孫 明，任巧云，聶 英，仲富萍，董 偉

（1.民勤縣畜牧獸醫(yī)工作站，甘肅民勤 733999；2.甘肅隴沁現(xiàn)代農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)有限公司，甘肅古浪 733100；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046；4.武威市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，甘肅武威 733000）

梨形蟲病是巴貝斯蟲?。╞abesiaosis）和泰勒蟲病（theileriosis）的統(tǒng)稱，其在世界各地廣泛分布，對(duì)人畜危害較大[1]。該病在急性期可引起宿主淋巴結(jié)腫大、結(jié)膜炎、心律加快、食欲不振以及反芻和生產(chǎn)力下降等臨床癥狀，可導(dǎo)致感染宿主1周內(nèi)死亡；慢性梨形蟲病則常見(jiàn)黃疸、貧血、血紅蛋白尿和消瘦等臨床癥狀。在自然狀態(tài)下，梨形蟲病病原須通過(guò)節(jié)肢動(dòng)物蜱蟲進(jìn)行生物性傳播，其自然疫源地與媒介蜱蟲分布密切相關(guān)。目前在全世界已發(fā)現(xiàn)4科21屬960種蜱[2]。我國(guó)分布有2科10屬119種蜱[3]，其中軟蜱記錄有14種，分布在大陸地區(qū)13種、臺(tái)灣地區(qū)3種[4]。我國(guó)蜱傳疾病在時(shí)空上分布不均，主要高發(fā)于甘肅、新疆、云南、福建等省份。近年來(lái)全球不斷有新的蜱傳病原體出現(xiàn)，使得蜱傳疾病的傳播和流行復(fù)雜多變。2010年以來(lái)，蜱傳發(fā)熱伴血小板減少綜合癥病毒（SFTSV）和腹地病毒（heartland virus，HRTV）感染已導(dǎo)致30多人死亡。2022年，河南省有多名老人因蜱傳“發(fā)熱伴血小板綜合征布尼亞病毒”離世的報(bào)道。因此，蜱及蜱媒病不僅影響?zhàn)B殖業(yè)的健康發(fā)展，也是公共衛(wèi)生急需解決的問(wèn)題。

迄今為止，全球已報(bào)道17種泰勒蟲，包括萊氏泰勒蟲（T.lestoquardi）、呂氏泰勒蟲（T.luwenshuni）、尤氏泰勒蟲（T.uilenbergi）、綿羊泰勒蟲（T.ovis）、隱藏泰勒蟲（T.recomdita）、分離泰勒蟲（T.separata）、環(huán)形泰勒蟲（T.annulata）、小泰勒蟲（T.parva）、突變泰勒蟲（T.mutans）、斑羚泰勒蟲（T.taurotragi）、附膜泰勒蟲（T.velifera）、安娜泰勒蟲（T.annae）、馬泰勒蟲（T.equi）、鹿泰勒蟲（T.cervi）、東方泰勒蟲（T.orientalis）、中華泰勒蟲（T.sinensis）和山羊泰勒蟲（T.hirci）[5-6]。然而，國(guó)內(nèi)僅分離出尤氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、綿羊泰勒蟲、環(huán)形泰勒蟲、東方泰勒蟲和中華泰勒蟲[7-12]。全國(guó)記錄有16種巴貝斯蟲，包括雙芽巴貝斯蟲（B.bigemina）、牛巴貝斯蟲（B.bovis）、大巴貝斯蟲（B.major）、莫氏巴貝斯蟲（B.motasi）、綿羊巴貝斯蟲（B.ovis）、分岐巴貝斯蟲（B.divergens）、田鼠巴貝斯蟲（B.microti）、柏氏巴貝斯蟲（B.perroncitoi）、豬巴貝斯蟲（B.trautmanni）、東方巴貝斯蟲（B.orientalis）、吉氏巴貝斯蟲（B.gibsoni）、犬巴貝斯蟲（B.canis）、隱藏巴貝斯蟲（B.occultans）、獵戶巴貝斯蟲（B.venatorum）、卵形巴貝斯蟲（B.ovata）和駑馬巴貝斯蟲（B.caballi）[5-6，13-15]。雖有牛巴貝斯蟲病的報(bào)道，但引起該病的牛巴貝斯蟲在國(guó)內(nèi)尚未被分離到[14]。

