劉柘君，劉振權(quán)，孫文燕

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029）

益生菌是指一類(lèi)對(duì)人體有益處的微生物有機(jī)體，通常在人體腸道黏膜中定植，發(fā)揮維持腸道生態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等重要作用[1]。隨著研究不斷深入，益生菌用于消化系統(tǒng)腫瘤患者和手術(shù)患者預(yù)后的輔助用藥[2]。中醫(yī)學(xué)者則通常立足于臟象氣血理論，認(rèn)為人體“正氣存內(nèi)，邪不可干”，此處的“正氣”即機(jī)體抵御病邪的能力，即西醫(yī)中的免疫力一詞，治法多著眼于扶正祛邪、補(bǔ)中益氣[3]。本研究根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中有關(guān)增強(qiáng)免疫力的檢測(cè)方法，研究復(fù)方益生菌粉增強(qiáng)小鼠免疫力的效果。

1 材料與方法

1.1 受試材料

鼠李糖乳桿菌R9639（活菌數(shù)2000億CFU/g）、干酪乳桿菌Zhang（活菌數(shù)2000億CFU/g）及植物乳桿菌P9（活菌數(shù)2000億CFU/g）（北京科拓恒通），按照質(zhì)量比4:2:4比例混合。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及給藥

SPF級(jí)ICR雌性小鼠200只，體重18～22 g（北京維通利華），適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為A、B、C、D和E 5個(gè)大組，每大組再隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、低、中、高劑量組各10只，具體分組及各組實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物分組

用純凈水配制濃度為0.21，0.42，1.25 mg/(kg·d)復(fù)方益生菌粉，對(duì)低、中、高3個(gè)劑量組小鼠進(jìn)行灌胃，陰性對(duì)照組灌胃給予同等體積純凈水。每日給藥1次，連續(xù)灌胃30 d后各組對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 主要試劑和儀器

RPMI1640培養(yǎng)基（批號(hào)：SH30809.01，Hyclone）；四季青胎牛血清（批號(hào)：11011-8611，浙江天杭）；CCK8試劑盒（批號(hào)：CA1210，北京百瑞極）；刀豆蛋白A （Con A，批號(hào)：C8110），Hank’s液，瓊脂糖（批號(hào)：A8530），臺(tái)盼藍(lán)染色液（批號(hào)：C0040-50），Giemsa染液（批號(hào)：G1015）（北京索萊寶），NP40（批號(hào)：N8030）；綿羊紅細(xì)胞（SRBC，批號(hào)：HQ80073），雞紅細(xì)胞（批號(hào)：HQ80071）（鴻泉生物）；文奇氏試劑（批號(hào)：H1025，上海源葉）；乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：A020-2，南京建成生物工程研究所）。

CO2培養(yǎng)箱（松下健康醫(yī)療器械）；96孔板（美國(guó)康寧costar）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）；油鏡（日本OLYMPUS）；低速離心機(jī)（北京北利時(shí)代）；酶標(biāo)儀（BIO-TEK）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠體重差值及臟器/體重比 取小鼠胸腺和脾臟稱(chēng)重，計(jì)算小鼠體重、胸腺/體重比值及脾臟/體重比值。

1.4.2 小鼠體液免疫功能影響

1.4.2.1 血清溶血素半數(shù)溶血值（HC50）測(cè)定 于第31天對(duì)B組小鼠腹腔注射0.2 ml 的2 %（V/V）SRBC，并于注射后第4 d摘眼球取血，置入離心管，離心1 h后收取上層血清。將血清稀釋300倍后取50 μl置于96孔板，依次加入25 μl 10 %（V/V）SRBC和50 μl已制備好的補(bǔ)體，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱30 min后終止反應(yīng)并再次離心取0.05 ml上清，加文奇氏試劑0.15 ml作為樣品。同時(shí)設(shè)半數(shù)溶血孔，取12.5 μl 10 %（V/V）SRBC，加文奇氏試劑至0.2 ml，各組試劑充分混合，放置10 min后，于540 nm下測(cè)定各孔A值。溶血素具體數(shù)值以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按式（1）計(jì)算。

