孫澤朋 王洪彬 王建東 宋德偉 肖 鵬

[1.天津科技大學，天津 300450；2.中國計量科學研究院 國家市場監(jiān)管重點實驗室（營養(yǎng)與健康化學計量及應用），北京 100029]

缺氧、細菌、病毒、支原體、藥物反應、先天性心臟病、心肌梗死、心力衰竭、川崎病等都可干擾心肌細胞代謝，從而引起心肌損傷，每年有超過700萬人死于心肌損傷類疾病[1]。標志物篩查是疾病分類、病程判斷的快捷方法，也是確定治療方案、用藥、預后的關鍵方法。據(jù)報道，約有70%的臨床診斷來自相關標志物的體外檢驗結果[2]，因此檢驗結果準確性會在很大程度上影響臨床診斷和治療。近年來，生命科學和臨床醫(yī)學均取得了長足進步，歐盟、美國、中國、日本等在其制定的診療指南、專家共識中，均將生物標志物作為影像學診斷的補充，并對生物標志物的判斷閾值、參考區(qū)間進行細化。在心肌損傷類疾病標志物中，很大一部分為氨基酸組成的多肽和蛋白質。然而，準確測量大分子生物標志物存在很多難點：生物標志物的含量通常很低，需要高靈敏的檢測方法才能檢出；在蛋白酶的作用下，一些生物標志物會發(fā)生降解，導致被測物水平下降；生成的酶解產物有可能干擾檢測結果的準確性。本文從大分子標志物測量存在的核心問題出發(fā)，分析成因，并對先進檢測技術在臨床檢驗中的應用可行性進行展望。

1 心肌損傷標志物的發(fā)展歷程

1954年，LADUE等[3]首次發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者血液中天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）異常升高。隨后經過多年研究發(fā)現(xiàn)，乳酸脫氫酶（lactic acid dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）等也會在心肌損傷過程中被大量釋放至外周血中[4]。上述酶類被公認為是最早的心肌損傷體外診斷標志物。隨著醫(yī)學科技的發(fā)展，敏感性和特異性更高的標志物，如肌紅蛋白（myoglobin，MYO）、D-二聚體（D-dimer，DD）、肌鈣蛋白、B型鈉尿肽（B-type natriuretic peptide，BNP）、氨基末端B型鈉尿肽原（N-terminal B-type natriuretic peptide，NT-proBNP），被逐步應用于臨床實踐。另外，脂肪酸結合蛋白（fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、可溶性生長刺激表達基因2蛋白（soluble growth stimulation expressed gene 2，sST2）等非特異性標志物在心肌損傷疾病診斷和預后評估中也發(fā)揮了重要的輔助作用，多指標聯(lián)合檢測更加有利于提高診斷準確度。

2 多肽和蛋白質類標志物的檢測方法和面臨的挑戰(zhàn)

通過單克隆/多克隆抗體特異性結合目標蛋白，再根據(jù)抗原抗體復合物二次結合的報告基團產生的光譜、化學等信號間接定量目標蛋白，是目前臨床檢測大分子標志物的主流方法。低豐度（ng/L）的心肌損傷標志物，如BNP、心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI），可以采用化學發(fā)光法進行檢測，一些含量相對較高（μg/L～g/L）的標志物，如CKMB、MYO，可采用生化方法進行檢測[5]。2種方法在分析時間、檢測范圍、成本、自動化程度等方面各有優(yōu)缺點。乳膠增強免疫比濁法、化學發(fā)光法等利用了抗原抗體結合的免疫學原理。標志物與抗體的復合體形成過程可被視為影響檢測結果準確性的先決因素，抗原結構異質性、抗體識別特異性等均可以改變事先定義的目標蛋白及其檢測結果。由此可見，方法的靈敏度決定了是否能檢測到被測物。另外，檢測方法的特異性代表檢測到被測物屬于單一結構還是結構類似物的集合，對半衰期短、個體異質性程度高的被測物進行檢測或許是臨床檢驗面臨的最大的挑戰(zhàn)。