河西走廊是甘肅省重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)之一，也是溝通我國(guó)東部和新疆的主干道，被稱為“西北糧倉(cāng)”，歷朝歷代均為我國(guó)東部通往西域的咽喉要道。發(fā)展畜牧業(yè)是當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)收入來(lái)源，但由于地處西北，經(jīng)濟(jì)發(fā)展相對(duì)滯后，以及受傳統(tǒng)生活方式等因素影響，該區(qū)域畜牧養(yǎng)殖方式粗放，動(dòng)物體表蜱蟲寄生嚴(yán)重，梨形蟲病廣泛流行。本研究以牛羊體表寄生蜱和蜱傳梨形蟲病病原為研究對(duì)象開(kāi)展調(diào)查，以期掌握當(dāng)?shù)仳绶N類、牛羊梨形蟲病病原種類及其流行情況，評(píng)估蜱及蜱媒病對(duì)公共衛(wèi)生的危害，制定有效防控措施，為促進(jìn)畜牧業(yè)高效健康綠色發(fā)展提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體與試劑

感受態(tài)細(xì)胞、Taq酶、無(wú)菌水、X-gal和IPTG，購(gòu)自寶生物工程（大連）公司；pGEM-T Easy載體，購(gòu)自Promega公司；DNA提取試劑盒，購(gòu)自QIAGEN公司；質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）公司。

1.2 基因組DNA

從甘肅省河西五市部分縣區(qū)采集牛羊抗凝血181份，其中2019年5—7月采集58份（武威市羊抗凝血），2020年4—7月采集123份（武威市?？鼓?9份、武威市羊抗凝血38份、酒泉市羊抗凝血21份、張掖市抗凝血15份）；2020年4—7月采集蜱蟲924只，其中亞洲璃眼蜱699只、草原革蜱94只、波斯銳緣蜱58只、森林革蜱43只、長(zhǎng)角血蜱15只、青海血蜱15只。試驗(yàn)選取游離蜱357只。使用QIAGEN公司的基因組提取試劑盒，提取游離蜱蟲組織DNA和牛羊抗凝血基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考文獻(xiàn)[16-17]，由西安擎科生物技術(shù)有限公司合成動(dòng)物梨形蟲病病原巢式PCR通用引物2對(duì)：Piro-AS（5'-CCTTCCTTTAAGTGATAAGGTTCAC-3'）和Piro-S1（5'-GACGGTAGGGTATTGGCCTmCCG-3'，m = A + C）；Piro-nestA（5'-ATTACCCAATm-CbGACACvGkGAGG-3'，v = A + C + G，b = T +C + G，k = T + G，m = A + C）和Piro-nest B（5'-TTAAATACGAATGCCCCCAAC-3'）。

1.3.2 18S rRNA基因PCR擴(kuò)增 以實(shí)驗(yàn)室保存的動(dòng)物梨形蟲病病原基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，未感染牛羊基因組DNA和PCR用水分別為陰性對(duì)照和空白對(duì)照。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序、電泳分析、目的片段與pGEM-T Easy載體連接、LB平板藍(lán)-白斑篩選和菌液鑒定等，均參照文獻(xiàn)[18]執(zhí)行。在380～420 bp位置出現(xiàn)特異性目的條帶，經(jīng)測(cè)序分析后判定為梨形蟲病病原樣品陽(yáng)性。

1.4 序列分析

將測(cè)序獲得的基因組DNA，使用BLASTn工具和MEGA v.6.06軟件進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（Bootstrap，1 000次重復(fù)），同時(shí)將獲得的18S rRNA基因組DNA序列提交GenBank，獲得相應(yīng)的基因序列登錄號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 抗凝血樣品檢測(cè)

