fā)揮這不可替代的作用,在將移植物植入小鼠體內(nèi)后,耗竭宿主中性粒細(xì)胞則直接抑制植入物的血管化,而給宿主過繼輸入N2中性粒細(xì)胞后則可以完全恢復(fù)移植物的血管化[44]。隨著對中性粒細(xì)胞分群的進(jìn)一步研究,近期甚至在人和小鼠中發(fā)現(xiàn)了促血管再生的特異性中性粒細(xì)胞分群CXCR4hiVEGFR+ CD49d+[38]。隨著研究深入,更多中性粒細(xì)胞的分型被發(fā)現(xiàn),不同分型在機(jī)體中所發(fā)揮的精細(xì)功能也在不斷被發(fā)掘。隨著對人們中性粒細(xì)胞研究的深入,其在再生領(lǐng)域的關(guān)鍵作用將被進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

3 中性粒細(xì)胞促進(jìn)組織損傷修復(fù)

隨著研究的深入,本課題組發(fā)現(xiàn)盡管在各個(gè)器官的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞類型上存在巨大差異,但中性粒細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)幾乎在所有器官的組織修復(fù)中都發(fā)揮著重要作用[5]。目前認(rèn)為其可能主要是通過清除損傷部位的組織碎片并分泌多種因子來促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)重建來促進(jìn)組織修復(fù)的。

3.1 中性粒細(xì)胞在皮膚傷口愈合中的作用

傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為,由于皮膚上充滿了共生菌和病原菌,皮膚傷口似乎不太可能是無菌的,因此皮膚損傷總是會(huì)招募中性粒細(xì)胞而與損傷本身無關(guān),并且其作為第一個(gè)到達(dá)損傷部位的細(xì)胞會(huì)通過其經(jīng)典的吞噬與脫顆?；虍a(chǎn)生ROS等功能來對抗感染的威脅[6]。然而,越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí),中性粒細(xì)胞除了經(jīng)典的殺菌功能外,還在促進(jìn)皮膚傷口修復(fù)中也起著至關(guān)重要的作用。有臨床研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞減少的患者經(jīng)常遭受傷口愈合受阻[3];同樣地,也有研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞表面G蛋白偶聯(lián)的甲?；氖荏w(formyl-peptide receptors,FPR)缺陷小鼠的皮膚損傷模型中,損傷區(qū)因中性粒細(xì)胞募集數(shù)量顯著減少,從而表現(xiàn)出傷口愈合延遲,表明中性粒細(xì)胞在參與皮膚損傷修復(fù)中也發(fā)揮著其他功能[45]。同時(shí),在中性粒細(xì)胞耗竭的小鼠模型中也發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞耗竭會(huì)延遲老年小鼠的皮膚傷口愈合,而在注射粒細(xì)胞集落刺激因子(一種可刺激骨髓產(chǎn)生粒細(xì)胞并把它們釋放到血液中的糖蛋白)的老年小鼠中,這種皮膚愈合延遲的現(xiàn)象則被逆轉(zhuǎn),表明中性粒細(xì)胞對皮膚具有重要的作用[46]。此外,對于人類來說,隨著年齡的增長,傷口愈合得更慢,這也與中性粒細(xì)胞功能下降同時(shí)發(fā)生中性粒細(xì)胞清除感染的效率降低直接相關(guān)[47]。因此,中性粒細(xì)胞在皮膚損傷愈合中的重要作用已經(jīng)被證實(shí),并且損傷區(qū)中性粒細(xì)胞的數(shù)量直接與皮膚愈合速度正相關(guān)。皮膚損傷后機(jī)體立即通過交感神經(jīng)控制血管收縮,局部中性粒細(xì)胞也會(huì)通過形成Nets來促進(jìn)血栓的形成來控制出血。隨后大量中性粒細(xì)胞被募集至損傷區(qū)參與宿主防御,同時(shí)中性粒細(xì)胞通過釋放VEGF或MMPs來與刺激血管生成和細(xì)胞增殖,同時(shí)也會(huì)分泌促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化的相關(guān)細(xì)胞因子,促進(jìn)肉芽組織的形成,為成纖維細(xì)胞沉積膠原強(qiáng)化再生組織奠定基礎(chǔ)[6]。

