王金萍，付嘉佳，李富祥，何于雯，宋建領(lǐng)，高華峰

（1.云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650024；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種急性接觸性傳染病，主要表現(xiàn)為妊娠母豬繁殖障礙以及仔豬呼吸道癥狀[1]。我國于1996年首次從疑似感染豬群中檢出PRRSV抗體，并完成了病毒分離[2]。目前，PRRS仍然是制約我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要疫病之一[3]。

PRRSV屬于尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬成員，其基因組全長約15 kb，有8個(gè)開放閱讀框（ORF）[4-5]。研究[6]表明，復(fù)制酶基因ORF1a編碼的聚合蛋白經(jīng)裂解后產(chǎn)生6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1α、NSP1β以及NSP2～5），其中NSP2基因含有B細(xì)胞表位免疫的優(yōu)勢基因，該區(qū)段的部分基因缺失與毒力增強(qiáng)有重要關(guān)系。Ruedas等[7]研究表明，NSP2高變異區(qū)90個(gè)堿基缺失是毒力增強(qiáng)的關(guān)鍵因素。ORF2—ORF7基因編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，由OFR3基因編碼的GP3蛋白為高度糖基化蛋白，是PRRSV各毒株間保守性最差的蛋白之一，其羧基端有1個(gè)與病毒血清型有關(guān)的非中和抗原表位[8]；由ORF5基因編碼的囊膜糖蛋白GP5是重要的抗原蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。在所有結(jié)構(gòu)蛋白中，GP5變異程度最大，其變異可導(dǎo)致不同致病性毒株不斷出現(xiàn)及疫苗保護(hù)率降低[9-10]。為了解云南省邊境地區(qū)PRRSV遺傳特征及相關(guān)基因變異情況，本研究對2018年從云南省孟連縣一養(yǎng)殖場分離的PRRSV進(jìn)行了全基因組、NSP2高變區(qū)、GP3及GP5基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列遺傳進(jìn)化分析，以期及時(shí)掌握邊境地區(qū)PRRSV遺傳變異情況，并為制定有針對性的防控策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 2018年3月云南省孟連縣某養(yǎng)豬場部分豬群發(fā)病，病豬表現(xiàn)高熱，體溫高達(dá)41 ℃，腹部、耳及后軀發(fā)紅，發(fā)病率及病死率均在20%以上。從該養(yǎng)殖場采集發(fā)病豬只肺臟組織用于病原檢測及分離培養(yǎng)，同時(shí)采集血清用于抗體檢測。

1.1.2 培養(yǎng)基、細(xì)胞及毒株 Marc-145細(xì)胞、PRRSV陽性血清、PRRSV對照毒株YN-1株（云南省分離的強(qiáng)毒株），由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；MEM培養(yǎng)基、小牛血清，為Gibico公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 一步法RT-PCR試劑、病毒提取試劑、膠回收試劑盒及DNA Marker等分子生物學(xué)試劑，購自大連寶生物公司；FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG，購自北京索萊寶公司；引物合成及病毒全基因組測序，由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 PRRSV毒株分離

待Marc-145細(xì)胞長成單層后，棄上清，接種1 mL經(jīng)0.45 μm濾膜過濾的病料樣品組織液，37 ℃吸附1 h；棄去吸附后的病料樣品，添加含1%小牛血清的MEM維持液，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3～5 d后產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE），收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后接種Marc-145細(xì)胞連續(xù)傳代3代，待出現(xiàn)穩(wěn)定的CPE后，收集病毒并置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PRRSV檢測及鑒定