牛羊抗凝血樣品檢測(cè)結(jié)果（表1）顯示：經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定，檢出陽(yáng)性樣品16份，總感染率為8.84%，陽(yáng)性樣品分布于武威市（10.34%）和張掖市（4.76%）。16份陽(yáng)性樣品包括，中華泰勒蟲3份、尤氏泰勒蟲5份（武威市4份、張掖市1份）、呂氏泰勒蟲6份（武威市）、分離泰勒蟲1份（武威市，2019年樣品）和莫氏巴貝斯蟲1份（武威市，2019年樣品），酒泉市未檢出陽(yáng)性樣品。

表1 牛羊血液樣本PCR檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 蜱樣品檢測(cè)

蜱樣品檢測(cè)結(jié)果（表2）顯示：采集的游離蜱涉及硬蜱科的革蜱屬、血蜱屬和璃眼蜱屬，軟蜱科的銳緣蜱屬。經(jīng)巢氏PCR擴(kuò)增測(cè)序鑒定，檢出攜帶梨形蟲病病原的蜱9只，其中攜帶中華泰勒蟲2只（青海血蜱）、環(huán)形泰勒蟲1只（亞洲璃眼蜱）、狍泰勒蟲1只（亞洲璃眼蜱），雙芽巴貝斯蟲3只（亞洲璃眼蜱）、隱藏巴貝斯蟲2只（亞洲璃眼蜱）；陽(yáng)性樣品全部來(lái)源于武威市采集的青海血蜱和亞洲璃眼蜱，蜱病原攜帶率為3.90%，其余蜱種中未檢出陽(yáng)性樣品。

表2 蜱蟲樣本梨形蟲病病原PCR檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 序列分析

將擴(kuò)增測(cè)序鑒定的25份梨形蟲病病原18S rRNA基因序列提交到GenBank，獲得基因序列登錄號(hào)為MH899756—MH899763，MW404465—MW404480，MW404482。通過(guò)BLASTn序列分析，檢出3種巴貝斯蟲（莫氏巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和隱藏巴貝斯蟲）和6種泰勒蟲（東方泰勒蟲、中華泰勒蟲、分離泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、狍泰勒蟲和環(huán)形泰勒蟲）。從構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)（圖1）可知，檢出的梨形蟲病病原分為泰勒蟲屬和巴貝斯蟲屬2大類，每種病原跟相應(yīng)國(guó)內(nèi)外檢出蟲株同源性均較高，處于各蟲株相應(yīng)分支上，提交序列相似率達(dá)99%～100%。

