榮玉娟，侯雨薇，曹曉倩，張佳佳，周 彬,2,*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；2.發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068）

麥谷蛋白（glutenin，Glu）是一種天然植物蛋白，具有營養(yǎng)豐富、來源廣泛、低致敏性、良好的生物學(xué)價(jià)值等優(yōu)點(diǎn)。Glu由10%的高分子質(zhì)量Glu和90%的低分子質(zhì)量Glu組成[1]。低分子質(zhì)量Glu不僅與自身結(jié)合，而且還通過分子內(nèi)和分子間二硫鍵與高分子質(zhì)量Glu亞基（glutenin subunits，GS）結(jié)合形成Glu聚集體[2]，此結(jié)構(gòu)特性大大降低了Glu的柔韌性。而且Glu富含脯氨酸和谷氨酰胺，帶電氨基酸比較少，使其在中性條件下溶解度較低，大大限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[3-5]。因此采用簡單易行的處理手段提升Glu在中性條件下的溶解性對于拓寬其應(yīng)用范圍具有較強(qiáng)的產(chǎn)業(yè)價(jià)值。

對蛋白修飾的研究大多集中于物理處理、化學(xué)處理和生物酶修飾等方面[6]。物理方法包括超聲波處理、熱處理、脈沖電場、高壓破碎、擠壓、冷凍等[7-9]。例如，Zhang Lei等[7]利用超聲波提高蛋白質(zhì)的發(fā)泡能力和乳化能力。Buhler等[8]利用干熱改性蠶豆?jié)饪s蛋白以增加持水能力。Liu Bohui等[9]利用球磨機(jī)處理大豆分離蛋白極大提升了蛋白的凝膠強(qiáng)度和持水能力?；瘜W(xué)方法主要是通過引入化學(xué)基團(tuán)對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，包括酸堿處理、磷酸化、糖基化和脫酰胺等。例如，Majzoobi等[10]利用乙酰化提高Glu的溶解度和水結(jié)合能力。Chen Weijun等[11]利用美拉德反應(yīng)增強(qiáng)蛋白質(zhì)與水分子的相互作用從而提升糖基化產(chǎn)物的溶解度。Liu Xiao等[12]通過谷氨酰胺酶脫酰胺改性Glu改善了其理化性質(zhì)。生物學(xué)方法多利用酶水解、酶交聯(lián)以及蛋白質(zhì)相互作用等方式修飾蛋白質(zhì)。如Sun Qian等[13]利用復(fù)合蛋白酶酶促修飾提升核桃谷蛋白的持水力和乳化穩(wěn)定性。pH值偏移處理是一種可以定向誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化從而有效改善蛋白質(zhì)功能特性的方法，這種改性方法對Glu的影響至今少有人研究。

本研究利用不同pH值偏移處理?xiàng)l件對Glu進(jìn)行改性，借助動態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）、透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）、熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜、紫外光譜、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）等方法探究pH值偏移處理對Glu功能特性的影響。以期通過pH值偏移處理改善中性條件下Glu的溶解性及拓寬其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥蛋白 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司；β-巰基乙醇 上海麥克林生化科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)賽國生物科技有限公司；SDS 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；疊氮化鈉（NaN3）上海麥克林生化科技有限公司；超純水 武漢優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Zeta sizer Nano-ZS 90納米粒度測定儀 英國馬爾文公司；UV2600紫外-可見分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；F7000熒光分光光度計(jì)、H7650 TEM 日立科學(xué)儀器（北京）有限公司；Seven Compact精密pH計(jì)梅特勒托利多科技（中國）有限公司；Nicoletis-50傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Glu的提取

將二氯甲烷和小麥蛋白以液固比7∶1（mL/g）混合，3000 r/min攪拌2 h使其均勻分散，并進(jìn)行抽濾脫脂。將沉淀繼續(xù)溶于二氯甲烷中以3000 r/min攪拌3 h后抽濾再次脫脂。將沉淀和乙醇以1∶10比例混合攪拌3 h后離心取沉淀物冷凍干燥并粉碎以獲得Glu。通過凱氏定氮法測得Glu純度為（86.0±0.8）%。