3.2 中性粒細(xì)胞在肝臟損傷修復(fù)中的作用

肝臟是一個(gè)具有強(qiáng)大再生能力的器官,因此經(jīng)常被用來進(jìn)行組織修復(fù)實(shí)驗(yàn)。肝臟熱損傷模型表明,中性粒細(xì)胞是第一個(gè)到達(dá)損傷部位的細(xì)胞,通過打通損傷肝臟周圍屏障并引導(dǎo)新生血管長入損傷區(qū)促進(jìn)損傷肝臟的修復(fù)[36]。中性粒細(xì)胞耗竭則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞碎片增加,血管重建延遲,最終影響肝臟愈合[48]。同樣地,最近的一項(xiàng)研究確定了中性粒細(xì)胞在急性肝損傷模型中的雙重作用,在早期由于損傷細(xì)胞需要被清除所以表現(xiàn)出了中性粒細(xì)胞誘發(fā)的損傷增加,但在修復(fù)階段耗竭中性粒細(xì)胞則會(huì)增加肝損傷[49]。也有研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞通過產(chǎn)生金屬蛋白酶促進(jìn)纖維溶解來抑制慢性肝損傷的纖維化,促進(jìn)損傷肝臟的修復(fù)[50]。顯然,中性粒細(xì)胞在保護(hù)肝臟及促進(jìn)肝損傷修復(fù)中發(fā)揮非常重要的作用。

3.3 中性粒細(xì)胞在骨折愈合中的作用

骨折愈合一般可以分為血腫形成、血腫機(jī)化、骨痂改建和骨痂形成4 個(gè)不同階段[51]。目前已知在骨折血腫中存在大量中性粒細(xì)胞,這些細(xì)胞在骨折后幾分鐘內(nèi)到達(dá),其中包括來自循環(huán)的成熟中性粒細(xì)胞和來自骨髓的未成熟中性粒細(xì)胞[52]。研究發(fā)現(xiàn)局部應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子來增加中性粒細(xì)胞的募集可顯著加速骨折愈合,而中性粒細(xì)胞的耗竭則會(huì)顯著抑制骨折愈合[53]。有研究在患者的骨折血腫中也發(fā)現(xiàn)了與纖維連接蛋白結(jié)合的大量中性粒細(xì)胞,由此作者提出了一種浸潤的中性粒細(xì)胞通過“產(chǎn)生緊急細(xì)胞外基質(zhì)”促進(jìn)骨折早期愈合的機(jī)制[54],也就是骨折后釋放的損傷信號(hào)分子DAMPs募集中性粒細(xì)胞率先到達(dá)組織損傷區(qū)域,可以通過吞噬病原體及組織或細(xì)胞碎片清理損傷區(qū)的微環(huán)境,隨后其通過形成Nets與血小板相互作用促進(jìn)局部血腫的形成,隨后達(dá)到的中性粒細(xì)胞開始啟動(dòng)對局部的細(xì)胞外基質(zhì)的改建,通過建立血管網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)骨折愈合。近期關(guān)于骨組織內(nèi)源性再生的研究也發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞趨化因子IL8可以直接誘導(dǎo)異位骨再生,主要是因?yàn)楹线m濃度的IL8可以促進(jìn)大量N2極化的中性粒細(xì)胞募集至缺損區(qū),并通過N2中性粒細(xì)胞釋放的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derivecl factor-1,SDF-1)募集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)參與骨組織修復(fù)再生[7]。目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞通過改善骨折局部的炎癥、通過MMP9改建細(xì)胞外基質(zhì)(血腫)、通過分泌干細(xì)胞募集因子募集干細(xì)胞及引導(dǎo)血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等方式參與骨組織的損傷修復(fù),但其在每個(gè)階段中的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。骨是機(jī)體內(nèi)為數(shù)不多的,可完成大范圍損傷修復(fù)并且做到完全修復(fù)(沒有纖維化等痕跡)的器官,而中性粒細(xì)胞本身即是由骨髓產(chǎn)生,并儲(chǔ)存與骨髓腔內(nèi)的,在骨中的含量極為豐富,因此骨強(qiáng)大的修復(fù)能力是否與骨髓腔富含中性粒細(xì)胞相關(guān),是個(gè)極有意思的話題,而且骨愈合不良以及相關(guān)疾病是否與中性粒細(xì)胞數(shù)量與質(zhì)量的變化相關(guān)也值得深思。