圖1 基于梨形蟲病病原18S rRNA核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)[19]記載，河西走廊區(qū)域分布的泰勒蟲屬有環(huán)形泰勒蟲、山羊泰勒蟲、綿羊泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲和呂氏泰勒蟲，其媒介蜱為缺緣璃眼蜱。其中：瑟氏泰勒蟲，其媒介蜱為長(zhǎng)角血蜱，主要分布于武威市和張掖市；綿羊泰勒蟲，其媒介蜱為青海血蜱，主要分布于河西區(qū)域的陰濕和半干旱草原地區(qū)，如高臺(tái)縣、民樂(lè)縣、山丹縣、永昌縣、肅南縣、民勤縣等地；呂氏泰勒蟲和山羊泰勒蟲，在河西五市均有分布。巴貝斯蟲屬僅有雙芽巴貝斯蟲在酒泉市和武威市有發(fā)現(xiàn)。1997年，羅建勛等[20]對(duì)甘肅省13個(gè)地區(qū)45個(gè)縣2 168只綿羊和山羊進(jìn)行羊泰勒蟲調(diào)查，發(fā)現(xiàn)河西五市中除嘉峪關(guān)市外其他地區(qū)均有感染；孟林明等[21]2011—2012年采集453份羊血液樣品進(jìn)行羊梨形蟲病病原檢測(cè)，在武威市天祝縣檢測(cè)到山羊和綿羊的呂氏泰勒蟲陽(yáng)性率分別為64%和56%，尤氏泰勒蟲陽(yáng)性率分別為58%和56%，在張掖市肅南縣、金昌市永昌縣和嘉峪關(guān)市樣品中未檢測(cè)到陽(yáng)性樣品；李四通等[22]在天?？h11個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)350份白牦牛樣品中檢出中華泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲、雙芽巴貝斯蟲和環(huán)形泰勒蟲。本調(diào)查采用巢氏PCR檢測(cè)方法在河西區(qū)域共檢出1目2科9種梨形蟲病病原，包括莫氏巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和隱藏巴貝斯蟲3種巴貝斯蟲，東方泰勒蟲、中華泰勒蟲、分離泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、狍泰勒蟲和環(huán)形泰勒蟲6種泰勒蟲。從近20年的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)分析，梨形蟲病病原在河西走廊區(qū)域的感染仍以牧區(qū)較為嚴(yán)重，尤其是武威市周邊區(qū)域，且呈現(xiàn)病原種屬多樣性特征，這可能與該地區(qū)發(fā)展對(duì)外經(jīng)濟(jì)，推進(jìn)高水平的開(kāi)放方式息息相關(guān)。武威市位于青藏高原、黃土高原和內(nèi)蒙古-新疆高原之間，北部為干旱氣候區(qū)，中部為平原綠洲區(qū)，南部為祁連山區(qū)。祁連山區(qū)（天?？h）干燥寒冷，家畜是當(dāng)?shù)鼐用竦闹匾忸惡团Ｄ虂?lái)源，家畜和野生動(dòng)物作為梨形蟲病病原的天然貯藏宿主，在自然環(huán)境中接觸媒介蜱蟲的概率很高。天?？h的白牦牛已被確認(rèn)感染過(guò)獵戶巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和牛巴貝斯蟲[15，22]。環(huán)形泰勒蟲，是熱帶地區(qū)泰勒蟲病的病原體，由幾種璃眼蜱屬傳播，被認(rèn)為是對(duì)牛最致病的泰勒蟲之一[18，23]。該病在武威市的流行主要引起牛奶、肉類以及牛皮等副產(chǎn)品的減產(chǎn)，對(duì)當(dāng)?shù)嘏ｐB(yǎng)殖業(yè)影響很大。

河西走廊區(qū)域發(fā)現(xiàn)的硬蜱屬蜱蟲種類主要有嗜鳥硬蜱（玉門縣、嘉峪關(guān)市）、草原硬蜱（天祝縣、肅北縣）、長(zhǎng)須血蜱（肅北縣）、青海血蜱（天?？h）、阿壩革蜱（天?？h）、銀盾革蜱（肅南縣）、森林革蜱（肅南縣）、短小扇頭蜱（肅北縣）、小亞璃眼蜱、亞洲璃眼蜱、亞洲璃眼蜱卡氏亞種、殘緣璃眼蜱和盾糙璃眼蜱，軟蜱屬有拉哈爾鈍緣蜱（肅南縣、酒泉市、民勤縣）和波斯銳緣蜱（酒泉市各縣區(qū)、民勤縣）[19]。2011年，羅曉紅等[24]在甘肅省迭部和鏵尖地區(qū)調(diào)查蜱自然感染萊姆病伯氏疏螺旋體的研究成果表明，這些地區(qū)硬蜱屬、血蜱屬和革蜱屬分布廣泛，是甘肅省蜱類的主要構(gòu)成者。從地理位置分析，璃眼蜱屬、扇頭蜱屬、銳緣蜱和鈍硬蜱屬主要分布于河西走廊和祁連山區(qū)。2018年，王和平等[25]采用家畜體表檢蜱法采集蜱蟲并進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，在武威市、張掖市、酒泉市、嘉峪關(guān)市等地共檢出蜱類2科3屬3種，其中軟蜱科1種、硬蜱科2種，波斯銳緣蜱占62.75%（283/451），亞?wèn)|璃眼蜱占25.49%（115/451），草原革蜱占11.76%（53/451）。本調(diào)查在河西走廊區(qū)域牛羊體表和環(huán)境中共采集蜱蟲924份，發(fā)現(xiàn)亞洲璃眼蜱占75.65%，草原革蜱占10.17%，波斯銳緣蜱占6.28%，森林革蜱占4.65%，長(zhǎng)角血蜱占1.62%，青海血蜱占1.62%，表明硬蜱科種屬仍是河西地區(qū)的優(yōu)勢(shì)蜱種，而亞洲璃眼蜱為河西地區(qū)的優(yōu)勢(shì)蜱蟲，這與王和平等[25]報(bào)道的結(jié)果一致。特別是亞洲璃眼蜱體內(nèi)狍泰勒蟲、隱藏巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲等病原的檢出，提示必須重視環(huán)境游離蜱蟲的滅蜱工作。

