高朝遠(yuǎn) 關(guān)平印 蒲文江 袁梓珍 羅嗣芳 胡建芳

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,北京 100193)

高等植物開(kāi)花是其生命活動(dòng)中的重要階段,也是由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的重要標(biāo)志[1]。植物只有在適宜的時(shí)期開(kāi)花才能完成授粉受精形成種子,繁衍后代并確保物種的自然延續(xù)[2]。早開(kāi)花可以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中促進(jìn)早坐果、早成熟和早上市從而提高經(jīng)濟(jì)效益[3-4]。另外對(duì)于多年生實(shí)生繁殖的果樹(shù)而言,由于存在著較長(zhǎng)的童期,提早開(kāi)花可以縮短育種周期,提高育種效率,節(jié)約土地,獲得早期豐產(chǎn)[5-6]。因此,研究植物的早花對(duì)于園藝植物具有重要意義。

植物的開(kāi)花過(guò)程涉及到成花誘導(dǎo)、花發(fā)育和花器官形成等階段,每一個(gè)發(fā)育階段都必須在前一個(gè)階段完成的基礎(chǔ)上而展開(kāi)[7]。目前大多數(shù)研究都集中在成花誘導(dǎo)方面,因?yàn)檫@一階段容易受到外界環(huán)境和植物內(nèi)部信號(hào)共同影響,是比較敏感的時(shí)期,也是調(diào)節(jié)植物開(kāi)花時(shí)間和數(shù)量的關(guān)鍵時(shí)期[1]。對(duì)擬南芥的研究表明,成花誘導(dǎo)主要涉及6條途徑[8],即春化途徑、光周期途徑、赤霉素途徑、自主途徑、溫敏途徑和年齡途徑。這些途徑彼此獨(dú)立又相互交聯(lián)構(gòu)成復(fù)雜而精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[9-10]。雖然模式植物的成花途徑已經(jīng)相當(dāng)清晰,但對(duì)于多年生果樹(shù)而言其成花途徑有別于一、二年生植物。因?yàn)楣麡?shù)一旦度過(guò)童期或營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段每一年都循環(huán)往復(fù)地進(jìn)行花芽分化、休眠、萌芽、開(kāi)花坐果和果實(shí)成熟等,并且果樹(shù)的花芽分化時(shí)間較長(zhǎng),一般需要跨越2個(gè)年度,因此果樹(shù)的成花調(diào)控途徑可能更為復(fù)雜。但目前對(duì)多年生果樹(shù)的成花調(diào)控途徑還缺乏系統(tǒng)的研究。

成花調(diào)控網(wǎng)是由自身遺傳因素和環(huán)境因素共同決定的復(fù)雜過(guò)程,其內(nèi)在原因是通過(guò)一系列成花基因在時(shí)間和空間上按特定順序進(jìn)行特異表達(dá)從而精準(zhǔn)調(diào)控植物的開(kāi)花[11]。目前對(duì)擬南芥6條成花途徑中不同成花基因的表達(dá)順序和功能都有較系統(tǒng)和清晰的研究。在這些途徑中存在著一些成花信號(hào)整合因子,如CONSTANS(CO)、FlOWERINGLOCUST(FT)、SUPPRESSOROFCONSTANS1(SOC1)、LEAFY(LFY)、SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE(SPL)、TERMINALFLOWER1(TFL1)和FLOWERINGLOCUSC(FLC)等[12],它們對(duì)植物開(kāi)花起著關(guān)鍵作用。在這些基因中既有促進(jìn)成花的基因也有抑制成花的基因。對(duì)擬南芥的研究表明,至少有180個(gè)以上的基因可能參與了開(kāi)花調(diào)控的過(guò)程[8]。但由于果樹(shù)在花芽分化中經(jīng)歷的內(nèi)外環(huán)境復(fù)雜而多變,加之果樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化較為困難,耗時(shí)長(zhǎng),不宜重復(fù)驗(yàn)證,對(duì)于成花基因的研究大多參照模式植物進(jìn)行,多數(shù)成花基因在果樹(shù)中的具體功能還不清楚。