4 組織損傷區(qū)中性粒細(xì)胞的歸宿

中性粒細(xì)胞清除方式有程序性死亡和反向遷移,它可以通過凋亡或壞死和隨后被巨噬細(xì)胞吞噬發(fā)生,或者通過反向遷移回到血管系統(tǒng)或通過排出到外部環(huán)境[55]。中性粒細(xì)胞的清除對于損傷區(qū)的炎癥消退級(jí)聯(lián)反應(yīng)至關(guān)重要,直接影響了組織修復(fù)的結(jié)局[32]。

4.1 壞死

壞死是一種劇烈的、不受控制的細(xì)胞死亡形式,表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、質(zhì)膜破裂、線粒體超極化、氧化暴發(fā)和細(xì)胞內(nèi)容物釋放。中性粒細(xì)胞壞死會(huì)釋放大量DAMP,激活免疫細(xì)胞上的Toll樣受體,以此誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的NF-κB的激活,刺激IL-1、中性粒細(xì)胞活性趨化因子等促炎因子的產(chǎn)生,促使炎癥反應(yīng)和局部組織損傷升級(jí),而中性粒細(xì)胞壞死產(chǎn)物本身也會(huì)加重組織損傷[56-57]。為了處理這些壞死產(chǎn)物和減輕其對組織的損傷,機(jī)體會(huì)通過不同的方式進(jìn)行處理。一種方式是通過吞噬細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)清除壞死細(xì)胞的殘留物,并吸收釋放的產(chǎn)物。另一種方式是通過炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制來控制炎癥因子反應(yīng),促進(jìn)組織修復(fù)[58]。

4.2 NETs

NETs是中性粒細(xì)胞的一種特殊死亡形式,NETs是中性粒細(xì)胞釋放的,由胞漿蛋白、顆粒蛋白等組蛋白組裝在濃縮的染色質(zhì)支架上而形成的一種粘性胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),最初在宿主防御的背景下被發(fā)現(xiàn),用于捕獲并殺死被困的病原體[59-60]。NETs介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞死亡會(huì)釋放促炎因子和趨化因子,可導(dǎo)致大量活化的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞募集到組織損傷區(qū)域,導(dǎo)致局部炎癥加重。受刺激的免疫細(xì)胞不斷積累,與持續(xù)產(chǎn)生的NETs相結(jié)合,形成血凝塊,嚴(yán)重情況下會(huì)引發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation;DIC)[61]。有研究表明,過度的NETs可以促成一個(gè)失調(diào)的炎癥環(huán)境,不利于功能性組織愈合,甚至導(dǎo)致局部血栓形成和組織纖維化,進(jìn)而加劇局部組織損傷[62]。

