羅 倩，彭 博，魏曉露，王彩霞，陳騰飛，宋 玲，高云航，葉祖光，張廣平，侯紅平

痰熱清注射液干預慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的蛋白組學研究

羅 倩，彭 博，魏曉露，王彩霞，陳騰飛，宋 玲，高云航，葉祖光，張廣平*，侯紅平*

中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700

研究痰熱清注射液對慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）模型大鼠的治療作用，同時采用串聯(lián)質(zhì)譜標簽（tandem mass tags，TMT）定量蛋白質(zhì)組學探討其可能的作用機制。Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組、地塞米松（4 mg/kg）組和痰熱清注射液高、中、低劑量（4、2、1 g/kg）組，除對照組外，其余各組制備COPD模型，各給藥組ip相應藥物。連續(xù)給藥90 d后，檢測肺功能和肺泡灌洗液中細胞因子水平；采用蘇木素-伊紅和天狼猩紅染色觀察肺組織病理變化；通過TMT定量蛋白質(zhì)組學分析對照組、模型組、痰熱清注射液中劑量組大鼠肺組織差異蛋白。與對照組比較，模型組大鼠自主活動和精神狀態(tài)均有所降低，肺功能的順應性降低（＜0.001），阻力增大（＜0.001），肺組織炎癥細胞浸潤，肺泡腔擴大，氣道壁膠原纖維沉積，表明COPD模型制備成功。與模型組比較，痰熱清注射液組大鼠肺功能明顯得到改善（＜0.01、0.001），肺泡灌洗液中炎癥因子水平明顯降低（＜0.05、0.01、0.001）。蛋白組學分析結果顯示，痰熱清注射液中劑量組和模型組共有61個差異蛋白，差異蛋白與細胞的壞死、凋亡、自噬等信號通路密切相關。痰熱清注射液能夠明顯改善COPD模型大鼠的肺功能等癥狀，其機制與細胞的壞死、凋亡、自噬等信號通路密切相關。

痰熱清注射液；慢性阻塞性肺疾??；蛋白組學；肺功能；炎癥因子；自噬

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種進展緩慢，可造成早期死亡率、高死亡率的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。其主要特征是氣道阻塞，可逆性差，可導致呼吸衰竭等嚴重并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，除吸煙外，職業(yè)因素、感染、空氣污染、氣道高反應性、社會和經(jīng)濟因素等與COPD的發(fā)生發(fā)展也密切相關[1]。COPD的患病率因國家、年齡和性別而異。2020年，COPD已從1990年的全球第6大死亡原因上升至第3位[2]。同時，COPD是一種典型的異質(zhì)性疾病，可造成多種并發(fā)癥，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、抑郁、貧血、睡眠呼吸暫停、肥胖癥、代謝綜合征、糖尿病、心血管疾病、胃食管返流疾病、骨質(zhì)疏松癥、過敏性疾病和肺癌等[3-5]。在未來的挑戰(zhàn)中，早發(fā)現(xiàn)早預防，進行有效地治療是COPD所面臨的挑戰(zhàn)。

中醫(yī)認為，COPD患者反復咳喘，肺氣自虛，脾氣亦虛。因肺失治節(jié)、脾失健運、腎失蒸騰，則痰飲內(nèi)生，肝失疏泄條達，則氣滯有血停瘀生，循環(huán)往復，造成痰熱肺阻證[6]。在治療方面，應注重活血化瘀、清熱化痰等。痰熱清注射液是由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹組成的中藥靜脈注射制劑，是我國對中藥采取指紋圖譜監(jiān)測標準后生產(chǎn)的第1個注射劑品種。具有清熱解毒、化痰止咳、退熱和平喘的作用，用于治療痰熱肺阻之癥[7-8]。目前，臨床上已將痰熱清注射液與西醫(yī)治療聯(lián)合用于COPD[9-12]，取得了良好的效果。但痰熱清注射液是否對COPD具有確切的療效，又是通過何種途徑起到治療效果尚不清楚。本研究主要建立COPD大鼠模型，通過給予痰熱清注射液，觀察動物的癥狀改善，同時采用串聯(lián)質(zhì)譜標簽（tandem mass tags，TMT）定量蛋白質(zhì)組生物信息學分析探討其可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性Wistar大鼠84只，體質(zhì)量130～160 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0011，動物使用許可證號SYXK（京）2019-0003。動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中藥研究所實驗動物屏障環(huán)境（SPF級），溫度20～24 ℃，相對濕度45%～65%，12 h/12 h光照與黑暗交替進行。實驗過程中嚴格遵守動物福利原則，并經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥研究所倫理委員會批準（批準號2019A1320）。

