李 素 許騰飛 侯圣凡 董振飛 趙曉麗 李 楠 王紅清*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,北京 100193;(2.北京萬德園農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司,北京 102211)

草莓是薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)的多年生宿根草本植物,其口感多汁,營養(yǎng)豐富,栽培面積廣,可鮮食可加工,是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]。草莓產(chǎn)業(yè)在中國發(fā)展迅速,根據(jù)FAO統(tǒng)計(jì),2020年草莓在中國大陸的種植面積是126 644 hm2,產(chǎn)量是3 326 816 t,種植面積和產(chǎn)量超過世界總量的1/3,穩(wěn)居世界第一[2]。草莓生產(chǎn)中主要通過母株抽生的匍匐莖獲得子苗,母株的病毒可以通過子苗進(jìn)行擴(kuò)散,再加上蚜蟲和粉虱等傳毒介體的大范圍活動導(dǎo)致病毒大面積傳播,這意味著草莓一旦感染病毒就會導(dǎo)致病毒在田間大肆蔓延。草莓病毒多為復(fù)合侵染,感病草莓表現(xiàn)為畸形、矮化、斑駁、皺縮和生長緩慢,甚至全株死亡等癥狀[3]。優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的草莓才具有經(jīng)濟(jì)價值和營養(yǎng)價值,而病毒病是導(dǎo)致草莓產(chǎn)量和品質(zhì)下降的主要因素[4]。

已報道能夠侵染草莓的病毒有30多種。常見的有草莓鑲脈病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)、草莓斑駁病毒(strawberry mottle virus,SMoV)、草莓皺縮病毒(strawberry crinkle virus,SCV)和草莓輕型黃邊病毒(strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)等,其中SCV在中國的檢出率較低[5]。檢測技術(shù)的升級和栽培地區(qū)的擴(kuò)大導(dǎo)致草莓中不斷有新的病毒株系和病毒種類被發(fā)現(xiàn)。草莓白化病毒(strawberry pallidosis-associated virus,SPaV)在澳大利亞、歐洲和美洲分布,2017年在中國發(fā)現(xiàn)了草莓白化病毒感染[6-8]。草莓病毒1(strawberrry virus 1,StrV-1),也被稱為草莓伴隨病毒1號(strawberry-associated virus 1,SaV1),是自2019年以來在捷克共和國和中國報道的一種感染草莓的新病毒[9-11]。2022年蕓薹黃化病毒(brassica yellows virus,BrYV)感染草莓首先在中國被報道,其分布和對草莓的影響有待進(jìn)一步研究[12]。

病毒檢測是病毒病防治和脫毒苗生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié),目前沒有有效方法可以治愈病毒病,田間植株一旦感染病毒將終生帶毒且無法脫除,因此病毒檢測對草莓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有重要作用。草莓病毒病檢測方法包括指示植物檢測法、電鏡檢測法、血清學(xué)檢測法和分子生物學(xué)檢測法。PCR技術(shù)具有靈敏、特異和簡單等優(yōu)點(diǎn),是生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的草莓病毒檢測技術(shù)[13]。單重PCR一次只能針對一種病毒進(jìn)行特異性檢測,當(dāng)需要進(jìn)行多種病毒檢測時,使用單重PCR試驗(yàn)耗時過長且耗材過多,因此建立能夠同時檢測多種病毒的多重PCR檢測方法具有重要意義。

多重PCR是在一個PCR中加入多對引物,對多個模板進(jìn)行擴(kuò)增,從而實(shí)現(xiàn)同時檢測多種病毒。多重PCR比單重PCR更高效經(jīng)濟(jì)。由于引物之間的相互配對、競爭性擴(kuò)增以及不同模板的最適擴(kuò)增條件不同,建立一套穩(wěn)定的多重PCR反應(yīng)體系較困難,需要對特異性引物、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件等進(jìn)行篩選優(yōu)化。多重PCR并不是單重PCR的簡單混合,引物設(shè)計(jì)是決定多重?cái)U(kuò)增效果的關(guān)鍵因素,并且多重條帶大小之間需要存在差異以便電泳區(qū)分[14]。本研究根據(jù)病毒的基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物并調(diào)整引物比例,首次建立了一種能夠同時檢測SVBV、SMoV、SMYEV、SPaV、StrV-1和BrYV的多重PCR方法,為草莓的田間病毒檢測和脫毒苗診斷提供了一種快速經(jīng)濟(jì)的分子生物學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的草莓植株來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊試驗(yàn)站,包括‘紅顏’‘章姬’‘哈尼’‘全明星’等品種。2022年3—5月期間,采摘100株有病癥的幼嫩草莓葉片由冰盒保存運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室,將葉片進(jìn)行液氮冷凍處理后放在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA提取

草莓葉片總RNA提取采用OMEGA的E.Z.N.A.?Plant RNA Kit(Omega Bio-tek,Georgia,USA),并參照說明書進(jìn)行。

1.2.2反轉(zhuǎn)錄

采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Takara,China)合成cDNA。反應(yīng)體系為:RNA 2 μL,5×M-MLV buffer(Promega)4 μL,dNTP Mix(2.5 mmol)1 μL,隨機(jī)引物(10 μmol)0.5 μL,Oligo(dT)18引物(10 μmol)0.5 μL,M-MLV Reverse transcriptase和RNase inhibitor 各0.5 μL,使用RNase free water補(bǔ)足體系至20 μL;充分混勻后,瞬時離心,37 ℃孵育1 h后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI中SVBV(GenBank Accession No.FM867860.1)、SMoV(GenBank Accession No.AJ311876.1)、SMYEV(GenBank Accession No.D12517.1)、SPaV(GenBank Accession No.MN747002.1)、StrV-1(GenBank Accession No.MW795715)和BrYV(GenBank Accession No.ON060762)的基因組序列,將保守區(qū)域通過Primer Premier 6.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)。引物長度在18～25 bp,GC含量在40%～60%。引物由擎科生物有限公司合成。

