羅 悅，劉瑞山，王志遠(yuǎn)，柴麗娟，陸震鳴，史勁松，張曉娟,*，許正宏

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫 214122；3.福建綠泉食品有限公司，福建 漳州 363200；4.江南大學(xué)生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

大豆中含有豐富的蛋白質(zhì)、異黃酮、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)素，其中包括人體必需的氨基酸、脂肪酸以及低聚糖益生元，是人類主要的植物蛋白來源之一[1]。豆乳是大豆經(jīng)加工制成的飲料，因其具有獨(dú)特的風(fēng)味、豐富的營養(yǎng)物質(zhì)而深受消費(fèi)者青睞。豆乳中富含大豆異黃酮，已發(fā)現(xiàn)的大豆異黃酮有12 種，其中3 種為游離型苷元形式（2%～3%），生物活性及生物利用度較高，如大豆苷元、染料木素、黃豆素等，剩余為結(jié)合型糖苷形式（97%～98%），生物利用度極低，大豆異黃酮的形態(tài)結(jié)構(gòu)是決定其生理活性和生物利用度的關(guān)鍵因素[2-4]。此外，豆乳中常伴有豆腥味，主要是由于大豆在粉碎時(shí)脂肪氧化酶被激活，多不飽和脂肪酸被氧化生成氫過氧化物，再降解成多種低分子的醇、醛和呋喃類等揮發(fā)性物質(zhì)，這些物質(zhì)通常帶有不同程度的異味，從而導(dǎo)致豆腥味的形成[5]。豆腥味往往是導(dǎo)致豆乳不良風(fēng)味的主要因素[6]。

乳酸菌是可以代謝糖類產(chǎn)生乳酸的一類益生菌。乳酸菌發(fā)酵食品歷史悠久，但主要以乳制品為主。近年來，越來越多的關(guān)注集中于以植物原料為基質(zhì)的乳酸菌發(fā)酵。乳酸菌發(fā)酵既能改善植物基飲料的風(fēng)味，提高營養(yǎng)價(jià)值，也能延長貨架期，增強(qiáng)保健作用[7]。由于兼具植物原料高纖維素特點(diǎn)和乳酸菌的益生特性，迎合消費(fèi)者的健康需求，乳酸菌發(fā)酵成為植物型原料加工領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。菌種是影響發(fā)酵食品的重要因素，而對于豆乳原料，不同乳酸菌的生長性能、代謝特性和酶活性對發(fā)酵豆乳的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味特性和營養(yǎng)特性影響巨大。目前，Yang Yang等[8]發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵可有效降低豆乳中主要豆腥味物質(zhì)正己醛、庚醛、1-辛烯-3-醇和2-戊基呋喃等的含量。

在豆乳中，大豆異黃酮是重要的生物活性物質(zhì)，已有研究發(fā)現(xiàn)其生物轉(zhuǎn)化可以在多種酶催化下進(jìn)行，其中β-葡萄糖苷酶普遍被乳酸菌表達(dá)，是這類黃酮糖苷轉(zhuǎn)化的主要催化酶[9-11]。研究表明產(chǎn)β-葡萄糖苷酶乳桿菌、雙歧桿菌等能夠水解豆乳中的大豆異黃酮糖苷，轉(zhuǎn)化為高活性苷元[12]。β-葡萄糖苷酶可通過去糖基化過程參與黃酮糖類化合物的水解，破壞其與碳水化合物之間的鍵，將糖苷類黃酮轉(zhuǎn)化為較高活性的苷元形式，這種轉(zhuǎn)化利于提高基質(zhì)的黃酮類物質(zhì)含量和功能特性[13]。然而，不同乳酸菌的酶活性存在差異，而不同菌株表達(dá)的β-葡萄糖苷酶對大豆苷、黃豆苷、染料木苷的底物偏好性仍然缺乏相關(guān)研究。

