閔芳芳，袁璐，丁若雯

（1. 江西省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證總院檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)發(fā)展研究院，江西南昌，330052；2. 江西省藥品檢查員中心，江西南昌，330000）

0 引言

除蟲菊素是由除蟲菊花中分離萃取的具有殺蟲效果的活性成分，它包括除蟲菊素I（pyrethrins Ⅰ）、除蟲菊素II（pyrethrins II）、瓜葉菊素I（cinerinⅠ）、瓜葉菊素II（cinerin II）、茉酮菊素I（jasmolin I）、茉酮菊素II（jasmolin I），其中除蟲菊素I和除蟲菊素II為其主要成分。由于除蟲菊素具有高效、廣譜、低殘留、對(duì)人畜低毒等特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于衛(wèi)生殺蟲領(lǐng)域［1，2］。隨著人們對(duì)食品安全的重視，食品中除蟲菊素的殘留問題正逐漸引起關(guān)注，如我國(guó)新版的《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中除蟲菊素的品類新增了水果枸杞（鮮）、調(diào)味料（葉類調(diào)味料）及藥用植物枸杞（干）。

關(guān)于除蟲菊素的檢測(cè)分析，郝佳偉等人通過利用固體分散劑凈化的方式對(duì)黃芪樣品進(jìn)行前處理用HPLCMS/MS實(shí)現(xiàn)對(duì)除蟲菊素I和除蟲菊素II進(jìn)行檢測(cè)［3］。還有文獻(xiàn)報(bào)道，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法無需樣品凈化步驟亦可對(duì)蔬菜中除蟲菊素I和除蟲菊素II進(jìn)行檢測(cè)［4］。同時(shí)，秦信先利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜建立起了除蟲菊素6個(gè)組分在傳統(tǒng)中藥材枸杞上的分析方法［5］。目前，可以檢索到的關(guān)于谷物中的除蟲菊素的檢測(cè)方法多參照（GB/T 20769—2008），該方法需經(jīng)過固相凈化柱子凈化，操作煩瑣，同時(shí)洗脫液中含有甲苯，具有致突變性及致畸性等毒性。因此，建立一種簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)谷物中除蟲菊素檢測(cè)方法成為迫切需求。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) （HPLC-MS/MS） 具有分離效果好、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為農(nóng)殘檢測(cè)的首選方法［6-8］。本研究利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)， 建立了谷物樣品中除蟲菊素I和除蟲菊素II的快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6470B高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司；電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；多管渦旋混合儀，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；TDL離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；渦旋儀， 德國(guó)IKA公司。

乙腈和甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；甲酸（色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；PSA（分析純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；Si（分析純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；除蟲菊素I標(biāo)準(zhǔn)品（1000 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司）；除蟲菊素II標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

移取1.0 mL除蟲菊素I和除蟲菊素II標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別置于100 mL和10 mL棕色容量瓶中， 用乙腈定容，配制成10.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

取適量除蟲菊素I和除蟲菊素II的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈配置成質(zhì)量濃度為1μg/L、5μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

稱取約5 g（精確至0.0001 g）樣品于50 mL離心管，加入10mL乙腈，于2500 Hz下渦旋混5min充分提取，4500 rmp下離心5 min。取2 mL上清液于10 mL離心管（含50 mg PSA+50 mg Si）中，渦旋混合2 min，于4500 rmp下離心5 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜供分析備用。

1.3.2 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：Agilent Poroshell 120 EC-C18（ 50 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫： 30℃；進(jìn)樣量： 2 μL；流動(dòng)相：乙腈（ A） 和0.1%甲酸水（ B） ， 液相條件見表1。

表1 除蟲菊I和除蟲菊素II素液相條件

質(zhì)譜條件：掃描方式為正離子掃描，檢測(cè)方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：11 L/min；霧化器壓力：45 psi；鞘氣溫度：350℃；毛細(xì)管電壓： 3500 V；電子倍增管電壓： 500 V；除蟲菊素I和除蟲菊素II的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 除蟲菊素I和除蟲菊素II的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇/乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，對(duì)除蟲菊素I和除蟲菊素II的峰形及離子化效率的影響。結(jié)果表明，用乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，除蟲菊素I和除蟲菊素II的離子化率更高、峰型更窄、對(duì)稱性更好，且靈敏度更高。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相。

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

在正離子模式下，分別用質(zhì)量濃度為1000 μg/L 的除蟲菊素I和除蟲菊素II的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描確定母離子；在SIM模式下，對(duì)透鏡補(bǔ)償電壓進(jìn)行優(yōu)化；在Product Ion模式下，選取質(zhì)量數(shù)大、豐度強(qiáng)、干擾少的為定性離子和定量離子；最后，在MRM模式下，對(duì)碰撞能進(jìn)行優(yōu)化。除蟲菊素I和除蟲菊素II的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖如圖1。