1.3.2 Glu的pH值偏移處理

在500 mL 3%的Glu溶液中加入1 mL 0.02%疊氮化鈉溶液以防止滋生微生物。用HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH值至1.0、2.0、3.0、10.0、11.0、12.0和13.0并攪拌4 h。在此期間，每小時測定pH值并調(diào)整至初始值。隨后將所有樣品pH值調(diào)至7.0并穩(wěn)定1 h。凍干成粉末后貯藏于干燥器中備用。根據(jù)不同pH值偏移處理將Glu樣品分別命名為Glu-1、Glu-2、Glu-3、Glu-10、Glu-11、Glu-12和Glu-13，未經(jīng)處理的為對照。

1.3.3 蛋白質(zhì)溶解度測定

將3 份質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的Glu溶液置于2 mL離心管中10000×g、25 ℃離心10 min，并保留上清液。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，通過BCA試劑盒測定蛋白離心后上清液濃度和未離心前蛋白溶液濃度。蛋白質(zhì)溶解度可用上清液中蛋白質(zhì)量濃度與溶液中總蛋白質(zhì)量濃度的百分比表示。

1.3.4 蛋白質(zhì)粒徑、PDI及Zeta電位的測定

蛋白的粒徑、Zeta電位及多分散系數(shù)（polydispersity，PDI）均由配備He-Ne激光（633 nm）的DLS納米粒度電位分析儀測定。測定前不同處理組Glu溶液均在BCA試劑盒下調(diào)至蛋白質(zhì)量濃度一致（0.1 mg/mL）。

1.3.5 蛋白質(zhì)表面疏水性的測定

以8-苯胺-1-奈磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）作為熒光探針，測定蛋白質(zhì)表面疏水性。將Glu溶液用BCA試劑盒稀釋至0.125～1.000 mg/mL，取5 mL樣品與ANS（8 mmol/L，30 μL）在黑暗中混合5 min后采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測定。激發(fā)波長設(shè)置為380 nm，發(fā)射波長范圍設(shè)置為400～600 nm，電壓設(shè)置為400 V，掃描速率設(shè)置為12000 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度5 nm。

1.3.6 蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜的測定

內(nèi)源熒光光譜由熒光分光光度計(jì)測定。所有樣品均10000×g、4 ℃離心10 min，測定前將所有樣品用BCA試劑盒調(diào)成同一質(zhì)量濃度。將蛋白溶液（0.1 mg/mL）置于四面透光的比色皿中進(jìn)行測量。激發(fā)波長設(shè)置為290 nm，發(fā)射波長范圍為300～460 nm，掃描速率為12000 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm。

1.3.7 紫外光譜的測定

紫外光譜測定采用紫外-可見分光光度計(jì)。所有樣品均10000×g、4 ℃離心10 min，測定前將所有樣品用BCA試劑盒調(diào)成同一質(zhì)量濃度。將蛋白溶液（0.1 mg/mL）置于石英比色皿中進(jìn)行測量。掃描范圍為200～500 nm，間隔1 nm。

1.3.8 蛋白質(zhì)巰基與二硫鍵含量測定

基于已有研究[14]稍加修改。蛋白質(zhì)樣品用含有8 mol/L尿素（用于測量總巰基）和不含8 mol/L尿素（用于測量暴露巰基）的Tris-Gly緩沖液（86 mmol/L Tris、90 mmol/L甘氨酸、4 mmol/L EDTA）稀釋至3 mg/mL。在5 mL樣品溶液中加入50 μL的Ellman’s試劑（5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB），4 mg/mL），在黑暗處反應(yīng)1 h，以不含DTNB的樣品作為對照。反應(yīng)結(jié)束后將樣品5000×g離心10 min并取上清液在412 nm波長處測定吸光度。測定蛋白質(zhì)游離巰基的計(jì)算公式如下：

式中：A412nm為在412 nm波長處的吸光度；C為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為稀釋系數(shù)1.01；73.53為106與1.36×104的比值（1.36×104為摩爾消光系數(shù)）。