因此，本研究以豆乳為發(fā)酵基質(zhì)，對比不同β-糖苷酶活性的乳酸菌發(fā)酵對豆乳總酚、總黃酮、大豆異黃酮含量和抗氧化活性的影響，并結(jié)合活菌數(shù)、有機(jī)酸、風(fēng)味物質(zhì)組成、感官等指標(biāo)篩選出最適宜豆乳發(fā)酵的乳酸菌，旨在開發(fā)針對豆乳原料發(fā)酵的適宜菌株，為工業(yè)生產(chǎn)兼具營養(yǎng)功能和風(fēng)味特性的益生菌發(fā)酵豆乳飲品提供理論依據(jù)。同時(shí)，本研究菌株酶活性評價(jià)、豆乳發(fā)酵性能分析和特征成分解析為類似植物性原料的生物加工工藝開發(fā)提供可借鑒的流程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆購自無錫當(dāng)?shù)爻校恢参锶闂U菌（Lactobacillus plantrum，LPL043、LPL013、LPL042、LPL044、L P L 051、L P L 241、L P L 121）、瑞士乳桿菌（L.helveticus，LHE027）、戊糖乳桿菌（L.pentosus，LPE029）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，STH041）由實(shí)驗(yàn)室前期自不同食品中分離篩選得到，以上所有菌株均通過16S rRNA序列測序并在NCBI比對后鑒定得出分類學(xué)信息。

草酸、酒石酸、奎寧酸、丙酮酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品 北京索萊寶科技有限公司；大豆苷、大豆苷元、黃豆苷、黃豆素、染料木苷、染料木素標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜級）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-8000紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司；數(shù)字pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司；2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；GC 7890B-MSD 5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將甘油管中的菌株接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)18～20 h，將活化3 次后的菌懸液5000×g、4 ℃離心10 min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3 次后制備菌懸液，用于接種發(fā)酵。

1.3.2 豆乳發(fā)酵

豆乳制備：洗豆（浸泡，干豆∶水=1∶3）、打豆?jié){（濕豆∶水=1∶8）、混合（豆?jié){∶蔗糖=100∶5）、高壓均質(zhì)（20 MPa，3 min）、滅菌（65 ℃，30 min），得到全豆乳（蛋白質(zhì)2.8 g/100 mL、脂肪1.8 g/100 mL、碳水化合物0.6 g/100 mL）。

接種發(fā)酵：將制備好的菌懸液按2%接種量接種于豆乳中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，得到發(fā)酵豆乳。以相同條件下未接種發(fā)酵的豆乳為對照。

1.3.3β-葡萄糖苷酶活性測定

根據(jù)Cheng Jingrong[14]和覃超[15]等的方法對反應(yīng)體系稍作修改。將0.1 mL酶溶液、0.9 mL 5 mmol/L對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-Dglucopyranoside，p-NPG）溶液和1 mL 50 mmol/L pH 4.8檸檬酸鈉緩沖液混合后，37 ℃孵育10 min，再加入1 mL 1 mmol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測定410 nm波長處的吸光度，并以加熱失去活性的酶液（100 ℃、30 min）作為空白對照。以對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活性定義為每毫升粗酶液在37 ℃、pH 4.8條件下每分鐘分解p-NPG產(chǎn)生1 μmolp-NP的活力。

1.3.4 發(fā)酵性能的測定

使用紫外-可見分光光度計(jì)測定活化后菌株的生物量（OD600nm）；采用平板稀釋涂布法測定發(fā)酵終點(diǎn)處的活菌數(shù)；使用pH計(jì)測定發(fā)酵終點(diǎn)處的pH值；參考Markkinen等[16]的方法測定發(fā)酵終點(diǎn)處的總酸含量；參考尹雪林等[17]的方法測定發(fā)酵終點(diǎn)處的還原糖含量；根據(jù)解寒等[18]的方法進(jìn)行測定發(fā)酵終點(diǎn)處的有機(jī)酸含量。