以病毒基因組提取試劑盒分別提取組織樣品以及分離培養(yǎng)物上清和沉淀的總RNA，參考文獻(xiàn)[11]合成3條引物（P1：5'-TGTCCCYGCYCCGCGCAGGAAGG-3'；P2：5'-CGCGTAGAACTGTGACAACAACG-3'；P3：5'-GACARGGAGCTGCTGCTTGATGACAC-3'）進(jìn)行檢測及病原初步鑒定。其中：P1、P3用于擴(kuò)增經(jīng)典毒株及高致病性毒株，擴(kuò)增片段長度分別為529、439 bp；P2、P3用于擴(kuò)增高致病性毒株，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為218 bp。RT-PCR反應(yīng)體系50 μL：酶混合液2 μL，2×Buffer 25 μL，無RNase H2O 16 μL，模板5 μL，上下游引物各1 μL。擴(kuò)增條件：50 ℃ 反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃ 預(yù)變性2 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳并以膠回收試劑盒純化，擴(kuò)增產(chǎn)物送昆明碩擎生物技術(shù)有限公司測序，將所得序列與GenBank中RRRSV序列進(jìn)行比對驗(yàn)證。

圖1 病毒分離培養(yǎng)特性及IFA結(jié)果

1.4 PRRSV分離株毒價(jià)測定

將出現(xiàn)規(guī)律性病變的PRRSV分離株用1%MEM培養(yǎng)基進(jìn)行10倍倍比稀釋，并接種到長成單層Marc-145細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，每孔接種100 μL，共接種8列，后4列為細(xì)胞對照，然后置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)5 d，逐日觀察病變情況并記錄。按Reed-Muench法計(jì)算病毒TCID50。

1.5 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）

將病毒接種至長成單層的Marc-145細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置不接種病毒的細(xì)胞作為空白對照；置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，待出現(xiàn)CPE后棄去上清，用PBS洗滌細(xì)胞3次；加入1 mL 1:10稀釋的PRRSV陽性血清，37 ℃孵育30 min；用PBS洗滌3次，加入1:50稀釋的FITC兔抗豬IgG，37 ℃孵育30 min；用PBS洗滌3次，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.6 病毒全基因組測序及數(shù)據(jù)處理

提取病毒核酸，完成建庫后通過Illumina Novaseq 6 000 PE150進(jìn)行測序。采用Illumina測序技術(shù)完成毒株的基因組掃描測序，全基因組數(shù)據(jù)獲取及組裝均由北京擎科生物有限公司完成。

1.7 PRRSV分離株生物信息學(xué)分析

將完成測序及拼接后的PRRSV分離株與GenBank收錄的34株近年來主要在我國流行的毒株，利用MEGA 11軟件構(gòu)建NJ進(jìn)化樹，分析不同毒株之間的遺傳進(jìn)化特征；構(gòu)建基于PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白基因NSP2高變區(qū)、結(jié)構(gòu)蛋白GP3及GP5編碼基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，用DNAstar軟件分析比對PRRSV全基因組、NSP2高變區(qū)、結(jié)構(gòu)蛋白GP3及GP5編碼基因序列核苷酸及推導(dǎo)氨基酸的同源性。所選取的PRRSV毒株信息見表1。

表1 我國分離的34株P(guān)RRSV基因組序列信息

2 結(jié)果

2.1 病毒分離培養(yǎng)特性及毒價(jià)測定

將研磨處理后的肺部組織病料接種于Marc-145細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)。在病料接種3～4 d后細(xì)胞開始出現(xiàn)聚集，同時(shí)變圓、脫落，經(jīng)連續(xù)傳代3代后，病毒能穩(wěn)定適應(yīng)細(xì)胞，并產(chǎn)生典型的CPE（圖1-A、B）。將形成穩(wěn)定CPE的培養(yǎng)物接種Marc-145細(xì)胞，培養(yǎng)5 d后完成毒價(jià)測定。經(jīng)檢測，其在96孔細(xì)胞板的毒價(jià)為10-4.88TCID50/0.1 mL。IFA結(jié)果（圖1-C、D）顯示，該病毒能與PRRSV陽性血清發(fā)生反應(yīng)，且細(xì)胞膜的熒光強(qiáng)度較細(xì)胞核更強(qiáng)。結(jié)果表明，該病毒的中和抗原主要表達(dá)于細(xì)胞膜。