測定二硫鍵含量時，將3 mg蛋白質(zhì)樣品溶解在含有10 mol/L尿素的1 mL Tris-Gly緩沖液中。然后加入60 μLβ-巰基乙醇以破壞二硫鍵，反應(yīng)1 h后，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液繼續(xù)暗反應(yīng)1 h以沉淀蛋白質(zhì)。然后將混合物5000×g離心10 min，回收沉淀，用12% TCA洗滌2 次以除去β-巰基乙醇。沉淀中加入3 mL含8 mol/L尿素的Tris-Gly緩沖液和50 μL DTNB在黑暗中反應(yīng)1 h。5000×g離心10 min后取上清液在412 nm波長處測定吸光度。計(jì)算公式如下：

式中：A412nm為412 nm波長處的吸光度；C為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為稀釋系數(shù)3.05；總游離巰基含量為式（1）的計(jì)算結(jié)果，μmol/L。

1.3.9 SDS-PAGE分析

參照Peng Weiwei等[15]的研究方法稍作修改。蛋白樣品與SDS上樣緩沖液（150 mmol/L Tris-HCl、1% SDS、20%甘油、2%β-巰基乙醇、8 mol/L尿素，pH 6.8）按體積比1∶1混合?；旌虾笤?9 ℃變性10 min后冷卻至室溫，2000×g離心2 min后取上清液20 μL置于膠孔中。電泳使用5%的濃縮膠和12%的分離膠在室溫70 V運(yùn)行直到條帶從濃縮膠遷移到分離膠中，然后在120 V運(yùn)行1.5 h。使用考馬斯亮藍(lán)染液（30%甲醇、10%乙酸和0.2%考馬斯亮藍(lán)R-250）進(jìn)行染色2 h，然后用脫色液（10%乙酸、30%甲醇、60%超純水）脫色過夜。脫色后通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。

1.3.10 傅里葉變換紅外光譜的測定

通過傅立葉變換紅外光譜測定Glu在4000～500 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜。結(jié)果通過OMNIC 8.2軟件和Peakfit 4.12進(jìn)行擬合分析Glu的二級結(jié)構(gòu)。

1.3.11 蛋白質(zhì)微觀形貌觀察

制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的Glu溶液，用滴樣法將樣品滴在銅網(wǎng)上晾干，使用TEM在80 kV下觀察Glu的聚集情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有結(jié)果均測量3 次取平均值。采用IBM SPSS Statistics 26.0軟件進(jìn)行方差分析，分析組間差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值偏移處理對Glu溶解度的影響

良好的溶解性是食品蛋白質(zhì)加工利用的前提條件[16]。如圖1A所示，經(jīng)過不同pH值偏移處理后Glu的溶解度均有所增加。這是由于pH值偏移處理過程中Glu發(fā)生了脫酰胺，酰胺鍵斷裂，使酰胺基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)轸然蚨鞍踪|(zhì)帶負(fù)電荷增加且靜電斥力變大，同時蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中氫鍵及范德華作用力減弱，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，水合能力增加[17]。其中堿偏移處理下溶解度明顯提高，特別是Glu-13的溶解度接近90%。在圖1B可以直接觀察到蛋白質(zhì)溶液的宏觀差異，堿偏移處理?xiàng)l件下蛋白溶液較均勻，溶液底部沉淀較少，其中Glu-12和Glu-13底部無明顯沉淀。Glu溶解性增加可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)在堿處理?xiàng)l件下形成了熔融球狀，這增強(qiáng)了蛋白質(zhì)-水相互作用的能力，導(dǎo)致Glu的溶解性顯著增加；也可能是由于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和可溶性蛋白質(zhì)聚集體的形成[18]。因此堿偏移處理是提高Glu在中性條件下溶解度的有效途徑。Zhang Jingnan等[19]研究發(fā)現(xiàn)，豌豆蛋白經(jīng)堿處理后表面疏水性有所增加的同時溶解度也有所改善，這可能是由于蛋白表面疏水基團(tuán)之間的分子相互作用減弱所致。此外由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重排可能會產(chǎn)生新的疏水區(qū)域[20]。而Yildiz等[21]也認(rèn)為，蛋白質(zhì)的溶解度并不完全取決于疏水區(qū)域的暴露程度。