1.2 藥品與試劑

脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，批號120M4030V）購自美國Sigma公司；鴻運香煙（條形碼6901028250542）購自河北中煙工業(yè)有限責任公司；痰熱清注射液（批號1906303）購自上海凱寶藥業(yè)股份有限公司；地塞米松磷酸鈉注射液（批號19110802A）購自貴州天地藥業(yè)有限責任公司；甲醛（批號20180418）購自天津市大茂化學試劑廠；核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號分別為20200528、2020041、20200617、20200516）購自武漢華美生物工程有限公司；TMT標記試劑盒（批號XH351170）購自美國Thermo公司。

1.3 儀器

DSI/BUXCO氣道阻力和肺順應性監(jiān)測系統(tǒng)（美國DSI公司）；SPG-C型煙霧發(fā)生器（蘇州阿洛斯環(huán)境發(fā)生器有限公司）；Spectramax i3x型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）；BSA3202S-CW型電子天平（德國Sartorius公司）；3-18KS型高速冷凍離心機（美國Sigma公司）。

2 方法

2.1 動物分組、造模與給藥

按體質(zhì)量分層法將大鼠隨機分為對照組、模型組、地塞米松（4 mg/kg，臨床等效劑量）組和痰熱清注射液高、中、低劑量（4、2、1 g/kg，分別相當于臨床劑量的2、1、1/2倍）組[13]，每組14只。對照組大鼠正常飲食和飲水，其余各組大鼠制備COPD模型。在造模的第1天和第14天，氣管滴注20 μL LPS（4 mg/mL），其余時間置于自制煙熏箱中，持續(xù)煙熏1.5 h，連續(xù)90 d。在造模的第2天，各給藥組ip相應藥物，連續(xù)給藥90 d。

2.2 大鼠一般狀態(tài)觀察

造模和給藥期間，密切觀察大鼠的一般狀態(tài)，主要為自主活動狀況、精神狀態(tài)、呼吸情況等，每周測定大鼠的體質(zhì)量。

2.3 肺功能檢測

末次給藥后，麻醉大鼠，氣管插管，測定大鼠的動態(tài)順應性（dynamic compliance，Cydn）和氣道阻力（airway resistance，RI）。

2.4 肺灌洗液中細胞因子水平的檢測

待肺功能檢測完成，大鼠腹主動脈采血后，采用生理鹽水對氣管和左肺進行灌洗，每次1.5 mL，重復2次，合并灌洗液。將收集的肺灌洗液于4 ℃、1000 r/min離心10 min，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書測定上清液中NF-κB、IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

2.5 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和天狼猩紅（picrosirius red，PSR）染色觀察肺組織病理變化

將大鼠的右肺置于4%多聚甲醛中進行固定，梯度乙醇脫水后，二甲苯透明浸透，包埋切片，切片厚度約為3 μm，對切片進行脫蠟后，分別進行HE和PSR染色。HE染色中，細胞核被蘇木素染成紫藍色，多數(shù)細胞質(zhì)及非細胞成分被伊紅染成粉紅色，用來觀察肺組織的結構狀態(tài)。PSR染色主要用來顯示膠原纖維。染色后，采用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 TMT定量蛋白質(zhì)組學檢測和分析

取對照組、模型組和痰熱清注射液中劑量組的肺組織，采用SDT裂解法提取蛋白質(zhì)，BCA法測定其含量。胰蛋白酶酶解蛋白質(zhì)后，按照TMT標記試劑盒說明書標記蛋白質(zhì)，采用LC-MS/MS進行數(shù)據(jù)采集，采用軟件Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4進行蛋白質(zhì)鑒定及定量分析，分析不同組別差異蛋白質(zhì)的含量。使用Pfam數(shù)據(jù)庫對差異蛋白質(zhì)的結構域進行分析。利用Blast2GO對目標蛋白質(zhì)集合進行基因本體（gene ontology，GO）注釋，GO功能注釋主要分為生物過程（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF）和細胞組分（cellular component，CC）。利用KAAS軟件，對目標蛋白質(zhì)集合進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路注釋。