2.2 RT-PCR鑒定

對連續(xù)培養(yǎng)3代的病毒分離物，分別提取病毒（本試驗(yàn)分離株及PRRSV對照毒株YN-1）培養(yǎng)上清及細(xì)胞沉淀總RNA，經(jīng)2對鑒定引物擴(kuò)增NSP2基因高變區(qū)后獲得了與預(yù)期相符的條帶，分別為439和218 bp，陰性對照未見擴(kuò)增（圖2）。與經(jīng)典毒株相比，本試驗(yàn)分離株和YN-1株均為缺失90 bp的強(qiáng)毒株。分離株擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收完成測序驗(yàn)證，所得序列經(jīng)Blast分析比對，最后確定為高致病性PRRSV，將其命名為云南孟連分離株（YNML-2018株）。

2.3 YNML-2018株遺傳進(jìn)化分析

通過全序列測定獲得YNML-2018株全基因組序列，發(fā)現(xiàn)完成全序列拼接后的病毒全基因組大小為15 357 bp。采用DNAstar和MEGA 11軟件分別完成YNML-2018株與我國主要流行PRRSV毒株全基因組序列、NSP2高變區(qū)、GP3及GP5蛋白編碼基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列比對分析。結(jié)果（表2）顯示：分離株YNML-2018全序列核苷酸與近年來我國流行的PRRSV毒株的同源性為95.3%～99.3%，其中同源性最低的為湖北省2012年分離的高致病性毒株HZ-31（95.3%），最高的為廣西分離株GX1003（99.3%）；YNML-2018株與近年來云南省地方分離毒株同源性較高，變異程度較低，核苷酸同源性為98.9%～99.0%，但與早期國內(nèi)經(jīng)典株S1有較大變異，核苷酸同源性僅為89.2%。YNML-2018株NSP2基因高變區(qū)長度為1 340 bp，與國內(nèi)早期流行毒株相比，其基因組有不同程度的堿基缺失，分別是在第2 778～2 780 nt處缺失了3個(gè)堿基（TTT），編碼1個(gè)氨基酸（苯丙氨酸），以及在第2 947～3 033 nt處缺失了87個(gè)堿基，編碼27個(gè)氨基酸（圖3），這與近年來的報(bào)道一致。NSP2高變區(qū)氨基酸分析結(jié)果（表2）顯示：YNML-2018株與近年來國內(nèi)流行的高致病性PRRSV毒株氨基酸同源性為92.1%～97.8%，同源性最低的為湖北省2012分離毒株HZ-31（92.1%），最高的為河北分離株HEB-2013（97.8%）；與早期經(jīng)典株S1相比出現(xiàn)較大變異，氨基酸同源性僅為69.5%。GP3、GP5蛋白氨基酸序列分析結(jié)果（表2）顯示：YNML-2018株結(jié)構(gòu)蛋白GP3氨基酸序列與我國近期流行的高致病性PRRSV毒株同源性為84.3%～99.6%，其中較低的為湖北省分離的高致病性毒株HZ-31（84.3%），最高的為云南分離株YNPL2016（99.6%）；結(jié)構(gòu)蛋白GP5氨基酸序列與我國近期流行的高致病性PRRSV毒株同源性為83.1%～99.0%，其中較低的為湖北高致病性毒株HZ-31（83.1%），最高的為河北分離株TS01（99.0%），但與廣東省重組毒株QYYZ相比出現(xiàn)較大變異，氨基酸同源性僅為81.1%。

表2 PRRSV YNML-2018株與國內(nèi)流行株基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸同源性分析結(jié)果 單位：%

圖3 分離株YNML-2018 NSP2高變區(qū)氨基酸同源性比較結(jié)果

圖4 基于NSP2高變區(qū)、GP3及GP5蛋白編碼基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 分離株YNML-2018部分基因系統(tǒng)發(fā)育樹