1.3.5 總酚和總黃酮的測定

參考Kwaw等[19]方法測定豆乳發(fā)酵結(jié)束后的總酚含量。將樣品10000 r/min離心10 min，取0.2 mL上清液加入到1 mL 10%福林-酚試劑中，再加入1 mL 7.5% Na2CO3溶液。避光反應(yīng)30 min后測定765 nm波長處吸光度。以沒食子酸當(dāng)量（mg/mL）表示總酚含量。

參考Wang Zining等[20]方法測定豆乳發(fā)酵結(jié)束后的總黃酮含量。將樣品10000 r/min離心10 min，取0.15 mL 5% NaNO2溶液與0.5 mL樣品上清液混合反應(yīng)6 min，然后加入0.15 mL 10%硝酸鋁溶液并反應(yīng)6 min，再向混合物中添加2 mL 4% NaOH溶液，振蕩混勻3 min后測定508 nm波長處吸光度，以蘆丁當(dāng)量（mg/mL）表示總黃酮含量。

1.3.6 大豆異黃酮含量測定

取豆乳10 mL于50 mL容量瓶中，用80%甲醇溶液定容，超聲萃取40 min，10000 r/min離心10 min，收集上清液。重復(fù)萃取3 次后合并上清液，于35 ℃真空旋干，用80%甲醇溶液定容至2 mL，過0.45 μm濾膜后備用。高效液相色譜條件參照周帆[21]的條件設(shè)定。

1.3.7 抗氧化性的測定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性測定：將樣品5000 r/min離心10 min后，取0.5 mL樣品添加到1 mL DPPH自由基溶液中，充分混合后避光反應(yīng)30 min后在517 nm波長處測定樣品吸光度，結(jié)果表示為DPPH自由基清除率[19]。按下式計(jì)算：

式中：A樣品、A空白分別為樣品、空白對照組反應(yīng)后的吸光度。

2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除活性測定：將樣品5000 r/min離心10 min后，取0.4 mL樣品和1.6 mL ABTS陽離子自由基溶液充分混合，避光反應(yīng)6 min后在734 nm波長處測定吸光度，結(jié)果表示為ABTS陽離子自由基清除率[15]。計(jì)算公式同上式。

1.3.8 揮發(fā)性物質(zhì)檢測

使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析揮發(fā)性化合物。根據(jù)張佳等[22]方法對氣相色譜-質(zhì)譜條件稍作改進(jìn)。使用C-WR-95/PDMS/10萃取頭在50 ℃平衡5 min，然后350 r/min萃取40 min，最后在250 ℃進(jìn)樣口解吸附5 min完成進(jìn)樣。

色譜條件：DB-WAX毛細(xì)管柱，柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，液膜厚度0.5 μm；He流量1.0 mL/min；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持3 min；以6 ℃/min升溫至100 ℃；再以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持7 min；不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：離子源為電子電離源，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍m/z33～350 u。

樣品預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取3 g豆乳于進(jìn)樣瓶中，加入2 g NaCl，并向其中加入10 μL質(zhì)量濃度為10 mg/L的2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)，搖勻后放入自動進(jìn)樣器中等待進(jìn)樣。

1.3.9 感官評價(jià)

在感官分析實(shí)驗(yàn)室根據(jù)GB/T 16291.1—2012《感官分析 選拔、培訓(xùn)與管理評價(jià)員一般導(dǎo)則 第1部分∶優(yōu)選評價(jià)員》[23]的方法進(jìn)行感官人員篩選和訓(xùn)練，選出8 名合格的人員組成感官評價(jià)小組。參考Zhang Wentao等[24]方法，在感官評價(jià)之前，評價(jià)員根據(jù)原豆乳和發(fā)酵豆乳提供描述詞匯表，如表1所示，然后對該小組進(jìn)行相同樣本的訓(xùn)練。評價(jià)時(shí)對樣品按表1各指標(biāo)進(jìn)行1～10 分打分，每個(gè)樣本重復(fù)3 次。

表1 發(fā)酵豆乳感官描述詞匯Table 1 Sensory description vocabulary of fermented soymilk

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，采用Graphpad Prism 8進(jìn)行顯著性分析和圖表繪制，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中的性能評價(jià)