然而,對于組織損傷早期來說,NETs可以通過不同機(jī)制促進(jìn)血凝塊形成。激活的NETs可以將參與血凝塊形成的效應(yīng)蛋白集中起來,同時(shí)為血小板和紅細(xì)胞的粘附提供支架,血小板與DNA結(jié)合后被組蛋白激活,聚集形成血凝塊[63-65],為組織損傷的早期修復(fù)提供物質(zhì)基礎(chǔ)(支架結(jié)構(gòu))。研究還發(fā)現(xiàn)損傷區(qū)中性粒細(xì)胞所釋放的NETs還能夠吸附和捕獲環(huán)境中的生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白以及其他促進(jìn)骨愈合的細(xì)胞因子,為組織修復(fù)提供適宜的微環(huán)境[59]。最新研究還發(fā)現(xiàn)NETs本身還能夠作為一種支架結(jié)構(gòu),吸附和聚集礦化所需的礦物質(zhì)和有機(jī)物質(zhì),促進(jìn)骨骼和牙齒組織的形成[66]。隨著對NETs研究的深入,其在再生中的更多功能將被發(fā)現(xiàn)。

4.3 凋亡

凋亡是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的一種程序性死亡方式。凋亡的中性粒細(xì)胞暴露在其表面的磷脂酰絲氨酸,被巨噬細(xì)胞識(shí)別誘導(dǎo)了一系列促消退級(jí)聯(lián)反應(yīng),包括釋放修復(fù)細(xì)胞因子,如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、白細(xì)胞介素10(IL-10)和VEGF,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞重新編程為抗炎表型M2[32,67]。此外,巨噬細(xì)胞釋放分解素和脂氧素,進(jìn)一步增強(qiáng)其對凋亡中性粒細(xì)胞的吞噬作用[68]。此外,由凋亡的中性粒細(xì)胞釋放的α防御素增加了巨噬細(xì)胞的吞噬能力,并抑制了它們對炎癥介質(zhì)的釋放[69]。最近的研究也發(fā)現(xiàn)凋亡小體作為細(xì)胞凋亡的最終產(chǎn)物其在組織修復(fù)及炎癥控制中也具有非常重要的作用,組織損傷區(qū)的中性粒細(xì)胞的凋亡小體對于局部炎癥消退具有積極的作用,中性粒細(xì)胞通過凋亡的方式可以減緩局部炎癥,同時(shí)釋放的凋亡小體也可以作為損傷修復(fù)信號(hào)被巨噬細(xì)胞吞噬,促使巨噬細(xì)胞M2向極化來減輕局部炎癥并促進(jìn)組織修復(fù)[70]?？偟膩碚f,凋亡是一種重要的、非炎癥性的死亡方式,是損傷區(qū)中性粒細(xì)胞控制炎癥消退的主要機(jī)制之一,對于促進(jìn)組織修復(fù)有利。

4.4 反向遷移

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為中性粒細(xì)胞只有1.5～8 h的壽命,然而最新研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞平均循環(huán)壽命可達(dá)5.4 d[71]。因此,人們也開始廣泛的認(rèn)識(shí)到中性粒細(xì)胞并不總是在損傷部位死亡,而是可以離開損傷部位,返回到脈管系統(tǒng),而中性粒細(xì)胞重新返回脈管系統(tǒng)的這一過程被稱為反向遷移。有研究利用活體成像技術(shù),直接觀察到在無菌性肝損傷小鼠模型中,中性粒細(xì)胞重新進(jìn)入脈管系統(tǒng),穿過肺部,隨后上調(diào)SDF-1(CXCL12)的特異受體CXCR4(C-X-C motif chemokine receptor 4)的表達(dá)后回到骨髓,最后在骨髓中被清除[72]。此外,也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)在大鼠腎小球毛細(xì)血管損傷模型中,發(fā)現(xiàn)進(jìn)入損傷區(qū)的腎小球毛細(xì)血管中的中性粒細(xì)胞,有多于70%能夠返回主循環(huán),不在損傷部位發(fā)生凋亡[73]。以上結(jié)果均證明中性粒細(xì)胞的反向遷移是普遍存在的,通過控制損傷區(qū)中性粒細(xì)胞數(shù)量減輕局部炎癥反應(yīng)。