植物的開(kāi)花除了受到成花基因的調(diào)控,還受到寒冷、干旱、鹽分和病原體感染等環(huán)境脅迫影響[12-15]。擬南芥中的核因子Y(Nuclear factor Y)包括NF-YB2和NF-YB3,與脅迫應(yīng)答有關(guān),通常它們需要形成同源或異源二聚體或三聚體才能發(fā)揮作用。近期的研究發(fā)現(xiàn),CO可以與NF-Y互作[16-17],CO可以代替NF-YA與NF-YB、NF-YC形成三聚復(fù)合物,YB2與YB3通過(guò)招募CO結(jié)合到FT啟動(dòng)子上,促進(jìn)植物開(kāi)花[18-19]。這表明植物的開(kāi)花調(diào)控還存在著一些未知的領(lǐng)域。

新疆野生櫻桃李(Prunussogdiana)是原產(chǎn)中國(guó)西部天山山脈原始森林中的一種珍貴野生果樹(shù)[21],具有耐瘠薄土壤、抗鹽堿、耐濕、抗寒性強(qiáng)和抗病等特點(diǎn)[21-25]。與杏、梨、桃和櫻桃具有嫁接親和性,可以作為核果類(lèi)果樹(shù)的優(yōu)良砧木[26-27]。前期課題組已從新疆野生櫻桃李實(shí)生抗病單株中克隆得到psoRPM2抗南方根結(jié)線蟲(chóng)基因,并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化鑒定了其功能;同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)psoRPM2基因煙草大多表現(xiàn)為早花[28]。本研究在此基礎(chǔ)上,觀察了新疆野生櫻桃李實(shí)生群體的開(kāi)花類(lèi)型和花芽分化特點(diǎn),分析了新疆野生櫻桃李不同開(kāi)花類(lèi)型的關(guān)鍵成花基因表達(dá),對(duì)轉(zhuǎn)psoRPM2基因煙草的開(kāi)花特性和與早花相關(guān)的成花基因進(jìn)行了研究,同時(shí)探討了psoRPM2與PsoLFY蛋白之間的關(guān)系,闡明了PsoRPM2基因引起的早花現(xiàn)象,以期明確psoRPM2調(diào)控新疆野生櫻桃李開(kāi)花時(shí)期的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

利用定植于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站的新疆野生櫻桃李早花與晚花植株,于2021年6月15號(hào)、7月15號(hào)、8月15號(hào)、9月15號(hào)和10月15號(hào)分別收集花芽與葉芽。一部分用FAA固定,用于石蠟切片的制備;另一部分置于-80 ℃保存用于RNA提取。轉(zhuǎn)psoRPM2基因煙草利用實(shí)驗(yàn)室前期的組培苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1開(kāi)花生物學(xué)性狀及解剖與組織結(jié)構(gòu)觀察

開(kāi)花生物學(xué)性狀是利用本實(shí)驗(yàn)室常年記載的開(kāi)花物候期數(shù)據(jù),通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析,確定不同單株的開(kāi)花特性。同時(shí)利用解剖刀對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的花芽進(jìn)行徒手切片,置于體試鏡下觀察。將固定液(FAA)固定的樣品經(jīng)過(guò)不同濃度的乙醇脫水、二甲苯透明處理、沉浸石蠟和包埋等常規(guī)石蠟切片制作過(guò)程,獲得含有不同試驗(yàn)材料的蠟塊;在切片機(jī)上切成8～12 μm厚的切片,用番紅-固綠染色后封片,在OlympusBX-51光學(xué)顯微鏡觀察和拍照。每個(gè)發(fā)育時(shí)期的花芽各統(tǒng)計(jì)20個(gè)樣品。

1.2.2RNA提取、半定量PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用CTAB法提取新疆野生櫻桃李花芽和葉芽的總RNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)反轉(zhuǎn)成cDNA,用于半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)(RT-qPCR)分析。根據(jù)同源克隆得到的PsoLFY、PsoFT、PsoTFL、PsoFLC、psoRPM2基因序列和在NCBI上查詢到的煙草NtLFY(XM_016593842.1)、NtFT(KC485967.1)、NtTFL(XM_016590731.1)、NtFLC(XM_016599652.1)、NtSOC(NM_001326029.1)、NtSPL(NM_001326256.1)、NtFD(XM_016613899.1)基因序列設(shè)計(jì)RT-PCR和RT-qPCR引物(表1),RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。RT-qPCR反應(yīng)體系使用Applied Biosystems 7500(Thermo Fisher Scientific,40 ℃)進(jìn)行40個(gè)循環(huán),95 ℃預(yù)變性10 s和60 ℃變性30 s。使用2-ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平,使用RPⅡ作為參照基因的標(biāo)準(zhǔn)。用Excel整理數(shù)據(jù),用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行作圖。每個(gè)發(fā)育時(shí)期的花芽和葉芽器官至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 本研究所用引物序列及退火溫度