乳酸菌可以利用糖類物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸等多種有機(jī)酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，改善植物基質(zhì)食品的風(fēng)味，同時(shí)乳酸菌所產(chǎn)生的酶系有助于植物基質(zhì)中生物活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高產(chǎn)品的益生功能[18,25-26]。課題組前期從不同食品來源中分離篩選得到多種乳桿菌，優(yōu)選了10 株性能較好的乳桿菌進(jìn)行后續(xù)研究，在MRS培養(yǎng)基中的發(fā)酵性能見圖1。10 株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中生長20 h后OD600nm均可達(dá)到7.00以上，生長狀況較好，其中LPL051的生長性能最佳，其OD600nm可高達(dá)9.94，而STH041生長量相對較低，其OD600nm為7.33；并且在所有測試菌株中植物乳桿菌普遍擁有相對較高的生長量。隨著菌體的生長繁殖，還原糖被利用有機(jī)酸被積累，pH值下降。10 株測試菌株在MRS培養(yǎng)基中生長20 h后還原糖消耗量均在9.0 g/L以上，總酸均在1.0 g/100 mL以上，pH值均下降至4.0以下，其中LHE027對還原糖消耗量較低為9.43 g/L，產(chǎn)酸也較低為1.20 g/100 mL，其余菌株均無顯著差異。

圖1 不同乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中的性能評價(jià)Fig.1 Growth and fermentation performance of different LAB strains cultured in MRS broth

乳酸菌含有的β-葡萄糖苷酶可以水解大豆異黃酮的糖苷結(jié)構(gòu)向生物活性更高的苷元結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，從而提高大豆異黃酮的生物利用度[27]。因此本研究也同時(shí)評價(jià)了10 株測試菌株在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h后的β-葡萄糖苷酶活性，如圖1D所示，所有測試菌株均表現(xiàn)出β-葡萄糖苷酶活性且表現(xiàn)出菌株的差異性，測試菌株的酶活在0.20～0.35 U/mL之間，其中以LPL051酶活性最高為0.33 U/mL，而單位菌體酶活性以LHE027最高為0.039 U/mL；測試菌株的β-葡萄糖苷酶活性與菌株生長量在一定程度上表現(xiàn)出正相關(guān)。

2.2 不同乳酸菌在豆乳中的發(fā)酵性能評價(jià)

2.2.1 發(fā)酵豆乳中的活菌數(shù)

乳酸菌在發(fā)酵食品中的活菌數(shù)受植物基質(zhì)成分影響很大。因此，對發(fā)酵豆乳中的乳酸活菌數(shù)進(jìn)行了評估，以確定豆乳在開發(fā)具有功能特性的益生菌飲料中的適用性。如圖2A所示，豆乳發(fā)酵24 h后乳酸菌活菌數(shù)均增加至7.3～8.5（lg（CFU/mL）），且不同菌株間表現(xiàn)出明顯差異，其中LPL121發(fā)酵豆乳活菌數(shù)最高為8.48（lg（CFU/mL）），LPE029活菌數(shù)最低為7.32（lg（CFU/mL））。這說明測試的乳酸菌可利用豆乳基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行增殖，并在發(fā)酵結(jié)束后保持較高的活菌數(shù)。

圖2 不同乳酸菌在豆乳中的發(fā)酵性能評價(jià)Fig.2 Fermentation performance of different LAB strains in soymilk

2.2.2 不同乳酸菌發(fā)酵對豆乳的總酸、pH值和還原糖的影響

總酸、pH值和還原糖是表征菌株生長和發(fā)酵程度的重要指標(biāo)。由圖2B可知，發(fā)酵豆乳的pH值顯著下降，這是由于發(fā)酵過程中產(chǎn)生有機(jī)酸，例如乳酸、乙酸，導(dǎo)致pH值下降。不同乳酸菌發(fā)酵豆乳的總酸含量與pH值呈相反趨勢，即發(fā)酵后總酸含量顯著增加（P＜0.05），由0.12 g/100 mL增加至0.40～0.52 g/100 mL，其中含量最高的為LPL121發(fā)酵豆乳，達(dá)到0.52 g/100 mL。由圖2C可知，不同乳酸菌發(fā)酵豆乳的還原糖含量均顯著下降，由0.56 g/L下降至0.40～0.25 g/L。其下降是因?yàn)槿樗峋枚谷橹械奶穷愡M(jìn)行生長和發(fā)酵。這表明乳酸菌利用豆乳中的糖分生長并產(chǎn)生有機(jī)酸，且菌株對豆乳基質(zhì)具有良好的適應(yīng)性。