C-X-C趨化因子配體1(C-X-C ligand 1,CXCL1)被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)中性粒細(xì)胞的反向遷移的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一,有研究發(fā)現(xiàn)在中性粒細(xì)胞反向遷移階段血液中的CXCL1濃度增加,而該濃度可顯著促進(jìn)中性粒細(xì)胞的反向遷移[74]。此外,巨噬細(xì)胞分泌的分泌骨髓源生長因子(myloid cell devived growth factor,MYDGF)也被認(rèn)為是引導(dǎo)中性粒細(xì)胞反向遷移的關(guān)鍵細(xì)胞因子[75-76]。目前的研究認(rèn)為,在反向遷移過程中多數(shù)中性粒細(xì)胞會(huì)通過主循環(huán)返回骨髓,其主要的機(jī)制是受到反向遷移驅(qū)動(dòng)因子如CXCL1或MYDGF 的驅(qū)動(dòng),中性粒細(xì)胞首先返回脈管系統(tǒng),回到脈管系統(tǒng)的中性粒細(xì)胞會(huì)高表達(dá)CXCR4,然后在CXCL12/CXCR4信號(hào)的調(diào)控下,反向遷移的中性粒細(xì)胞最終重新回到骨髓[72]。當(dāng)然也有少部分中性粒細(xì)胞會(huì)通過循環(huán)進(jìn)入其他組織,比如肺組織,與非損傷區(qū)的中性粒細(xì)胞相比,來自損傷區(qū)中性粒細(xì)胞會(huì)牢固附著在肺內(nèi)皮細(xì)胞上,停留較長時(shí)間,引起肺部炎癥反應(yīng),嚴(yán)重時(shí)這些中性粒細(xì)胞會(huì)參與急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress cyndrome,ARDS)的發(fā)生,但目前這一具體機(jī)制還不十分清楚[72]。反向遷移可能是最高效和最符合生理的減少損傷區(qū)中性粒細(xì)胞數(shù)量主要方式之一,損傷區(qū)中性粒細(xì)胞的反向遷移這一過程可以快速減少N1型中性粒細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)局部炎癥消退,為組織再生修復(fù)創(chuàng)造有利的微環(huán)境。而局部炎性的過度激活所造成的組織修復(fù)結(jié)局不良,可能就與反向遷移被抑制相關(guān)。

5 結(jié)論與展望

綜上所述,中性粒細(xì)胞在損傷區(qū)早期炎性發(fā)生、再生微環(huán)境的構(gòu)建、組織修復(fù)再生以及局部炎癥消退中均發(fā)揮重要作用。損傷后伴隨的早期炎癥階段,中性粒細(xì)胞最早進(jìn)入損傷區(qū),通過消除侵入微生物和清除組織碎片為組織修復(fù)打基礎(chǔ);其后,通過分泌MMPs改建損傷區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)并分泌多種細(xì)胞因子構(gòu)建修復(fù)再生微環(huán)境,為隨后新血管的長入及干細(xì)胞募集創(chuàng)造條件;最后,部分中性粒細(xì)胞通過反向遷移離開損傷區(qū)域,部分中性粒細(xì)胞通過細(xì)胞凋亡促進(jìn)局部巨噬細(xì)胞M2向分化,為局部炎癥水平的恢復(fù)做出貢獻(xiàn)(圖1)。在這些精密調(diào)控的修復(fù)階段,中性粒細(xì)胞的失調(diào)和失位均可能導(dǎo)致修復(fù)失敗。

過去十年是中性粒細(xì)胞生物學(xué)研究的黃金時(shí)代,中性粒細(xì)胞不再僅僅是引發(fā)急性炎癥和組織損傷的自殺性細(xì)胞,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其在組織的修復(fù)和再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。相信隨著對中性粒細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制的深入研究,精準(zhǔn)調(diào)控中性粒細(xì)胞的功能為器官修復(fù)、組織工程再生服務(wù)將是一種新的修復(fù)策略和思路。