1.2.3基因克隆與酵母雙雜交

利用上述得到的櫻桃李cDNA模板,分別克隆PsoLFY和PsoRPM2基因,將PsoLFY和PsoRPM2分別構(gòu)建至酵母雙雜pGBKT7和pGAKT7質(zhì)粒上。將BD-PsoLFY與AD-PsoRPM2、陽(yáng)性對(duì)照、BD-empty與AD-PsoRPM2、BD-PsoLFY 與AD-empty、BD-empty與AD-empty轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞,涂布于SD/-Trp/-Leu二缺培養(yǎng)基平板上,30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4～5 d;挑選6個(gè)單菌落于SD/-Trp-Leu-His三缺培養(yǎng)基上,倒置培養(yǎng)3～5 d;將陽(yáng)性克隆再點(diǎn)于SD/-Trp-Leu-His-Ade四缺培養(yǎng)基;對(duì)生長(zhǎng)出來(lái)的菌落進(jìn)行X-α-Gal染色(4 mg/mL,每個(gè)菌落5 μL),通過(guò)顯色分析α-半乳糖苷酶活性,觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對(duì)新疆野生櫻桃李花芽切片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用Graphpad prism 6作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆野生櫻桃李開(kāi)花生物學(xué)性狀

本研究對(duì)定植于上莊實(shí)驗(yàn)站的112株實(shí)生野生櫻桃李開(kāi)花生物學(xué)性狀進(jìn)行觀察,開(kāi)花類(lèi)型分為極早花、早花、中花、晚花和極晚花5種類(lèi)型。2021-03-25拍照發(fā)現(xiàn)極早花類(lèi)型中已有30%以上開(kāi)始露白,早花類(lèi)型中有10%～30%露白,中花類(lèi)型中露白比率不足5%,而晚花類(lèi)型中花芽剛開(kāi)始膨大,極晚花類(lèi)型中大多數(shù)花芽還未有膨大(圖1(a))。對(duì)112株實(shí)生野生櫻桃李不同開(kāi)花類(lèi)型統(tǒng)計(jì)表明,極早花、早花、中花、晚花和極晚花類(lèi)型的比率分別為11%、24%、44%、18%和3%(圖1(b))。極早花與極晚花類(lèi)型的開(kāi)花時(shí)期平均相差10～14 d。

(a)同一時(shí)期極早花、早花、中花、晚花、極晚花的發(fā)育狀態(tài);(b)實(shí)生群體中不同開(kāi)花類(lèi)型所占的比例;(c)同一發(fā)育時(shí)期早花和晚花不同發(fā)育狀態(tài)的統(tǒng)計(jì)分析。條形圖上的小花分別為不同發(fā)育時(shí)期的代表圖。

本研究從早花和晚花類(lèi)型中分別選取2株樹(shù)體在開(kāi)花前的未露白期(平均花蕾直徑(4±1) mm)、露白期(平均花蕾直徑(5±1) mm)、小蕾期(平均花蕾直徑(6±1) mm)和大蕾期(平均花蕾直徑8±1 mm)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示早花類(lèi)型的未露白期、露白期、小蕾期和大蕾期比率分別為2.20%、7.50%、5.20%和85.10%,而晚花類(lèi)型的比例則為19.60%、9.50%、8.30%和62.60%(圖1(c))。