圖1 不同 pH 值偏移處理下Glu的溶解度（A）及表觀形態(tài)（B）Fig.1 Solubility (A) and visual morphology (B) of Glu under different pH-shifting treatments

2.2 粒徑、Zeta電位與形貌分析

不同pH值偏移處理下Glu的平均粒徑如圖2A所示。結(jié)果表明，與未處理的Glu相比，不同pH值偏移處理后的Glu平均粒徑均顯著減小。這可能是因?yàn)閜H值偏移處理使Glu中的谷氨酰胺發(fā)生脫酰胺轉(zhuǎn)換為谷氨酸，增加了蛋白質(zhì)側(cè)鏈羧基含量，增加相同條件下Glu的帶電量，增大分子間靜電斥力，降低氫鍵相互作用，抑制蛋白質(zhì)分子的聚集行為，從而致使Glu粒徑減小[22]。此外，堿偏移處理效果優(yōu)于酸偏移處理。一般來說粒徑越小的蛋白質(zhì)聚集體越容易溶解，較小的蛋白質(zhì)聚集體有助于增加水溶性，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)和水分子之間的相互作用面積更大[23]。此外，在pH值偏移處理后Glu的PDI均減小，堿偏移處理下PDI更小，溶液分散性更好。結(jié)果表明在堿偏移處理?xiàng)l件下使Glu遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)（pH 4.9），產(chǎn)生了強(qiáng)烈的靜電斥力，從而使其分散性更加均勻[24]。

圖2 不同pH值偏移處理后Glu的粒徑及多分散指數(shù)（A）、Zeta電位（B）、TEM圖像（C）和粒徑分布（D）Fig.2 Particle size and PDI (A),zeta potential (B),TEM images (C)and particle size distribution (D) of Glu solution under different pH-shifting treatments

從圖2B可以看出，經(jīng)過pH值偏移處理后的Glu都帶負(fù)電荷，這可能是在pH值偏移處理的過程中Glu發(fā)生了脫酰胺。大量不帶電荷的極性天門冬酰胺和谷氨酰胺的中性酰胺側(cè)鏈轉(zhuǎn)變成帶負(fù)電荷的羧酸基，從而生成了天冬氨酸和谷氨酸[25]。堿偏移處理下凈負(fù)電荷顯著升高，表明在一定程度上改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象使其暴露了內(nèi)部的極性基團(tuán)，因此隨著表面極性基團(tuán)的電離，更多的電荷積聚在分子表面以獲得更高的凈負(fù)電荷。而酸偏移處理下凈負(fù)電荷略微減小可能是由于蛋白質(zhì)的重新聚集掩埋了暴露在蛋白質(zhì)內(nèi)部分子表面的極性基團(tuán)。一般情況下由于蛋白質(zhì)顆粒之間存在較強(qiáng)的靜電斥力，因此高凈電荷體系相對穩(wěn)定。帶相同電荷的蛋白質(zhì)鏈更容易相互排斥、解離或展開[26]。蛋白質(zhì)的表面電荷受親水性和疏水性極性殘基之間平衡的影響，這Xiong Wenfei等[27]結(jié)論一致。

此外，利用TEM觀察Glu粒子的形態(tài)變化。由圖2C可知，未經(jīng)處理的Glu聚集體尺寸較大且分散不均一，經(jīng)pH 1～3偏移處理后，Glu的聚集程度沒有明顯改善，仍處于緊密聚集狀態(tài)。然而，經(jīng)堿偏移處理后，其聚集程度顯著減弱，且圖2D粒徑分布也顯示粒子尺寸分布較為均勻，這與粒徑分析結(jié)果一致。