2.1 抗原結構異質性對檢測準確度的影響

美國臨床醫(yī)學科學家、肌鈣蛋白發(fā)現(xiàn)者之一的APPLE教授于2012年發(fā)文稱：“在我有生之年可能無法看到肌鈣蛋白I標準化的那一天”[6]。我國國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心2012年針對124家臨床實驗室的室間質量評價（external quality assessment，EQA）結果顯示，cTnI的中位值為0.09 μg/L，但最大值約是最小值的230倍（0.01 μg/L～2.3 μg/L）[7]。異質性或許是肌鈣蛋白準確測量的最大障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者肌鈣蛋白主要以CI雙亞基形式出現(xiàn)，但同樣會存在游離I亞基、CTI三亞基的形式[6，8]。更糟糕的是，亞基氨基端或羧基端還會發(fā)生酶解、氧化、還原、磷酸化等反應，生成大量代謝產物，導致抗原中包含了游離、代謝、復合體形式，以及翻譯后修飾產物，而這一系列反應與個體的性別、年齡和健康狀況等均有關。因抗原組成復雜、個體間異質性明顯，即便使用相同試劑和檢測系統(tǒng)，結果一致性也無法得到保證，這或許就是肌鈣蛋白難以準確測量的根本原因。另外，美國國家標準和技術研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）研制的SRM2921是目前唯一的冰凍人血清肌鈣蛋白復合體有證標準物質，利用該標準物質對不同系統(tǒng)校準后，13個平臺的測量變異程度由校準前的40倍縮小到3倍[9]。盡管在標準物質介入下不同檢測系統(tǒng)間的校準效果明顯，但3倍的變異程度也是不可接受的。可惜的是，SRM2921由于穩(wěn)定性問題目前已經停產，且NIST暫時沒有重新研制或復制該標準物質的計劃。中國計量科學研究院（the National Institute of Metrology，NIM）研制的肌鈣蛋白溶液純度國家一級標準物質（GBW09229）為了避免抗原降解給定值帶來偏差，在研制過程中建立了穩(wěn)定片段代替完整蛋白的同位素稀釋質譜法，使得定值結果在長期監(jiān)測中具備很好的穩(wěn)定性。肌鈣蛋白已經是全球公認的心肌梗死診斷金標準，個體異質性使得抗體結合程度無法準確量化，免疫學方法的檢測結果變異程度高；同時，負責量值傳遞和溯源的血清/血漿標準物質穩(wěn)定性差，也給檢測系統(tǒng)的校準帶來了極大阻力。導致出現(xiàn)這種結果的根本原因可歸結為分子結構的復雜性。在不改變現(xiàn)有臨床免疫檢測原理和抗體類型的前提下，準確測量肌鈣蛋白亞基或復合體，確實很難實現(xiàn)。

cTnI的EQA結果變異很大，而意大利組織的130家臨床實驗室開展的BNP能力驗證計劃結果顯示，不同實驗室間的偏差達到了43%[10]，類似的情況還有很多。追蹤偏差成因的難度較大，因為檢驗結果不但受試劑、儀器的影響，環(huán)境、操作者等因素也會造成一定的影響，偏差成因往往很難聚焦。在我國，各級臨床檢驗中心會定期組織大量EQA活動，通過分發(fā)考核樣本對不同品牌儀器、試劑的性能和不同臨床檢驗機構的檢測能力進行測試、對比，在督促儀器、試劑生產廠商提高產品質量的同時，操作人員也可以隨時查找問題，主觀上避免額外偏差產生。EQA的統(tǒng)計結果時刻提醒臨床醫(yī)學從業(yè)者，試劑生產、被測物定義、溯源體系建立等很多環(huán)節(jié)還具備提升和改進空間，標準化技術和標準體系的建立任重道遠。ISO17511是體外診斷試劑（in vitrodiagnostic reagent，IVD）量值溯源的核心文件，其中規(guī)定了多種溯源路線圖，無論哪一種技術路線都離不開標準物質和方法?，F(xiàn)階段，大分子標準物質的研制仍具有很大挑戰(zhàn)性，這種挑戰(zhàn)并不完全來自于定值方法，而是來自“物質量”和“活性量”之間的一條“鴻溝”。在化學計量學中，針對被測物開展絕對定值可以通過將蛋白質水解至氨基酸，或酶解至肽段的形式，采用同位素稀釋質譜法獲得量值準確可靠、可溯源至國際單位制（SI單位）的定值結果，也就是“物質量”；但“活性量”目前還沒有明確溯源技術和方法，事實上“活性”既不是SI單位也不是導出單位。因此，以免疫技術為主的臨床測量若想實現(xiàn)標準化，達到結果統(tǒng)一、可比的目的，就一定要建立連接“物質量”和“活性量”的橋梁。