2.2 不同開(kāi)花類(lèi)型早花和晚花植株的花芽分化過(guò)程

由于新疆野生櫻桃李實(shí)生群體存在早開(kāi)花和晚花類(lèi)型,本研究對(duì)早花和晚花類(lèi)型花芽分化過(guò)程的外觀形態(tài)和組織解剖學(xué)形態(tài)進(jìn)行了觀察。利用徒手切片在6月15號(hào)(大約是上一年分化的花芽開(kāi)花后65 d)分別觀察早花和晚花的花芽形態(tài)。此時(shí)早花和晚花都已分化出來(lái)5～7層鱗片,早花植株的生長(zhǎng)點(diǎn)已經(jīng)隆起呈半圓狀,晚花植株的生長(zhǎng)點(diǎn)還沒(méi)有明顯的隆起(圖2(a))。7月15號(hào)早花植株的花芽生長(zhǎng)點(diǎn)已經(jīng)呈現(xiàn)柱狀,并已完成萼片的分化;此時(shí)晚花植株的花芽生長(zhǎng)點(diǎn)才明顯隆起(圖2(b))。到8月15號(hào)早花植株已經(jīng)進(jìn)入到花瓣原基分化期,而此時(shí)晚花植株完成了萼片的分化,還未進(jìn)行花瓣原基的分化(圖2(c))。9月15號(hào)早花植株已經(jīng)進(jìn)入到雄蕊原基分化期,此時(shí)的晚花植株剛進(jìn)入花瓣原基分化期(圖2(d))。到入冬前的10月15號(hào)早花植株已經(jīng)進(jìn)入雌蕊分化期,晚花植株完成了雄蕊分化期(圖2(e))。早花和晚花植株的開(kāi)花狀態(tài)存在明顯不同(圖2(f))。

圖2 新疆野生櫻桃李早花與晚花植株花芽外部及解剖結(jié)構(gòu)

進(jìn)一步利用石蠟切片觀察花芽分化過(guò)程,發(fā)現(xiàn)早花類(lèi)型和晚花類(lèi)型的花芽分化過(guò)程并沒(méi)有明顯差異,都經(jīng)歷了未分化時(shí)期、原基膨大期、萼片原基、花瓣原基、雄蕊原基和雌蕊原基分化期。在未分化期莖端生長(zhǎng)點(diǎn)較小,呈圓錐形,細(xì)胞排列整齊,鱗片緊緊包圍在生長(zhǎng)點(diǎn)外部(圖3(a));其后分生細(xì)胞膨大,生長(zhǎng)點(diǎn)開(kāi)始突起,生長(zhǎng)點(diǎn)變大,此時(shí)外部的芽鱗片向外擴(kuò)展變得疏松(圖3(b));隨著生長(zhǎng)點(diǎn)的繼續(xù)變寬變大,突起明顯呈現(xiàn)半圓形(圖3(c));之后生長(zhǎng)點(diǎn)逐漸變長(zhǎng)、變寬、頂端扁而平,在生長(zhǎng)點(diǎn)外圍開(kāi)始凸起即為萼片原基(圖3(d));隨著萼片原基的不斷向內(nèi)彎曲分化,在伸長(zhǎng)的萼片原基內(nèi)側(cè)產(chǎn)生新一輪凸起即為花瓣原基(圖3(e));在花瓣原基內(nèi)側(cè)繼續(xù)分化形成新的凸起分化出雄蕊原基(圖3(f));其后雄蕊原基繼續(xù)分化(圖3(g));隨后分化雌蕊原基(圖3(h));分化完全的花芽包括鱗片、花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊原基(圖3(i)和(j));隨后在雌蕊原基中央開(kāi)始分化心皮邊緣組織(圖3(k));進(jìn)一步心皮邊緣組織融合形成單心皮子房(圖3(l))。

根據(jù)對(duì)早花和晚花類(lèi)型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),6月15日早花和晚花類(lèi)型花芽大多數(shù)處于未分化階段,其比率分別為89%和95%。7月15日早花類(lèi)型有70%處于分化初期,而晚花類(lèi)型的70%處于分化初期。到8月15日早花類(lèi)型有60%處于花瓣原基分化期,并且有30%的花芽已經(jīng)進(jìn)入雄蕊原基分化期;此時(shí)晚花類(lèi)型的60%花芽處于萼片原基分化期,有10%花芽處于花瓣原基分化期,沒(méi)有花芽進(jìn)入雄蕊原基分化期。9月15日早花類(lèi)型的70%處于雄蕊原基分化期,有15%的花芽進(jìn)入雌蕊原基分化期;晚花類(lèi)型的70%花芽處于花瓣原基分化期,23%的花芽進(jìn)入雄蕊原基分化期,沒(méi)有雌蕊原基分化期的花芽。到10月15日早花類(lèi)型已經(jīng)有90%的花芽完成了雌蕊原基的分化,而晚花類(lèi)型只有60%的花芽完成雌蕊原基的分化(表2)。