圖1 除蟲菊素I和除蟲菊素II的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖

2.2 樣品前處理優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

除蟲菊素I和除蟲菊素II均不溶于水，易溶于甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，因此，本實(shí)驗(yàn)分別向陰性大米和小麥中添加質(zhì)量濃度為0.1 mg/kg除蟲菊素I和除蟲菊素II來考察甲醇和乙腈作為提取劑對(duì)目標(biāo)化合物的提取率的影響。結(jié)果如表3所示，乙腈作為提取劑，大米和小麥中除蟲菊素I和除蟲菊素II的提取率均在92%以上，同時(shí)，相對(duì)于甲醇來說，大米和小麥中的除蟲菊素I和除蟲菊素II的提取率都更高。因此，本研究選擇乙腈作為大米和小麥中的除蟲菊素提取溶劑。

表3 不同提取劑對(duì)大米和小麥中除蟲菊素I和除蟲菊素II的提取效率的影響（n=3）

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化

PSA主要去除極性干擾物，如有機(jī)酸、色素和糖類雜質(zhì)；Si主要去除如糖類等極性較大的雜質(zhì)。由于大米和小麥中主要成分為淀粉，因此，本研究通過分別添加0.1 mg/kg到陰性大米和小麥中來考察PSA、Si以及PSA和Si對(duì)大米和小麥中除蟲菊素I和除蟲菊素II的提取率的影響，不同凈化劑對(duì)待測(cè)物的提取率如圖2所示。結(jié)果表明：在大米和小麥中，用PSA和Si組合比單一的PSA或單一的Si對(duì)除蟲菊素I和除蟲菊素II有更高的提取率，因此，本實(shí)驗(yàn)選取50 mg PSA和50 mg Si組合的分散吸附劑作為最終的凈化劑。

圖2 不同固相分散劑對(duì)大米和小麥中除蟲菊素I和除蟲菊素II的提取率的影響（n=3）

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)分別配置大米和小麥作為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及純?nèi)軇┡渲脴?biāo)準(zhǔn)曲線，按照公式（1）計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。純?nèi)軇┡渲贸x菊素I和除蟲菊素II標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率分別為221.97和107.39；用大米作為基質(zhì)配置除蟲菊素I和除蟲菊素II標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率分別為207.97和100.80；用小麥作為基質(zhì)配置除蟲菊素I和除蟲菊素II標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率分別為192.00和91.53。結(jié)果表明，大米作為基質(zhì)對(duì)除蟲菊素I和除蟲菊素II的基質(zhì)效應(yīng)分別為0.94和0.94；小麥作為基質(zhì)對(duì)除蟲菊素I和除蟲菊素II的基質(zhì)效應(yīng)分別為0.86和0.85。一般來說，基質(zhì)效應(yīng)＜0.85表現(xiàn)為基質(zhì)抑制；基質(zhì)效應(yīng)＞1.15，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)；0.85≤基質(zhì)效應(yīng)≤1.15，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略［9］?；谏鲜鼋Y(jié)果，本實(shí)驗(yàn)可以選用純?nèi)軇┡渲贸x菊素I和除蟲菊素II的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 線性范圍和檢出限

將除蟲菊素I和除蟲菊素Ⅱ的標(biāo)準(zhǔn)使用液配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液，得到該兩種物質(zhì)在大米和小麥的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)（見表4）。結(jié)果表明，除蟲菊素I和除蟲菊素II在質(zhì)量濃度為1～1000 μg/L時(shí)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表4 除蟲菊素I和除蟲菊素II的線性方程

2.3.3 精密度和精密度

由表5可知，在添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04～0.40 mg/kg范圍內(nèi)，除蟲菊素I在大米和小麥的回收率分別為91.22%～93.25%和89.21%～90.56%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.59%～3.29%和1.19%～2.90%；除蟲菊素II在大米和小麥的回收率分別為90.33%～91.41%和88.32%～89.76%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.16%～5.06%和2.98%～4.22%。符合農(nóng)藥殘留分析要求［10］。依據(jù)GB/T 20769—2018，除蟲菊素的檢測(cè)檢出限為88.16 μg/kg，而本方法中除蟲菊在此濃度的信噪比（S/N）均大于3，本方法滿足要求，因此設(shè)定檢出限為88.16 μg/kg。

表5 不同質(zhì)量濃度水平除蟲菊素I和除蟲菊素II的回收率和精密度（n=6）

3 結(jié)論

本研究基于高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立了一個(gè)簡(jiǎn)便、快速、高效地測(cè)定谷物中除蟲菊素的分析方法。該方法靈敏度高，線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度均滿足方法學(xué)指標(biāo)，可為谷物中除蟲菊素殘留的快速檢測(cè)提供技術(shù)手段。