2.2.3 不同乳酸菌發(fā)酵對豆乳的有機(jī)酸含量的影響

有機(jī)酸可以促進(jìn)消化、軟化血管，也會影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性、感官品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)等[28-29]。原料特性和乳酸菌的代謝特性共同決定了發(fā)酵豆乳中的有機(jī)酸組成。因此進(jìn)一步測定乳酸菌發(fā)酵豆乳前后有機(jī)酸的組成。如圖2D所示，原豆乳中主要有機(jī)酸是檸檬酸（0.46 g/L）和琥珀酸（0.12 g/L）。相比于發(fā)酵前，發(fā)酵后產(chǎn)生了大量乳酸（3.47～4.58 g/L），此外，草酸、琥珀酸含量均顯著增加（P＜0.05）。各菌株都有一定量的乙酸（0.39～0.59 g/L）積累，表明這些菌株除了通過糖酵解途徑生成丙酮酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為乳酸以外，也存在依賴于HMP途徑的異型乳酸發(fā)酵途徑。而檸檬酸含量降低了33.91%～49.79%。乳酸菌可以用其不完全的三羧酸循環(huán)利用檸檬酸產(chǎn)生能量和生長。這一現(xiàn)象在其他植物型原料的發(fā)酵中也有一致結(jié)果[18]。除LHE027發(fā)酵豆乳外，丙酮酸含量也均有所增加，而豆乳發(fā)酵前后奎寧酸、蘋果酸和莽草酸的變化趨勢在各菌株間并不一致，體現(xiàn)出菌株水平的代謝性能差異。相比于原豆乳，發(fā)酵使總有機(jī)酸質(zhì)量濃度增加了3.94 g/L以上，其中LPL121積累的有機(jī)酸最多。

2.3 不同乳酸菌發(fā)酵對豆乳總酚、總黃酮及體外抗氧化性的影響

多酚和黃酮是一類對人體健康能產(chǎn)生積極影響的植物化學(xué)物質(zhì)，研究表明其具有抗炎、抗氧化和降血糖等作用[30-31]，因此總酚和總黃酮含量也是植物基食品的一個(gè)重要特征。不同乳酸菌發(fā)酵豆乳的總酚、總黃酮變化如圖3A所示，相比于發(fā)酵前，發(fā)酵使豆乳總酚含量顯著增加77.47（10.38%）～287.84 mg/L（38.55%），其中以LPL044最高，為1034.33 mg/L；除LPE029發(fā)酵豆乳外，其余樣品中總黃酮含量均顯著增加（2.80%～52.57%），這與周帆[21]研究結(jié)果一致。乳酸菌發(fā)酵后總酚含量的增加可能是由于乳酸菌產(chǎn)生的酶可以破壞酚類與其他取代基之間的鍵合作用，從而從植物細(xì)胞壁中釋放可溶性共軛或不溶性結(jié)合酚類化合物，而總黃酮增加可能是由于復(fù)雜的多酚在發(fā)酵過程中被乳酸菌產(chǎn)生的酶分解為簡單的黃酮醇化合物[15]。

圖3 不同乳酸菌發(fā)酵對豆乳植物化學(xué)成分和抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of fermentation by different LAB strains on the phytochemical composition and antioxidant activity of soymilk