2.2 抗體識別特異性對檢測準確度的影響

當某些標志物的前體分子和代謝物都能被抗體識別時，將會發(fā)生交叉反應[11-12]，BNP便是典型代表。由于外周血中存在多種內肽酶，BNP在被釋放至外周血后，半衰期僅為20 min左右，此時患者血液中不僅有完整的BNP，即BNP1-32，還存在大量的代謝產物，如BNP3-32、BNP4-32、BNP5-32，甚至還存在糖基化的B型鈉尿肽原。根據(jù)國際臨床化學和檢驗醫(yī)學聯(lián)合會（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）公開的BNP檢測系統(tǒng)信息，識別抗體針對的抗原表位為BNP的aa.5-13、aa.27-32、aa.14-21，這表明B型鈉尿肽原和絕大多數(shù)BNP代謝產物均可被抗體結合，從而被計算到檢測結果中，也就是說，目前技術檢測的是BNP的總量，而非BNP1-32。BNP總量是否可以代替BNP1-32尚需要大量的臨床研究才能下結論。但追求被測量的真實結果一定是檢驗的發(fā)展方向。另外，BNP1-32還具有激活cGMP通路等的活性，將其與無活性的代謝物一起計入BNP檢測結果顯然是不合適的?；诖耍琇EWIS等[13]針對氨基端抗原表位設計并研制了一種新型抗體，用于識別BNP1-32，在與50E1（aa.26-32）檢測抗體結合使用后，發(fā)現(xiàn)交叉反應得到了很好的抑制，盡管這項研究還未應用于商品化試劑的生產中，但在追求BNP檢測真實結果中無疑具有里程碑式的意義。

3 多肽和蛋白類標志物檢測新技術

隨著科學技術的發(fā)展，一些新興的多肽和蛋白類檢測技術已經被開發(fā)出來，可以克服檢測靈敏度不夠、特異性較差、動態(tài)范圍小的問題。此外，還能實現(xiàn)高通量分析，即在單個樣本中同時檢測多種蛋白質，有利于提高檢測效率、減少樣本損耗、降低成本。這些新興的多肽和蛋白類檢測技術具有超高靈敏度、高特異性、寬動態(tài)范圍，能夠實現(xiàn)高通量分析。

3.1 表面增強拉曼散射技術

表面增強拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）是一種超靈敏的振動光譜技術，通過拉曼光譜法測定附著在經過特殊處理的金屬表面（金/銀）的樣本，以拉曼散射作為讀取信號進行測量?；赟ERS免疫分析法檢測蛋白標志物的基本過程見圖1[14]。SERS的探針在特異性識別目標分析物的同時還可為目標分析物的定量檢測提供SERS信號。HE等[15]使用了一種可以容納很多金/銀納米顆粒的新型高孔隙率晶體材料-金屬有機骨架（metal-organic framework，MOF），顯著增強了拉曼信號，從而提高了SERS的靈敏度。通過這種方法，成功對NT-proBNP進行了快速有效的超靈敏檢測，其最低檢測限為0.75 fg/mL，檢測范圍為1 fg/mL～1 ng/mL。

圖1 基于SERS的夾心免疫分析法[14]

為了將這種高靈敏度、高特異性、動態(tài)范圍寬的SERS免疫分析方法應用于臨床疾病蛋白類標志物檢測，未來關注點應該集中于提高檢測方法的可重復性、降低成本和簡化操作步驟方面。

3.2 懸浮陣列技術

懸浮陣列技術是美國Luminex公司研制的以熒光編碼微球為核心，集流式細胞分析、激光分析、高速信號處理等技術于一體的分析技術平臺。該技術將聚苯乙烯微球用熒光染色法進行編碼（即通過2種熒光染料對微球進行染色，調節(jié)比例后，可以獲得100種不同顏色的微球），每種染色的微球交聯(lián)1種針對某個被測物的生物探針（抗體、適體）。不同被測物的編碼微球進行混合后，再加入微量待檢的樣本，靶分子與微球表面交聯(lián)的探針在懸液中進行特異性結合，在1個反應孔中可同時完成約100種不同的生物學反應，采用激光流式儀鑒定微球顏色來確定被測物，同時通過檢測靶物質上的報告分子產生的熒光強度來進行定量[16]。LIU等[17]通過該技術檢測了血清中3種心肌梗死生物標志物（cTnI、CK-MB、MYO），具體過程見圖2。與常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）相比，懸浮陣列技術的檢測靈敏度可提高10～100倍，最低檢測下限為0.01 pg/mL；檢測的動態(tài)范圍比常規(guī)的ELISA方法高10倍以上，可達3～5個數(shù)量級；檢測所需時間更短，檢測效率更高，重復性好；一次可同時檢測多種疾病的生物標志物，具高通量檢測能力[17]。

圖2 懸浮陣列技術檢測AMI生物標志物[17]