1.4.2.2 抗體生成細(xì)胞檢測(cè) 將1 ml 壓積SRBC加至5 ml空白小鼠血清中，于4 ℃冰箱放置30 min，離心取上清，-70 ℃保存作為補(bǔ)體待用。并于第31天對(duì)B組小鼠腹腔注射0.2 ml 的2 %（V/V）SRBC，注射后第4天處死各組小鼠并取出脾臟于Hank’s液中保存，磨碎脾臟篩網(wǎng)過(guò)濾并離心制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個(gè)/ml，待用。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后置于45 ℃水浴保溫，與等體積 2倍濃度的Hank’s液混勻后，以每管0.5 ml的容量分裝于試管中，再加入50 μl的10 %（V/V）SRBC和20 μl脾細(xì)胞懸液，迅速混合，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻璃片上，待瓊脂糖凝固，將玻片水平扣放在片架上放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h，再加入已制備好補(bǔ)體，置于玻片凹槽內(nèi)，培養(yǎng)1.5 h后，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.4.3 小鼠細(xì)胞免疫功能影響

1.4.3.1 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）測(cè)定 于第31天對(duì)A組每只小鼠腹腔注射0.2 ml 的2 %（V/V）SRBC，經(jīng)4 d免疫后，精確測(cè)量小鼠的左后足趾厚度，并在測(cè)量部位皮下注射20 μl 20 %（V/V）SRBC再次致敏，經(jīng)24 h再次免疫后，觀(guān)察并再次測(cè)量小鼠的左后足趾厚度，計(jì)算首次致敏后和再次致敏后小鼠左后足趾厚度的差值，即通過(guò)足趾腫脹度表征DTH的程度。

1.4.3.2 ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 于第31天對(duì)C組小鼠處死后浸于75 %乙醇中滅菌10 min，并在無(wú)菌條件下取出脾臟，制備無(wú)菌脾細(xì)胞懸液并用RPMI1640不完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml，按照CCK8法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖情況，將脾細(xì)胞分兩孔加入培養(yǎng)板，每孔200 μl，一孔加入15 μl ConA液，另一孔對(duì)照，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔吸取上清0.7 ml，加入100 μl不含牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基和10 μl CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，結(jié)束時(shí)加入1 ml酸性異丙醇，混勻后于450 nm下測(cè)定A值，計(jì)算加入ConA和未加入ConA各孔的A差值，按式（2）計(jì)算。

1.4.4 小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能影響

1.4.4.1 碳廓清實(shí)驗(yàn) 取稀釋后濃度為10 ml/kg印度墨汁，于第31天尾靜脈注射E組小鼠，注射后開(kāi)始計(jì)時(shí)，于注射后第2 min和第10 min分別眼眶取血20 μl，并分別與2 ml 0.1 % Na2CO3溶液混合均勻。于600 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值（A），稱(chēng)量小鼠肝重及脾重，并按式（3）（4）計(jì)算吞噬指數(shù)α。式中：K代表廓清指數(shù)；α代表吞噬指數(shù)。

1.4.4.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn) 于第31天將D組小鼠腹腔注射20 % SRBC 1 ml，并于0.5 h后處死小鼠并使其呈仰臥位，注射生理鹽水洗液2 ml至小鼠腹腔，按揉腹部1 min后吸出生理鹽水洗液1 ml，分別均勻的滴于2片載玻片上，移至37 ℃孵箱中孵育30 min。然后用生理鹽水漂洗載玻片后干燥。在甲醇溶液中固定1 min后，用4 %的Giemsa進(jìn)行染色3 min，用蒸餾水漂洗晾干。通過(guò)40×顯微鏡觀(guān)察巨噬細(xì)胞的形態(tài)并計(jì)數(shù)，按式（5）（6）進(jìn)行計(jì)算。

1.4.5 NK細(xì)胞活性

1.4.5.1 乳酸脫氫法（LDH）測(cè)定NK細(xì)胞活性 于第30天將靶細(xì)胞YAC-1傳代培養(yǎng)并調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/ml，并于第31天對(duì)C組小鼠處死后置于75 %乙醇中滅菌后無(wú)菌取脾鑷子磨碎后篩網(wǎng)過(guò)濾、離心棄上清液，向細(xì)胞漿中加入0.5 ml滅菌水20 s，再加入Hank’s液清洗3次并離心，用1 ml含小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，測(cè)定活細(xì)胞數(shù)量為95 %以上后，用RPMI1640 完全培養(yǎng)基制成脾的單細(xì)胞懸液作為效應(yīng)細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml，靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞比例約為50:1。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞溶液各50 μl，加入U(xiǎn)型96孔板中，其中靶細(xì)胞自然釋放孔中分別加入靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μl，靶細(xì)胞最大釋放孔分別加靶細(xì)胞和1 % NP40各100 μl，均設(shè)3個(gè)平行孔，37 ℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，離心5 min，吸取上清100 μl鋪于新的96孔板中，加入LDH基質(zhì)液100 μl，室溫反應(yīng)10 min后，加入鹽酸溶液（1 mol/L）30 μl終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定A值。按式（7）進(jìn)行計(jì)算。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件對(duì)以上符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)資料進(jìn)行單因素方差分析和組間LSD檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)資料不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重差值及臟器/體重比