分離泰勒蟲首先由Uilenberg和Andreasen（1974年）在坦桑尼亞被發(fā)現(xiàn)[26]。Uilenberg和Schreuder發(fā)現(xiàn)該病原是通過(guò)外翻扇頭蜱（Rhipicephalusevertsi）和受感染的綿羊傳播的。該病原分布于亞洲，其致病性不強(qiáng)，不會(huì)導(dǎo)致綿羊死亡[27]。本調(diào)查在武威市采集的羊抗凝血樣品中，檢出分離泰勒蟲陽(yáng)性樣品1份，并發(fā)現(xiàn)該陽(yáng)性樣品序列與南非分離到的分離泰勒蟲序列（AY260175）相似率達(dá)99.1%，這是我國(guó)首次在綿羊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)分離泰勒蟲的存在。關(guān)于隱藏巴貝斯蟲的描述，目前僅限于非洲撒哈拉以南區(qū)域以及尼日利亞和歐洲（例如羅馬尼亞）等國(guó)家和地區(qū)。隱藏巴貝斯蟲是一種致病性較弱的病原[5]，宿主為牛，傳播媒介為邊緣璃眼蜱麻點(diǎn)亞種（Hyalommamarginatm rufipes），分布在非洲，經(jīng)卵傳播，其饑餓雌蟲在感染動(dòng)物體上飽血后繁育而來(lái)的次代若蟲、成蟲均可傳播該病原[28]。我國(guó)首次在新疆吉木乃縣的蜱體內(nèi)檢出該病原[12]。此次調(diào)查在靠近內(nèi)蒙古邊境線的武威市采集到的亞洲璃眼蜱蟲體內(nèi)再次檢測(cè)到隱藏巴貝斯蟲，并發(fā)現(xiàn)其序列與土耳其（KP745626、KJ000484）、突尼斯（HQ331478）和南非（EU376017）提交的序列相似率達(dá)99.0%～100%。此外，莫氏巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、隱藏巴貝斯蟲、東方泰勒蟲、中華泰勒蟲、分離泰勒蟲和狍泰勒蟲等梨形蟲病原都是河西地區(qū)新檢出蟲種，這可能與區(qū)域發(fā)展牧業(yè)經(jīng)濟(jì)和活畜的跨區(qū)域引種密切相關(guān)。由于蜱蟲90%的時(shí)間是脫離宿主而獨(dú)立存在的，因而提供了一個(gè)良好的環(huán)境滅蜱窗口。鑒于梨形蟲病對(duì)于養(yǎng)羊業(yè)、養(yǎng)牛業(yè)所造成的危害，建議各地畜牧獸醫(yī)主管部門加強(qiáng)蜱傳播梨形蟲病的防治工作。此次流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，將為甘肅省相關(guān)部門加強(qiáng)蜱傳性血液原蟲病的研究和制定有效防控措施提供依據(jù)。