2.7 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 大鼠一般狀態(tài)觀察

造模和給藥期間，對照組大鼠無明顯異常，正常進食飲水。模型組大鼠自主活動明顯減弱，精神萎靡，懶動倦臥，毛色無光澤、稀疏、枯槁，進食明顯減少，體質(zhì)量有所下降，出現(xiàn)不同程度的咳嗽、噴嚏等呼吸道癥狀。地塞米松組和痰熱清注射液高、中劑量組大鼠狀態(tài)較模型組有明顯的改善，大鼠體質(zhì)量也有所恢復。

3.2 痰熱清注射液對COPD模型大鼠肺功能的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠的Cydn顯著降低（＜0.001），RI顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，地塞米松組和痰熱清注射液高、中劑量組Cydn顯著升高（＜0.01、0.001），RI顯著降低（＜0.01、0.001）。

3.3 痰熱清注射液對COPD模型大鼠肺泡灌洗液中細胞因子水平的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-1β、NF-κB和TNF-α水平均顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，地塞米松組和痰熱清注射液高、中劑量組肺泡灌洗液中IL-1β、IL-1β、NF-κB和TNF-α水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。

表1 痰熱清注射液對COPD模型大鼠肺功能的影響(, n = 12)

與對照組比較：***＜0.001；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001，表2同

***< 0.001control group;#< 0.05##< 0.01###< 0.001model group, same as table 2

表2 痰熱清注射液對COPD模型大鼠肺泡灌洗液中細胞因子水平的影響(, n = 12)

3.4 痰熱清注射液對COPD模型大鼠肺組織病理變化的影響

HE染色（圖1）結果顯示，對照組大鼠肺泡結構完整，氣道上皮結構完整。模型組大鼠炎癥細胞浸潤，肺泡腔擴大，部分破裂融合成肺大皰，小葉中央型肺氣腫，細支氣管官腔狹窄，管壁增厚，管腔內(nèi)滲出增多。地塞米松組和痰熱清注射液高、中劑量組肺組織結構有所改善，炎性細胞浸潤和管腔內(nèi)滲出有所減少。PSR染色（圖2）結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠氣管壁明顯增厚，膠原纖維沉積明顯。地塞米松組和痰熱清注射液高、中劑量組膠原纖維有所減少，管壁增厚不明顯。

圖1 痰熱清注射液對COPD模型大鼠肺組織病理變化的影響(HE, ×200)

圖2 痰熱清注射液對COPD模型大鼠肺組織病理變化的影響(PSR, ×200)

以上結果提示，痰熱清注射液能夠明顯緩解COPD模型大鼠病理進展，而中劑量為有效劑量。為此，將對照組、模型組和痰熱清注射液中劑量組的肺組織進行TMT定量蛋白質(zhì)組學的檢測和分析。

3.5 TMT定量蛋白質(zhì)組學分析

經(jīng)TMT定量蛋白組學的蛋白質(zhì)鑒定和差異分析，發(fā)現(xiàn)痰熱清注射液中劑量組與模型組共有61個差異蛋白，其中上調(diào)的蛋白有43個，下調(diào)的蛋白有18個（表3）。對上述差異蛋白進行結構域分析顯示，痰熱清注射液中劑量組與模型組差異蛋白的結構域主要集中在甘油醛3-磷酸脫氫酶NAD結合結構域、甘油醛3-磷酸脫氫酶C-末端結構域、蛋白激酶結構域、胰蛋白酶、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶樣磷酸酯酶、醛脫氫酶家族、免疫球蛋白V-set結構域、7跨膜受體（視紫紅質(zhì)家族）、SH3結構域、U-PAR/Ly-6域、中間絲蛋白、免疫球蛋白結構域、RNA識別基序、絲氨酸蛋白酶抑制劑、鐵/錳超氧化物歧化酶、木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶、纖維母細胞生長因子、C2結構域、PH結構域、Hsp90蛋白（圖3）。