如圖3B所示，除STH041外，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的豆乳DPPH自由基清除率，均顯著升高（增加了3.32%～27.50%）；除LPL043發(fā)酵未對ABTS陽離子自由基清除活性產(chǎn)生影響外，其余經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的豆乳ABTS陽離子自由基清除率均顯著上升（增加了7.04%～23.54%）。乳酸菌發(fā)酵對抗氧化力的改善與唐宇[4]結(jié)果一致，研究表明大豆中總酚、黃酮是發(fā)揮抗氧化活性的主要成分[32]。因此本研究中總多酚和總黃酮含量的增加，利于豆乳抗氧化能力的增強(qiáng)。

2.4 發(fā)酵豆乳的大豆異黃酮含量變化

大豆異黃酮類物質(zhì)中主要包括大豆苷、黃豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆素和染料木素等活性成分[32]。通過益生菌發(fā)酵可將大豆中糖苷形式的大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元形式的大豆異黃酮，可極大增加其消化吸收率[2]。如圖3C所示，原豆乳中主要含大豆苷、黃豆苷和染料木苷，質(zhì)量濃度分別為 69.86、2.61、105.02 mg/L，相應(yīng)苷元形式的大豆異黃酮含量較少，分別為3.82、0.15、5.21 mg/L，這與李潔等[27]研究結(jié)果一致。豆乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后3 種糖苷型大豆異黃酮含量均有不同程度下降，苷元型大豆異黃酮含量均顯著升高。其中LPL043發(fā)酵豆乳中的大豆苷和染料木苷下降最為明顯，分別下降了25.61%和22.48%，而黃豆苷則以LPL013發(fā)酵豆乳中下降最多，為76.70%；大豆苷元質(zhì)量濃度增加至5.65～17.61 mg/L，黃豆素質(zhì)量濃度增加至0.21～0.32 m g/L，染料木素質(zhì)量濃度增加至9.76～28.70 mg/L。

各菌株發(fā)酵豆乳在上述黃酮苷和苷元的含量上存在一定差異，體現(xiàn)了不同來源的菌株對底物存在一定的偏好性。其中LPL042對黃豆苷具有更高的轉(zhuǎn)化選擇性；而前期β-葡萄糖苷酶活性最高的LPL044和LPL051對大豆苷和染料木苷轉(zhuǎn)化具有高的轉(zhuǎn)化選擇性；LPL241則對各底物都具有相對較好的轉(zhuǎn)化效率，普適性較強(qiáng)。

2.5 發(fā)酵豆乳的揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

乳酸菌發(fā)酵豆乳過程中糖類、氨基酸、脂肪酸、維生素、醛、酮等物質(zhì)經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化可產(chǎn)生大量揮發(fā)性氣味物質(zhì)，從而賦予發(fā)酵豆乳新的風(fēng)味[33]。如圖4A所示，在原豆乳和乳酸菌發(fā)酵豆乳中共檢出66 種揮發(fā)性化合物，醇類22 種、酸類7 種、酯類4 種、酮類9 種、醛類15 種、呋喃類4 種、酚類4 種、硫化物1 種。

圖4 不同乳酸菌發(fā)酵對豆乳揮發(fā)性成分的影響Fig.4 Effect of fermentation by different LAB strains on volatile components of soymilk

將原豆乳與不同菌種乳酸菌發(fā)酵豆乳樣品中的所有揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），如圖4B所示，原豆乳和發(fā)酵豆乳的揮發(fā)性物質(zhì)組成具有明顯差異，STH041、LPL051、LPL241、LPL043、LPL044和LPE029發(fā)酵豆乳揮發(fā)性物質(zhì)組成相近，與LPL013、LPL121、LPL042、LHE027間均存在顯著差異。如圖4C所示，原豆乳中的揮發(fā)性物質(zhì)主要為醇類、酯類和醛類，豆乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后揮發(fā)性物質(zhì)總含量均顯著增加，醇類、酸類和酮類含量增加，醛類和酯類因菌株的代謝差異呈現(xiàn)不同的變化趨勢，LPL013、LPL042、LHE027發(fā)酵豆乳中的醛類物質(zhì)略有增加，其余菌株發(fā)酵的豆乳中均顯著降低。