基于NSP2基因1 340 bp高變異區(qū)、GP3及GP5蛋白編碼基因ORF序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析遺傳進(jìn)化特征。基于NSP2高變區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，YNML-2018分離株與近年來我國分離的高致病性毒株HEB-2013、Shaanxi-2遺傳距離最近，與經(jīng)典株CH-1a及疫苗株CH-1R遺傳距離較遠(yuǎn)，與S1株遺傳距離最遠(yuǎn)（圖4-A）。基于GP3蛋白編碼基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，YNML-2018分離株與Shaanxi-2及近年來云南省流行株YNSM2016遺傳距離較近，與S1及HN1株遺傳距離最遠(yuǎn)（圖4-B）；基于GP5蛋白編碼基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，YNML-2018分離株與GXBB16-1及云南省流行株YNPL2016遺傳距離較近，與S1及HN1株遺傳距離較遠(yuǎn)，與重組毒株QYYZ遺傳距離最遠(yuǎn)（圖4-C）。以上遺傳進(jìn)化分析表明，云南省邊境地區(qū)PRRSV分離株YNML-2018與2006年首次報(bào)道的高致病性代表 毒株JXA1等國內(nèi)流行株具有較近的遺傳距離，與云南省報(bào)道的流行毒株存在一定變異，但變異程度較低，仍與國內(nèi)流行毒株高度同源。

3 討論

PRRSV基因組為單股正鏈RNA，全長約15 kb，含8個(gè)ORF。不同毒株基因組存在較大差異，其中NSP2蛋白的氨基酸序列在美洲株和歐洲株之間的同源性僅為32%[5]。鑒于PRRSV的高變異性，針對病原學(xué)的研究需要增強(qiáng)。借助成熟的二代測序技術(shù)，獲得病原基因組信息，以此分析優(yōu)勢流行毒株病原生物學(xué)特征，可為PRRS的綜合防治及疫苗選擇提供科學(xué)依據(jù)。本研究中，針對云南省邊境地區(qū)發(fā)生的典型病例完成了病原分離鑒定，并對其基因組全序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，明確了云南省邊境地區(qū)高致病性PRRSV病原學(xué)生物特征。

從2006年將以高熱為典型特性并伴有較高死亡率的病原確定為NSP2高變區(qū)基因缺失的PRRSV以來，NSP2序列越來越成為研究熱點(diǎn)。研究[10，12]表明，從1995年首次完成病毒分離至2006年期間，我國流行的主要是以CH1a毒株為代表的經(jīng)典株；2006年江西省、湖南省等暴發(fā)由高致病性毒株（JXA1毒株）引發(fā)的疫情以來，以基因亞群V為主導(dǎo)的高致病性毒株成為我國及云南省周邊國家的優(yōu)勢流行株，而NSP2序列高變區(qū)的基因缺失是這類毒株的重要特征。云南省分離株YNML-2018序列分析顯示，該毒株NSP2基因高變區(qū)存在90個(gè)堿基缺失，表明其是國內(nèi)近年流行的高致病性毒株；分離株全基因組核苷酸序列分析顯示，其與我國近年來流行的高致病性PRRSV毒株序列同源性較高（92.1%～97.8%），表明盡管存在部分位點(diǎn)突變，但本次分離鑒定的YNML-2018毒株仍為近年來我國主要流行的高致病性毒株。

PRRSV基因組中，由ORF5基因編碼的病毒囊膜糖蛋白GP5可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。在所有結(jié)構(gòu)蛋白基因中ORF5變異程度最大，推測這是由于缺乏RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp），從而缺乏校對功能，導(dǎo)致具有不同致病性的毒株不斷重組及進(jìn)化，使其具有較多表型及基因型[13]。GP5變異所產(chǎn)生的中和抗原變異有助于指導(dǎo)疫苗選用。分離株YNML-2018結(jié)構(gòu)蛋白GP5氨基酸分析顯示，其與近年我國流行的高致病性PRRSV毒株同源性為83.1%～99.0%，與云南省流行株相比，雖有部分點(diǎn)突變發(fā)生，但仍為基因亞群V流行毒株，表明現(xiàn)階段廣泛使用的疫苗仍對其有效。