對上述差異蛋白進行GO分析顯示，BP主要涉及細胞死亡、程序性細胞死亡、細胞死亡的負調(diào)節(jié)、細胞死亡的調(diào)節(jié)、程序性細胞死亡的調(diào)節(jié)、凋亡過程、細胞對活性氧的反應、顆粒酶介導的凋亡信號通路等。MF主要涉及氧化物歧化酶活性、氧化還原酶活性、三價鐵丁丙、3-氯烯丙醛脫氫酶活性、一氧化氮跨膜轉(zhuǎn)運體活性、氨酰基-tRNA水解酶活性等。CC主要包括胞外區(qū)、DUBm復合物和SAGA復合物等（圖4）。

表3 痰熱清注射液中劑量組和模型組的差異蛋白

圖3 痰熱清注射液中劑量組與模型組差異蛋白的結構域分析

對上述差異蛋白進行KEGG分析，如圖5、6所示，痰熱清注射液中劑量組與模型組差異蛋白涉及的信號通路主要有壞死、新霉素、卡那霉素和慶大霉素生物合成、溶酶體、抗原加工和呈遞、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、破骨細胞分化、核黃素代謝、2型糖尿病淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、金黃色葡萄球菌感染、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑抗性、胃癌、腎素分泌、乳腺癌、信號通路調(diào)節(jié)干細胞的多能性、膽汁分泌、神經(jīng)刺激性配體-受體相互作用、黑色素瘤、戊糖磷酸途徑、近端小管碳酸氫鹽回收、泛醌和其他萜類醌生物合成等。其他信號通路圖詳見https://www.kegg.jp/。

圖4 痰熱清注射液中劑量組與模型組差異蛋白的GO分析

圖5 痰熱清注射液中劑量組與模型組差異蛋白的KEGG分析

綠底方框表示差異蛋白質(zhì)下調(diào)，小圓圈表示小分子代謝物，大圓框代表其他通路，其中淺綠色底方框為物種專屬蛋白

4 討論

痰熱清注射液中黃芩為君藥，熊膽粉和山羊角為臣藥，金銀花和連翹為使藥，君藥味苦性寒，具有瀉火解毒、清熱燥濕的作用。臣藥具有抑菌、鎮(zhèn)咳、平喘、清熱解毒之功效。使藥具有宣肺化痰、清熱解毒的作用。方中諸藥，相互配伍，互相協(xié)同，起到清熱解毒、化痰宣肺之功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明，痰熱清注射液可以抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成過程[14-15]，同時能夠阻斷呼吸道合胞病毒感染靶細胞[16]，抑制細菌和病毒的增殖[17]，增強機體的免疫力。痰熱清注射液能夠抑制IL-6、TNF-α、IL-8等炎癥因子的表達[18]，起到抗炎的作用，這與本研究的結果一致。臨床研究報道表明，痰熱清注射液可減輕痰熱壅肺型COPD急性加重期的氧化應激損傷，改善肺功能[19]。通過本研究藥效學指標和組織病理學指標的檢測，證實痰熱清注射液對COPD具有良好的干預效果，不僅能夠抑制炎癥因子的表達，抑制氣道壁纖維化的進展，同時能夠明顯改善動物的肺功能，且中劑量為有效劑量。

蛋白組學分析顯示，痰熱清注射液干預COPD與抑制細胞壞死和凋亡等生物過程密切相關。研究表明，COPD患者氧化應激和系統(tǒng)性炎癥明顯增強，而TNF-α和腫瘤壞死因子受體-α2（tumor necrosis factor receptor-α2，TNFR-α2）在吸煙者和無癥狀COPD患者之間存在差異，可作為COPD患者潛在的標志物[20]。凋亡被認為是COPD發(fā)生發(fā)展的重要途徑，而COPD的發(fā)生發(fā)展過程與肺泡巨噬細胞[21]、肺泡上皮細胞[22]、氣道上皮細胞[23]的凋亡密切相關。煙霧和感染的持續(xù)刺激，誘發(fā)肺組織氧化應激失衡，導致細胞凋亡信號的激活。

研究表明，自噬參與了COPD病理的發(fā)展過程。在煙霧誘導的COPD動物模型中，自噬溶酶體的數(shù)量和相關蛋白的表達均明顯升高，表明COPD過程中存在明顯的自噬現(xiàn)象[24]，敲除自噬相關的基因和蛋白，能明顯改善COPD的癥狀[25]。其他研究也表明，COPD患者肺組織和肺血管的自噬表達明顯增強，氣管成纖維的自噬參與COPD的氣道重塑[26]。本研究蛋白組學分析顯示，痰熱清注射液參與COPD的自噬過程，痰熱清注射液治療COPD可能與溶酶體自噬過程密切相關。