在新產(chǎn)生或含量增加的醇類物質(zhì)中，正己醇具有淡嫩葉香氣，1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香氣，正庚醇具有油脂氣息，異戊醇具有蘋果白蘭地香氣、苯甲醇略帶香氣、苯乙醇具有清甜的玫瑰香，這些醇類賦予乳酸菌發(fā)酵豆乳鮮香醇厚的特征香氣。在乳酸菌進(jìn)行糖、氨基酸、甲基酮等的物質(zhì)代謝時(shí)，可由相應(yīng)的醛通過脫氫酶還原形成某些醇[34]。乳酸菌發(fā)酵使酸類物質(zhì)總量增加，增加的主要為乙酸和正己酸。乙酸由乳酸菌異型乳酸發(fā)酵途徑產(chǎn)生[18]，正己酸可由乳酸菌經(jīng)乙酸多步碳鏈延伸反應(yīng)合成[35]，但其閾值很高，分別為22000 μg/L和2517 μg/L，對發(fā)酵豆乳整體香氣貢獻(xiàn)不大。酮類是氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，而乳酸菌的加入促進(jìn)了氧化反應(yīng)發(fā)生。在新產(chǎn)生或含量增大的酮類物質(zhì)中，2-庚酮有類似梨的水果香味，3-羥基-2-丁酮呈奶油和脂肪香氣，2-壬酮呈水果、花、油脂和藥草似香氣，它們均僅出現(xiàn)在發(fā)酵豆乳中，是發(fā)酵特征香氣物質(zhì)。豆乳中的醛類在乳酸菌發(fā)酵后可能被還原成醇或氧化為酸[36]。正己醛和壬醛與豆腥味特征具有正相關(guān)關(guān)系，而它們均在發(fā)酵后均顯著降低；苯甲醛、2,4-癸二烯醛、反式-2-己烯醛、反式-2-辛烯醛則對豆?jié){的特有風(fēng)味有香氣貢獻(xiàn)。3-羥基-2-丁酮具有奶油香氣，增加了發(fā)酵豆乳醇香的特征。

對比各菌株，LPL013和LPL121的風(fēng)味化合物結(jié)構(gòu)與其他乳酸菌差異較大（如乙醇、正庚醇、甲酸辛酯、2-壬酮、2-戊酮、苯甲醛），PCA結(jié)果也體現(xiàn)出這兩株菌發(fā)酵的樣品與大多數(shù)樣品的差異較大。上述結(jié)果體現(xiàn)了風(fēng)味化合物組成也同樣具有一定的菌株特異性。

2.6 發(fā)酵豆乳的感官評價(jià)