小鼠體重差值及臟器/體重比 結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好，體重隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)而增加，各劑量組與陰性對(duì)照組比較顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由圖1可見(jiàn)，各劑量組小鼠胸腺/體重比值及脾臟/體重比值與陰性對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，不同劑量的復(fù)方益生菌粉對(duì)小鼠體重和淋巴器官影響較小。

表2 復(fù)方益生菌粉對(duì)小鼠體重的影響 （±s，n=10）

表2 復(fù)方益生菌粉對(duì)小鼠體重的影響 （±s，n=10）

組別 始重/g 終重/g高劑量組 23.32±1.05 29.85±1.40中劑量組 24.11±0.58 30.49±1.65低劑量組 23.71±0.67 30.69±2.36陰性對(duì)照組 23.40±1.00 31.06±1.45

圖1 復(fù)方益生菌對(duì)小鼠臟器/體重比值的影響

2.2 復(fù)方益生菌小鼠體液免疫功能影響

2.2.1 血清溶血素半數(shù)溶血值 結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，低、中、高劑量組小鼠溶血素半數(shù)溶血值均高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，復(fù)方益生菌能有效促進(jìn)SRBC細(xì)胞發(fā)生溶血反應(yīng)，提高產(chǎn)生溶血素的能力。

2.2.2 抗體生成細(xì)胞數(shù) 結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，低、中、高劑量組小鼠的抗體生成細(xì)胞數(shù)均高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，復(fù)方益生菌能有效增加小鼠抗體生成細(xì)胞的數(shù)量。

表3 復(fù)方益生菌粉對(duì)小鼠體液免疫的影響（±s，n=10）

表3 復(fù)方益生菌粉對(duì)小鼠體液免疫的影響（±s，n=10）

注：**P＜0.01 vs 陰性對(duì)照組

組別 HC50 溶血空斑數(shù)（個(gè)/全脾細(xì)胞）高劑量組 80.37±1.50** 313.90±53.28**中劑量組 76.73±0.70** 207.44±18.32**低劑量組 75.74±0.41** 151.78±14.29**陰性對(duì)照組 69.36±1.27 101.00±15.78

2.3 小鼠細(xì)胞免疫功能影響

2.3.1 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) 結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，與陰性對(duì)照組相比低、中劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而高劑量組小鼠的足趾腫脹程度差值顯著性增大（P＜0.01），因此可進(jìn)一步猜測(cè)隨著劑量再次增加，其淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能可能會(huì)一定程度的再次增強(qiáng)。

表4 復(fù)方益生菌粉對(duì)小鼠細(xì)胞免疫的影響（±s，n=10）

表4 復(fù)方益生菌粉對(duì)小鼠細(xì)胞免疫的影響（±s，n=10）

注：**P＜0.01 vs 陰性對(duì)照組

足趾腫脹程度差值/mm高劑量組 0.222±0.010** 0.215±0.097**中劑量組 0.185±0.017** 0.170±0.0945低劑量組 0.097±0.010** 0.117±0.071陰性對(duì)照組 0.069±0.018 0.105±0.086組別 淋巴細(xì)胞增殖能力

2.3.2 淋巴細(xì)胞增殖能力 結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，隨著復(fù)方益生菌粉劑量的增加，低、中、高劑量組均能顯著增加ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，低、中、高劑量組均高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，復(fù)方益生菌能有效增強(qiáng)小鼠的淋巴細(xì)胞免疫功能。

2.4 復(fù)方益生菌小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能影響

2.4.1 小鼠碳廓清功能 結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)，低、中、高劑量組小鼠吞噬指數(shù)均高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，復(fù)方益生菌能針對(duì)小鼠的碳廓清功能有顯著增強(qiáng)作用，提高小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力。