表2 不同發(fā)育時(shí)期早花和晚花類(lèi)型花芽分化所占比例

2.3 相關(guān)成花基因在野生櫻桃李早花和晚花花芽中的表達(dá)

對(duì)早花和晚花花芽分化過(guò)程中相關(guān)成花基因的表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,PsoLFY基因在7月15日和8月15日的早花花芽中其表達(dá)高于晚花,但在9月15日和10月15日的早花花芽中其表達(dá)量卻低于晚花類(lèi)型(圖4(a))。PsoFT基因表達(dá)與PsoLFY基因相似,但在7月15日和8月15日的早花花芽中的PsoFT與晚花相比差距更大(圖4(b))。PsoFLC基因在7月15日的早花花芽中表達(dá)量高于晚花類(lèi)型,其余的8月15日、9月15日和10月15日PsoFLC基因的表達(dá)都是晚花高于早花類(lèi)型(圖4(c))。PsoTFL基因表達(dá)在早花與晚花花芽中差別不大(圖4(d))。

誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)。數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2.4 轉(zhuǎn)PsoRPM2基因煙草可以提早開(kāi)花

本研究將PsoRPM2基因轉(zhuǎn)入煙草導(dǎo)致出現(xiàn)早花現(xiàn)象,共得到5個(gè)轉(zhuǎn)基因植系。對(duì)轉(zhuǎn)PsoRPM2基因煙草的早花性狀進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),其中有1、2和5株系表現(xiàn)為早花,從愈傷再生到植株開(kāi)花需要的天數(shù)分別為64、59和57 d,平均開(kāi)花天數(shù)為60 d。而普通煙草在相同環(huán)境條件(4 000 LX光照強(qiáng)度、16 h光照時(shí)間、25 ℃)下生長(zhǎng)1年左右時(shí)間才能開(kāi)花(圖5(a))。轉(zhuǎn)基因株系3和4未表現(xiàn)為早花。另外3個(gè)轉(zhuǎn)PsoRPM2基因煙草在株高、葉片數(shù)和節(jié)間數(shù)方面都比同一時(shí)期的對(duì)照要多,尤其是花序數(shù)明顯高于對(duì)照(圖5(c))。

(a)野生型和轉(zhuǎn)PsoRPM2基因煙草表型圖;(b)PsoRPM2基因在不同轉(zhuǎn)基因煙草株系中的表達(dá)情況;(c)野生型和轉(zhuǎn)PsoRPM2基因煙草株系5生理性狀統(tǒng)計(jì)圖;(d)RT-PCR分析開(kāi)花相關(guān)基因在野生型和轉(zhuǎn)PsoRPM2基因煙草株系5花芽和葉芽中的表達(dá)情況;(e)RT-qPCR分析開(kāi)花相關(guān)基因及PsoRPM2基因在野生型和轉(zhuǎn)PsoRPM2基因煙草株系5花芽中的表達(dá)情況。株系W38為野生型煙草,株系1、2和5分別為轉(zhuǎn)基因煙草。

對(duì)轉(zhuǎn)PsoRPM2基因煙草花芽和葉芽中的相關(guān)成花基因進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果顯示,在葉芽中所有成花基因在轉(zhuǎn)PsoRPM2基因和對(duì)照之間沒(méi)有差異;但在花芽中,PsoLFY和PsoTFL基因在轉(zhuǎn)PsoRPM2基因和對(duì)照之間存在差異,而PsoSOC、PsoFLC、PsoSPL、PsoFT和PsoFD基因在兩者之間都沒(méi)有明顯差異(圖5(d))。進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR分析轉(zhuǎn)基因株系3花芽中的成花基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)PsoLFY和PsoFT基因在轉(zhuǎn)PsoRPM2基因煙草花芽中的表達(dá)明顯高于對(duì)照,而PsoFLC和PsoTFL基因表達(dá)則明顯低于對(duì)照(圖5(e))。

2.5 野生櫻桃李早花和晚花類(lèi)型芽中的PsoRPM2基因表達(dá)