懸浮陣列技術的高通量、高靈敏度、高精確性的特點符合臨床多指標聯(lián)合檢測的要求，在檢驗醫(yī)學領域具有廣闊的應用前景。

3.3 單分子免疫陣列分析技術

單分子免疫陣列分析技術是一種在體積為fL大小的微孔中進行單分子酶促反應，并可進行熒光成像的數(shù)字式ELISA（圖3），具有靈敏度高、檢測范圍寬、耗時短等優(yōu)勢[18]。單分子免疫陣列分析技術采用經典的雙抗夾心ELISA原理，可實現(xiàn)極低含量蛋白的定量檢測。該技術的關鍵在于將免疫復合物捕獲，并密封在含有超過20萬個fL大小的微孔的芯片中，從而實現(xiàn)單個分子的檢測，大幅提升了檢測靈敏度，因此這種技術又被稱為數(shù)字式ELISA，比傳統(tǒng)的ELISA方法靈敏度高1 000倍。JAROLIM等[19]基于單分子免疫陣列技術開發(fā)了一種用于檢測cTnI的新型全自動數(shù)字分析儀，檢測限為0.01 ng/L，定量限為0.08 ng/L；通過檢測健康對照者和心力衰竭患者的cTnI水平，發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者cTnI水平顯著升高，并可作為心力衰竭嚴重程度更詳細的分類參考。此外，建立個性化的參考區(qū)間，不僅適用于測定健康個體cTnI水平，還適用于運動負荷測試后cTnI變化的監(jiān)測。

圖3 單分子陣列免疫分析示意圖[18]

這種超靈敏、高通量、操作簡便的單分子免疫陣列分析技術不僅可以檢測血清、血漿中極低含量的蛋白類標志物，還可以辨別生物標志物的微小變化，有利于心肌損傷類疾病的早期診斷，了解高風險患者的疾病進展，及時采取個性化預防措施。

3.4 臨床質譜

與前幾項技術相比，質譜技術具有極好的特異性，可以提供蛋白質序列信息，并可用于檢測和量化蛋白翻譯后修飾和代謝產物。此外，質譜技術已被應用于一些臨床檢驗領域，如基于高分辨質譜的微生物鑒定、基于四極桿質譜和配套試劑盒的定量檢測，但大多數(shù)還僅限于小分子物質的檢測。液相色譜質譜聯(lián)用技術對復雜基質中的多肽和蛋白進行準確定量較為困難，需要驗證方法的回收率、定量范圍、定量限、準確度和精密度[20]，該技術主要受制于前處理方法的性能，一旦樣本經處理后達到檢測要求，色譜、質譜和工作站等完全具備檢測大分子生物標志物的能力。

同位素稀釋質譜（isotope dilution mass spectrometry，ID-MS）是目前國際物質量咨詢委員會認可的基準方法之一，被各國計量機構廣泛用于大分子標準物質的研制。TORMA等[21]基于ID-MS對BNP中的氨基酸或酶解肽段進行準確定量，從而推導出完整分子的量值，由于所有結果均可以溯源至氨基酸國家標準物質，利用該方法研制標準物質也同時具備了計量學溯源性，因此該方法也被稱為參考測量程序。電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）可通過測定標志物中金屬元素的量，再根據(jù)一級結構信息去計算蛋白的絕對量。由于BNP中的甲硫氨酸和半胱氨酸含有硫元素，因此可針對硫元素開發(fā)一種ICP-MS方法，間接對BNP進行定量。DEITRICH等[22]采用ICP-MS技術對人硒蛋白P1（selenoprotein 1，SEPP1）進行定量檢測，通過測量78Se/76Se和82Se/76Se同位素比值來確定2種酶解肽的Se質量分數(shù)，從而對SEPP1進行準確定量。這種方法校正了處理過程和分析過程中的隨機誤差和系統(tǒng)誤差，提高了ICP-MS定量的準確性。

近年來，國際物質量咨詢委員會蛋白工作組的工作計劃可以看出，在完整蛋白水平開展ID-MS或許是下一階段技術突破的重點方向，盡管在完整蛋白水平開展研究需要更大的投入，但由于不使用水解或酶解反應，目標物的溯源路徑更短、定值不確定度更小，因此可提高ID-MS檢測系統(tǒng)校準后測量結果的準確性。

4 展望

臨床對心肌損傷標志物檢測的第一訴求往往是速度，尤其是急性患者，檢測結果呈現(xiàn)給醫(yī)生的時間可能直接與患者生命相關聯(lián)。目前的免疫學檢測技術可以滿足“快”的需求，尤其是近年來開發(fā)的可達到μg和ng量級的即時檢驗（point-of-care testing，POCT）產品，使檢測的便捷性有了質的提升。但在“快”的同時，還需面對“準”的問題。很多研究結果均提示檢驗工作者，隨著更加靈敏、高特異性技術的發(fā)展，我們對復雜樣本中標志物的存在狀態(tài)有了更清晰的認知，下一步將是把這些技術向臨床應用轉化。質譜等新型技術在心肌損傷標志物檢測的應用中還有許多問題需要解決，但質譜特有的質量分辨率和擴展分析能力可能是解決“準”的問題的關鍵。盡管新型技術目前受到較多限制，但將具有更高結構分析能力的技術引入臨床，必將推動檢驗醫(yī)學的發(fā)展。