本研究從外觀、香氣、滋味、口感以及整體愉悅度5 個(gè)方面評價(jià)豆乳經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵前后的感官特性。如圖5所示，在外觀上，豆乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后整體發(fā)生顯著變化，發(fā)酵豆乳顏色除LPL044和LPL051外，均比原豆乳略黃一些，光澤感較發(fā)酵前好；發(fā)酵后乳清均有不同程度的析出，其中LPL044和LPL051發(fā)酵豆乳較其他樣品而言乳清析出最少，同時(shí)也表現(xiàn)出較好的均勻性；豆乳發(fā)酵后黏稠性顯著增加，其中LPL044、LPL051和LPE029發(fā)酵豆乳表現(xiàn)出較高的黏稠性。在香氣和滋味上，發(fā)酵豆乳較原豆乳整體上增加了酸味、發(fā)酵味和奶香，降低了甜味和豆腥味，個(gè)別樣品則因菌株的發(fā)酵特性表現(xiàn)出餿味、苦味和黃油味。其中LPL044和LPL051發(fā)酵豆乳的豆香味保留度最高，這與豆乳特征香氣物質(zhì)2,4-癸二烯醛、反式-2-己烯醛、反式-2-辛烯醛等的含量顯著增加相關(guān)；LPL013和LPL121發(fā)酵豆乳表現(xiàn)出最強(qiáng)的酸味和最低的甜味，與上述的糖耗和產(chǎn)酸結(jié)果較一致；LPL042、LPL044、LPL051、STH041和LPL241發(fā)酵豆乳均有淡淡的奶香，這是因?yàn)槿樗峋l(fā)酵后產(chǎn)生了奶香味物質(zhì)3-羥基-2-丁酮；除LHE027、LPL013和LPL042外，其余發(fā)酵豆乳樣品幾乎沒有豆腥味，這與發(fā)酵豆乳中豆腥味物質(zhì)正己醛、壬醛和2-戊基呋喃的含量顯著降低相關(guān)。在口感方面，發(fā)酵顯著增加了豆乳的醇厚感，帶來了少量的刺激感和澀的口感，其中LPL044和LPL051醇厚感較強(qiáng)，細(xì)膩度最好柔和度較好，刺激感較弱且無澀味。研究表明，β-葡萄糖苷酶有利于香氣前體物質(zhì)的釋放，促進(jìn)其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為香氣活性物質(zhì)，賦予食品更高的感官香氣質(zhì)量[37]。LPL044和LPL051表現(xiàn)出最高的β-葡萄糖苷酶活性，發(fā)酵的豆乳具有更高的香氣質(zhì)量，滋味協(xié)調(diào)，口感醇厚細(xì)膩，和其他樣品區(qū)分明顯，表現(xiàn)出最高的整體愉悅度（表2）?？傮w來說，乳酸菌發(fā)酵在一定程度上改善了豆乳的外觀、香氣、滋味和口感，保留了豆香味的同時(shí)有效降低了豆腥味，并產(chǎn)生了獨(dú)特的發(fā)酵風(fēng)味，使產(chǎn)品更受人們喜愛，且高β-葡萄糖苷酶活性的乳酸菌更有利于提高發(fā)酵豆乳的品質(zhì)。

圖5 不同乳酸菌發(fā)酵豆乳的感官評分Fig.5 Sensory evaluation of soymilk fermented by different LAB strains

表2 不同乳酸菌發(fā)酵豆乳的感官整體愉悅度Table 2 verall sensor pleasure of soymilk fermented by different LAB strains

3 結(jié)論

所有測試菌株發(fā)酵豆乳后活菌數(shù)均增加至7.3（lg（CFU/mL）），其中以植物乳桿菌活菌數(shù)普遍較高，表明豆乳是適宜乳酸菌生長的基質(zhì)。乳酸菌發(fā)酵不僅顯著積累了乳酸、乙酸等有機(jī)酸，還較原豆乳產(chǎn)生含量和種類更多的揮發(fā)性物質(zhì)。保留了豆香味物質(zhì)、增加了具有奶油香氣特征的3-羥基-2-丁酮，同時(shí)大多數(shù)菌株發(fā)酵后降低了豆腥味物質(zhì)正己醛、壬醛和2-戊基呋喃的含量。感官評價(jià)結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵顯著改變了豆乳的外觀、香氣、滋味和口感，LPL044的總體感官品質(zhì)最好，LPL051次之。β-葡萄糖苷酶活性較高的乳酸菌發(fā)酵后總酚和總黃酮含量相應(yīng)增加，大豆異黃酮糖苷相應(yīng)減少而對應(yīng)的苷元增加，抗氧化活性也因此提高。不同黃酮糖苷轉(zhuǎn)化程度的差異，也體現(xiàn)了黃酮糖苷水解能力方面的菌株特異性，并且不同來源菌株也存在一定的底物偏好性。LPL044和LPL051具有較高的β-葡萄糖苷酶活性，發(fā)酵豆乳具有較高的總酚總黃酮含量、較高的異黃酮轉(zhuǎn)化能力以及較高的抗氧化活性，具有更大的研究和開發(fā)價(jià)值。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)的酶活性、代謝物積累、揮發(fā)性成分結(jié)構(gòu)等方面的菌株差異，也為相關(guān)原料的生物加工菌株開發(fā)提供可借鑒思路。