上述研究表明轉(zhuǎn)PsoRPM2基因煙草可以促進(jìn)植物提前開(kāi)花,本研究進(jìn)一步分析野生櫻桃李早花和晚花花芽與葉芽中的PsoRPM2基因表達(dá)。結(jié)果顯示,在6月15日PsoRPM2基因的表達(dá)量最低,同時(shí)在早花和晚花類(lèi)型的花芽中其表達(dá)量幾乎沒(méi)有差異。到7月15日早花類(lèi)型花芽中的PsoRPM2基因表達(dá)明顯高于晚花類(lèi)型,兩者之間的差距最大。

在8月15日早花類(lèi)型略高于晚花類(lèi)型,但到9月15日和10月15日時(shí)早花和晚花類(lèi)型花芽中的PsoRPM2基因表達(dá)幾乎沒(méi)有差異(圖6(a))。在早花和晚花類(lèi)型的葉芽中PsoRPM2基因表達(dá)沒(méi)有明顯差異(圖6(b))。

2.6 野生櫻桃李PsoLFY與PsoRPM2的酵母雙雜分析

由于轉(zhuǎn)PsoRPM2基因株系花芽中的LFY基因表達(dá)明顯高于對(duì)照,同時(shí)在新疆野生櫻桃李7月15日成花誘導(dǎo)的花芽中PsoRPM2基因表達(dá)明顯高于晚花,本研究認(rèn)為轉(zhuǎn)PsoRPM2基因植株之所以早花可能與LFY基因表達(dá)有關(guān)。因此進(jìn)行了酵母雙雜試驗(yàn),結(jié)果顯示PsoRPM2與PsoLFY可以進(jìn)行互作(圖7)。

3 討論與結(jié)論

野生資源是獲得果樹(shù)重要抗逆性狀的主要來(lái)源,是人們選育新品種開(kāi)展生物技術(shù)研究的主要基因來(lái)源[29]。新疆櫻桃李原產(chǎn)于天山野果林,在中國(guó)僅分布在新疆伊犁地區(qū)霍城縣境內(nèi)婆羅科努山的大西溝和小西溝,這一地區(qū)屬于溫帶荒漠區(qū),野生果樹(shù)資源十分豐富,是栽培蘋(píng)果、杏、核桃、歐洲李和櫻桃李的起源中心,對(duì)研究果樹(shù)的起源、進(jìn)化和演變具有重要意義[30-31]。在自然界,野生櫻桃李主要通過(guò)自然實(shí)生繁衍后代,形成了植株性狀、果實(shí)形狀、顏色、枝條和花等特征多種多樣的群體[32-33]。本研究通過(guò)對(duì)新疆野生櫻桃李物候期的觀察,發(fā)現(xiàn)其開(kāi)花時(shí)間存在著較大差別,早開(kāi)花和晚開(kāi)花的類(lèi)型開(kāi)花時(shí)間大約相差14 d,表明新疆野生櫻桃李開(kāi)花生物學(xué)具有多樣性。同時(shí)在植株高矮、枝條生長(zhǎng)與節(jié)間長(zhǎng)短、花形態(tài)、果實(shí)顏色和大小等方面也存在著較大差異[34]。

植物開(kāi)花時(shí)間與花芽分化密切相關(guān),花芽分化的進(jìn)程是決定開(kāi)花時(shí)間的主要因素[35]。從新疆野生櫻桃李花芽分化的階段來(lái)看,早開(kāi)花與晚開(kāi)花類(lèi)型之間沒(méi)有明顯差異,兩者都經(jīng)歷了未分化期、分化前期、分化初期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期,這一結(jié)果與李會(huì)芳等[35]和莫文娟等[36]的研究一致。但在花芽分化進(jìn)程方面,早花類(lèi)型各階段的分化時(shí)期明顯早于晚花類(lèi)型,這可能是導(dǎo)致早花植株提前開(kāi)花的原因之一。