2.3 蛋白質(zhì)表面疏水性分析

如圖3所示，經(jīng)pH值偏移處理后的Glu表面疏水性均有不同程度的提高。堿偏移處理下Glu的表面疏水性顯著高于酸偏移處理，其中pH 13偏移處理下Glu的表面疏水性增加最顯著。這可能是由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在堿處理早期部分展開，導(dǎo)致一種變性與未變性的熔融球態(tài)[28]。在此狀態(tài)下蛋白質(zhì)的疏水肽段和氨基酸殘基的疏水側(cè)鏈基團(tuán)暴露增加[29]。許多研究表明在極端酸堿處理?xiàng)l件下，蛋白的三級結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，二硫鍵可能斷裂，從而削弱了側(cè)鏈之間的相互作用，增加了疏水性和分子靈活性[30]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)回到中性狀態(tài)時，蛋白間的重折疊過程會重新排列蛋白質(zhì)表面的疏水基團(tuán)。蛋白質(zhì)表面疏水性受蛋白質(zhì)表面與極性介質(zhì)接觸的疏水性區(qū)域數(shù)量的影響[20,31-32]。此外pH值偏移處理過程中Glu發(fā)生了脫酰胺，隨著脫酰胺的進(jìn)行能夠有效展開蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，使本來包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露且使蛋白質(zhì)的兩親性增加，同時增加了蛋白質(zhì)在水中的溶解性[33]。因此Glu表面疏水性的變化也反映了pH值偏移處理下其溶解性的變化。

圖3 不同pH值偏移處理下Glu的表面疏水性Fig.3 Surface hydrophobicity of Glu under different pH-shifting treatments

2.4 蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜與紫外光譜分析

如圖4A所示，對照組最大發(fā)射熒光波長為352 nm，而經(jīng)過pH值偏移處理Glu樣品的最大發(fā)射熒光波長均出現(xiàn)藍(lán)移且熒光強(qiáng)度均發(fā)生不同程度的增加，堿偏移處理樣品的熒光強(qiáng)度增幅更大，結(jié)果表明，pH值偏移處理誘導(dǎo)Glu構(gòu)象發(fā)生解折疊，更多的熒光基團(tuán)暴露出來。Glu的色氨酸微環(huán)境向更疏水的微環(huán)境偏移，更多疏水基團(tuán)的暴露致使蛋白質(zhì)環(huán)境更加疏水，這與疏水性結(jié)果一致。蛋白質(zhì)中氨基酸微環(huán)境的變化也會改變紫外吸收波長，因此可以用紫外光譜表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。如圖4B所示，對照組最大峰值為276 nm，較對照相比pH值偏移處理后Glu的最大峰值均發(fā)生偏移。酸偏移處理下最大峰值偏移更顯著（8 nm）。這些最大吸收峰的差異與苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的殘留有關(guān)，最大吸收峰的紅移表明了Glu氨基酸環(huán)境的變化。此外，從圖中也可以看出酸偏移處理后的特征吸收峰明顯增強(qiáng)，堿偏移處理后的特征吸收峰降低，說明pH值偏移處理會致使Glu構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變[34]。

2.5 蛋白質(zhì)游離巰基及二硫鍵含量分析

Glu本身含有巰基及大量分子間二硫鍵和分子內(nèi)二硫鍵，二硫鍵有助于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成[35]。由圖5A可知，經(jīng)pH值偏移處理后Glu中巰基含量增加且總游離巰基含量均高于暴露游離巰基含量，說明蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)中仍存在大量巰基。經(jīng)過pH值偏移處理后總游離巰基和暴露游離巰基含量均有所增多，較高的游離巰基含量表明由于蛋白質(zhì)去折疊從而暴露了內(nèi)部巰基，或是天然蛋白質(zhì)中S—S鍵的斷裂而產(chǎn)生新的巰基所致。從圖5B中二硫鍵含量上也可以看出，pH值偏移處理后樣品的二硫鍵含量均減少，這說明在pH值偏移處理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)的二硫鍵發(fā)生不同程度的斷裂，進(jìn)而生成新的游離巰基，這也是導(dǎo)致總游離巰基增加的原因之一。同時暴露游離巰基含量的增加可能是由于pH值偏移處理后，Glu顆粒的大小和形態(tài)發(fā)生了變化，使得隱藏在Glu中的巰基暴露于蛋白質(zhì)表面[29]。