KEGG分析結果顯示，痰熱清注射液中劑量組與模型組差異蛋白的信號通路涉及糖尿病代謝、半乳糖代謝、胃癌、腎素分泌、乳腺癌、神經(jīng)刺激性配體-受體相互作用等。分析認為，這與COPD的并發(fā)癥密切相關。COPD并不是單純性的肺部炎癥，其作為一類疾病能夠?qū)е露喾N并發(fā)癥，涉及多個系統(tǒng)和多種疾病，如神經(jīng)系統(tǒng)的抑郁等精神性疾病，代謝系統(tǒng)的肥胖、代謝綜合征、糖尿病等[27-28]，消化系統(tǒng)的胃食管反流疾病等，均會給患者帶來沉重的經(jīng)濟負擔和醫(yī)療負擔。而痰熱清注射液作為中成藥，其多靶點多途徑的治療特色和優(yōu)勢，對COPD的并發(fā)癥也有一定的作用和影響。

綜上，痰熱清注射液能夠改善COPD動物模型炎癥表達和肺功能的降低，具有良好的治療效果，蛋白組學顯示，其機制與干預壞死、凋亡、自噬和相關并發(fā)癥的發(fā)生等密切相關。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Proteomic study of Tanreqing Injection on chronic obstructive pulmonary disease model rats

LUO Qian, PENG Bo, WEI Xiao-lu, WANG Cai-xia, CHEN Teng-fei, SONG Ling, GAO Yun-hang, YE Zu-guang, ZHANG Guang-ping, HOU Hong-ping

Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

To study the therapeutic effect of Tanreqing Injection (痰熱清注射液) on chronic obstructive pulmonary disease (COPD) model rats, and explore its possible mechanism by tandem mass tags (TMT) quantitative protein omics.Wistar rats were randomly divided into control group, model group, dexamethasone (4 mg/kg) group and Tanreqing Injection high-, medium-and low-dose (4, 2, 1 g/kg) groups. Except for the control group, COPD models were prepared in other groups, and the corresponding drugs were given to each group. After 90 d of continuous administration, lung function and cytokine level in alveolar lavage fluid were detected. Hematoxylin-eosin and picrosirius red staining were used to observe the pathological changes of lung tissue. The differential proteins in lung tissue of rats in control group, model group and Tanreqing Injection medium-dose group were analyzed by TMT quantitative protein omics.Compared with control group, the autonomic activity and mental state of rats in model group were decreased, the compliance of lung function was decreased (< 0.001), the resistance was increased (< 0.001), inflammatory cells infiltrated in lung tissue, alveolar cavity expanded and collagen fibers deposited in airway wall, which indicated that the COPD model was successfully prepared. Compared with model group, the lung function of rats in Tanreqing Injection group was significantly improved (< 0.01, 0.001), and the levels of inflammatory factors in alveolar lavage fluid were significantly decreased (< 0.05, 0.01, 0.001). Proteomic analysis showed that there were 61 differential proteins in Tanreqing Injection medium-dose group and model group, which were closely related to cell necrosis, apoptosis, autophagy and other signal pathways.Tanreqing Injection can obviously improve the lung function and other symptoms of COPD model rats, and its mechanism is closely related to signal pathways such as cell necrosis, apoptosis and autophagy.

Tanreqing Injection; chronic obstructive pulmonary disease; proteomics; lung function; inflammatory factor; autophagy

R285.5

A

0253 - 2670(2023)21 - 7078 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.016

2023-07-22

國家自然科學基金資助項目（82104502）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項基金資助項目（ZXKT23006，ZZ13-YQ-060，ZXKT21020）；中國中醫(yī)科學院科技創(chuàng)新工程（CI2021A04615）

羅 倩，碩士，研究方向為中藥藥理。E-mail: luoqian2000508@163.com

通信作者：侯紅平，副研究員，從事慢性疾病的新藥研發(fā)與機制研究。E-mail: hphou@icmm.ac.cn

張廣平，研究員，從事中藥藥理毒理研究。E-mail: gpzhang@icmm.ac.cn

[責任編輯 李亞楠]