成花基因在時(shí)間和空間上的特異表達(dá)對(duì)調(diào)控植物的開(kāi)花起重要作用[10]。LFY基因是成花途徑中的關(guān)鍵基因,從多種植物中克隆并分析了LFY同源基因的功能[37]。在擬南芥中LFY基因在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段表達(dá)微弱,在花分生組織中有較強(qiáng)的表達(dá)[38]。在桃樹(shù)和山核桃中同源的LFY基因主要在成花誘導(dǎo)期及花芽形態(tài)分化初期表達(dá)[39-40]。FT和TFL1基因均屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(Phosphatidyle-thanolamine-binding protein,PEBP)家族成員,具有保守的PEBP結(jié)構(gòu)域,是開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下游的2個(gè)重要基因,在調(diào)節(jié)植物開(kāi)花中也起重要作用。FT與TFL1功能正好相反。FT促進(jìn)成花轉(zhuǎn)換并啟動(dòng)花發(fā)育,而TFL1抑制花原基形成[41]。其原因在于FT與TFL1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FLOWERING LOCUS D (FD),從而調(diào)控下游LEAFY(LFY)基因的表達(dá)[42]。FLC基因是春花途徑中的關(guān)鍵基因,是抑制植物開(kāi)花的基因,這種抑制是通過(guò)FLC基因抑制下游FT和SOC1這2個(gè)促進(jìn)開(kāi)花基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。本研究中,PsoLFY和PsoFT基因在花芽分化前期(7月15日和8月15日),早花植株花芽中的表達(dá)高于晚花。此時(shí),正值大多數(shù)早花植株花芽處于花芽誘導(dǎo)分化和花原基形成期,表明PsoLFY和PsoFT基因在新疆野生櫻桃李成花誘導(dǎo)和花原基形成階段起重要作用。PsoTFL基因在早花和晚花植株花芽中的表達(dá)幾乎沒(méi)有差別,表明該基因?qū)﹂_(kāi)花時(shí)間的影響作用較小。而PsoFLC基因在7月15日的早花花芽中其表達(dá)量高于晚花類(lèi)型,在其后的花芽分化階段都是晚花植株中的表達(dá)高于早花植株,并且這種差異隨著環(huán)境溫度的降低逐漸加大。表明PsoFLC基因在環(huán)境溫度較高的時(shí)期對(duì)花芽分化的影響作用較小,而在溫度較低的階段其抑制花芽分化的作用更明顯。

植物在環(huán)境脅迫下通常為了逃避逆境會(huì)加速生長(zhǎng)提前開(kāi)花,使植物能夠適當(dāng)?shù)乜s短生長(zhǎng)周期以應(yīng)對(duì)脅迫[43]。在擬南芥中干旱脅迫可以加速植株開(kāi)花,脫落酸(ABA)結(jié)合因子ABF3和ABF4通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)花整合抑制因子FCONSTANS1(SOC1)基因的過(guò)度表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)干旱時(shí)的開(kāi)花。表明ABFs和SOC1通過(guò)介導(dǎo)ABA信號(hào)加速開(kāi)花,從而減輕干旱脅迫對(duì)繁殖產(chǎn)生的不利影響[44]。另外ABA還可以通過(guò)促進(jìn)FLC的表達(dá)延遲開(kāi)花[45]。本研究對(duì)PsoRPM2基因引起轉(zhuǎn)基因植株提早開(kāi)花的現(xiàn)象研究發(fā)現(xiàn),60%的轉(zhuǎn)psoRPM2基因植株表現(xiàn)為早花,同時(shí)轉(zhuǎn)基因煙草花芽中的LFY基因表達(dá)量高于對(duì)照;而其余成花基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)與對(duì)照差異不大,表明在psoRPM2基因存在的植株中LFY基因可能對(duì)開(kāi)花起著重要作用。同時(shí)對(duì)新疆野生櫻桃李早花與晚花單株分析psoRPM2基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn),在花芽分化的誘導(dǎo)期(7月15日)早花花芽中的psoRPM2基因表達(dá)明顯高于晚花,并且在7月15日和8月15日早花花芽中的PsoLFY和PsoFT基因表達(dá)也高于晚花,說(shuō)明psoRPM2基因可能與這2個(gè)基因存在著某種聯(lián)系。通過(guò)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)表明PsoRPM2與PsoLFY可以發(fā)生互作,但PsoRPM2與PsoFT之間沒(méi)有互作(結(jié)果未列出)。表明PsoRPM2可以通過(guò)與PsoLFY發(fā)生互作影響開(kāi)花。

綜上,本研究表明新疆野生櫻桃李早花的原因在于花芽分化誘導(dǎo)期通過(guò)PsoRPM2與PsoLFY互作,提高了花芽中PsoLFY和PsoFT基因的表達(dá),加快了花芽形態(tài)分化進(jìn)程,從而導(dǎo)致植株早花。