表5 復(fù)方益生菌粉對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響（±s，n=10）

表5 復(fù)方益生菌粉對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響（±s，n=10）

注：**P＜0.01 vs 陰性對(duì)照組

組別 吞噬率% 吞噬雞紅細(xì)胞指數(shù) 吞噬指數(shù)α高劑量組 4.16±0.40** 0.0416±0.004** 7.034±0.268**中劑量組 2.88±0.40** 0.029±0.004** 6.200±0.117**低劑量組 1.43±0.10** 0.014±0.001** 5.043±0.182**陰性對(duì)照組 0.81±0.16 0.008±0.001 4.303±0.262

2.4.2 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞指數(shù) 結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)，低、中、高劑量組小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力均高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，復(fù)方益生菌能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性，提高小鼠單核-巨噬細(xì)胞的功能。

2.5 復(fù)方益生菌NK細(xì)胞活性

NK細(xì)胞活性結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可見(jiàn)，低、中、高劑量組小鼠的NK細(xì)胞活性均高于陰性對(duì)照組，差異有顯著性（P＜0.01），復(fù)方益生菌能夠增強(qiáng)小鼠的NK細(xì)胞活性，增強(qiáng)NK細(xì)胞功能。

表6 復(fù)方益生菌粉對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響（±s，n=10）

表6 復(fù)方益生菌粉對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響（±s，n=10）

注：**P＜0.01 vs 陰性對(duì)照組

組別 細(xì)胞活性/%高劑量組 109.68±8.56**中劑量組 68.77±4.25**低劑量組 53.88±4.50**陰性對(duì)照組 34.94±4.28

3 結(jié)論與討論

機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱與抗疾病能力的強(qiáng)弱及疾病的預(yù)后具有密不可分的聯(lián)系[4-5]。單核-巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞主要參與非特異性免疫，T淋巴細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫，B淋巴細(xì)胞主要參與體液免疫，因此，以上細(xì)胞均在機(jī)體免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]，其變化與否及變化程度是評(píng)價(jià)益生菌對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用的重要指標(biāo)。本文根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》有關(guān)檢測(cè)方法和判定標(biāo)準(zhǔn)，圍繞單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性、體液免疫和細(xì)胞免疫等方面，評(píng)價(jià)并驗(yàn)證復(fù)方益生菌粉對(duì)小鼠免疫功能的具體影響。

本文所用的復(fù)方益生菌粉由鼠李糖乳桿菌R9639、干酪乳桿菌Zhang和植物乳桿菌P9等3種益生菌菌株組成，菌株均為目前國(guó)內(nèi)外重點(diǎn)開(kāi)發(fā)的Lactobacillus屬細(xì)菌，均能耐受酸性胃液、堿性腸液，進(jìn)入腸道并成功黏附于腸黏膜，通過(guò)影響多種細(xì)胞因子的釋放發(fā)揮抗炎等特性[7-9]。有研究表明，多種益生菌的復(fù)合搭配能更好地發(fā)揮益生菌本身的功能，促進(jìn)CD8＋T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化，使前者發(fā)揮細(xì)胞毒作用釋放穿孔素等細(xì)胞因子攻擊病原微生物，使后者轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞分泌sIgA使病原微生物失去黏附功能，發(fā)揮維護(hù)腸道平衡、增加腸道免疫功能的作用，從而加強(qiáng)機(jī)體先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[10-12]。

本研究結(jié)果表明，各劑量復(fù)方益生菌對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)無(wú)差異，初步明確了其安全性。體液免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低、中、高劑量的復(fù)方益生菌能使小鼠血清溶血素半數(shù)溶血值及抗體生成數(shù)顯著增加；細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量復(fù)方益生菌能顯著增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型免疫反應(yīng)和淋巴細(xì)胞增殖能力；單核-巨噬細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低、中、高劑量復(fù)方益生菌能顯著增強(qiáng)小鼠碳廓清功能和巨噬細(xì)胞吞噬活性；最后通過(guò)NK細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，低、中、高劑量復(fù)方益生菌能顯著增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞功能和活性。

綜上所述，由3株益生菌組成的復(fù)合益生菌無(wú)明顯毒性作用，對(duì)小鼠健康狀態(tài)無(wú)顯著負(fù)面影響，并能從體液免疫、細(xì)胞免疫、單核-腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力和NK細(xì)胞活性等4個(gè)方面起到增強(qiáng)免疫功能的作用，通過(guò)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中對(duì)增強(qiáng)免疫力實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的界定，認(rèn)為該產(chǎn)品具有增強(qiáng)免疫力的作用，并為后續(xù)的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供了新的理論依據(jù)。