圖5 不同pH值偏移處理下Glu的總游離巰基和暴露巰基（A）及二硫鍵含量（B）Fig.5 Total free sulfhydryl group and exposed sulfhydryl group (A) and disulfide bond contents (B) of Glu under different pH-shifting treatments

2.6 SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE分析pH值偏移處理后Glu分子質(zhì)量及其主要亞基的變化。Glu由分子間二硫鍵相連的GS組成，GS中也存在分子內(nèi)二硫鍵[1]。通常GS由高分子質(zhì)量GS和低分子質(zhì)量GS組成[1]。其中分子質(zhì)量在20～70 kDa的是低分子質(zhì)量GS，占Glu的90%，分子質(zhì)量為80～130 kDa的是高分子質(zhì)量GS，占Glu的10%。從圖6可以觀察到，Glu的主要條帶集中在20～70 kDa處，在35 kDa處條帶最深，表明分子質(zhì)量大部分集中在此處。經(jīng)過堿偏移處理后樣品在20～25 kDa處產(chǎn)生了新的條帶，表明堿偏移處理使Glu分解成了更小分子質(zhì)量的肽段，這些低分子質(zhì)量多肽可能是通過β-巰基乙醇分解S—S鍵而產(chǎn)生[29]。

圖6 不同pH值偏移處理下Glu的SDS-PAGE圖像Fig.6 SDS-PAGE patterns of Glu under different pH-shifting treatments

2.7 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)有3 條典型的紅外吸收帶：酰胺I帶位于1600～1700 cm-1，主要為C＝O及少數(shù)C—N；酰胺II帶1525～1550 cm-1，主要為N—H及部分C—N；酰胺III帶位于1230～1350 cm-1，主要為C—N及少數(shù)N—H[36]。從圖7可知，Glu在1637、1525 cm-1附近有2 個明顯的吸收峰，分別為酰胺I帶的C＝O和酰胺II帶的N—H振動引起的。另外在3300 cm-1附近有較寬的吸收峰，這歸因于羥基的伸縮振動。其中，酰胺I帶對蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響最具價(jià)值，因此對酰胺I帶進(jìn)行研究且通過擬合后發(fā)現(xiàn)酰胺I帶可獲得4 個條帶，分別是β-折疊、無規(guī)卷曲、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角。從表1可以看出，通過pH值偏移處理后Glu的α-螺旋含量下降，有研究表明表面疏水性與α-螺旋含量呈負(fù)相關(guān)，表面疏水性會隨著α-螺旋含量的降低而增加[37]，這與疏水性結(jié)果一致。另外pH值偏移處理過程中Glu發(fā)生了脫酰胺，使谷氨酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?，從而降低了含有氫鍵的β-折疊結(jié)構(gòu)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)楦呷嵝缘臒o規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

表1 不同pH值偏移處理下Glu的二級結(jié)構(gòu)含量Table 1 Secondary structure content of Glu under different pH-shifting treatments %

圖7 不同pH值偏移處理下Glu的紅外光譜圖Fig.7 FTIR spectra of Glu under different pH-shifting treatments

3 結(jié)論

本研究考察了pH值偏移處理對Glu結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的影響。結(jié)果表明，堿偏移處理可顯著降低Glu分子的聚集程度，有利于Glu的溶解。經(jīng)pH值偏移處理的Glu表面疏水性均有不同程度的增加，且堿偏移處理下表面疏水性要高于酸偏移處理。此外，pH值偏移處理會導(dǎo)致Glu分子中二硫鍵不同程度的斷裂，且堿偏移處理下更多二硫鍵斷裂生成巰基，使Glu分子中游離巰基含量增加。二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，經(jīng)pH值偏移處理后α-螺旋和β-折疊含量下降，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量有所增加。本研究對改善Glu功能特性，拓寬其在食品工業(yè)的應(yīng)用范圍具有積極的意義。