1.2.4單重PCR檢測

對于單重PCR,每種病毒都建立了20 μL的反應(yīng)體系,包括:2×SanTaq PCR Master Mix(Sangon Biotech,China)10 μL,正向引物1 μL(10 μmol/L),反向引物1 μL(10 μmol/L),模板1 μL(10 ng/μL),ddH2O 7 μL。對于多重PCR,20 μL的反應(yīng)混合物中包括:2×SanTaq PCR Master Mix 10 μL,引物混合物4 μL(10 μmol/L),其中上下游引物各包括SVBV 0.25 μL、SMoV 0.50 μL、SMYEV 0.10 μL、SPaV 0.15 μL、StrV-1 0.50 μL、BrYV 0.50 μL,模板1 μL(10 ng/μL),ddH2O為5 μL。

PCR儀(BIO-RAD,T100,USA)的程序設(shè)定為:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸120 s,最后72 ℃延伸10 min,循環(huán)數(shù)為35。反應(yīng)結(jié)束后放在4 ℃冰箱保存。

取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,檢測擴(kuò)增結(jié)果。其中瓊脂糖凝膠濃度為2%,加入1/20 000體積的核酸染色劑Gelred(Tsingke,China),電泳緩沖液為1×TAE緩沖液。電泳電壓設(shè)置為120 V,電泳時間為50 min,最后通過凝膠圖像分析儀器(YPH-BIO,Tanon 1600,China)拍照成像。

1.2.5多重PCR引物濃度的優(yōu)化

對于多重PCR,20 μL的反應(yīng)體系包括2×SanTaq PCR Master Mix 10 μL,6種病毒的重組質(zhì)粒各1 μL(10 ng/μL),正向引物(10 μmol/L)和反向引物(10 μmol/L)添加量參照表2計(jì)算,以進(jìn)行多重PCR引物濃度的優(yōu)化,PCR程序與單重PCR一致。引物添加量計(jì)算公式如下:

表2 病毒多重PCR的不同引物濃度組合

引物添加量(μL)=C1×V/C2

(1)

式中:C1為引物終濃度,μmol/μL;V為反應(yīng)總體積,為20 μL;C2為引物初始濃度,為10 μmol/μL。

1.2.6多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

在單重PCR程序的基礎(chǔ)上,設(shè)置了不同的退火時間(30、35、40和45 s)、延伸時間(75、90、105、120、135和150 s)、退火溫度(50、53、55、58和60 ℃)和延伸溫度(68、70和72 ℃)進(jìn)行多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。

1.2.7多重PCR靈敏度檢測

將6種病毒的重組質(zhì)粒(10 ng/μL)通過雙蒸水10倍梯度系列稀釋為101～10-4ng/μL,等體積混合后用于多重PCR的靈敏度檢測。計(jì)算公式如下:

靈敏度(copies/μL)=L×(C×10-9)/MW

(2)

式中:L為阿伏伽德羅常數(shù);C為質(zhì)粒質(zhì)量濃度,ng/μL;MW為平均分子量,g/mol。

1.2.8PCR產(chǎn)物的克隆和序列分析

6種病毒經(jīng)過單重PCR擴(kuò)增后,經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測,純化回收(Tsingke,China)后連接到pMD18-T(Takara,China)載體上;轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Biomed,China),挑取陽性克隆進(jìn)行PCR檢測,將含有目的片段的大腸桿菌送擎科生物有限公司測序;通過NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫的BLAST搜索(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.go-v/Blast.cgi)驗(yàn)證這些序列,將測序結(jié)果正確的大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒提取(Tsingke,China)。

1.2.9多重PCR的田間樣品檢測

從已知感病情況的田間草莓中選取單一或者混合感染的12株樣品,通過上述的多重PCR方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性擴(kuò)增

為了檢驗(yàn)引物的特異性,對每對引物都進(jìn)行了單重PCR檢測。從6株感染單一病毒的草莓植株中獲得了預(yù)期大小的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,其中SVBV為278 bp,SMoV為394 bp,SPaV為517 bp,BrYV為609 bp,SMYEV為861 bp,StrV-1為1 162 bp;從6株健康草莓植株中未獲得擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。上述PCR產(chǎn)物均通過了測序驗(yàn)證,表明表1中的引物符合多重PCR的檢測規(guī)則。

M:D2000 DNA marker;泳道1～6:感病草莓植株的SVBV、SMoV、SPaV、BrYV、SMYEV和StrV-1引物特異性擴(kuò)增;泳道7～12:健康草莓植株的SVBV、SMoV、SPaV、BrYV、SMYEV和StrV-1引物特異性擴(kuò)增。

2.2 多重PCR引物濃度優(yōu)化

相較于其它引物組合,組合4中當(dāng)上下游引物終濃度SVBV為0.125 μmol/L、SMoV為0.250 μmol/L、SMYEV為0.050 μmol/L、SPaV為0.075 μmol/L、StrV-1為0.250 μmol/L和BrYV為0.250 μmol/L時,6種病毒實(shí)現(xiàn)了同步擴(kuò)增,擴(kuò)增條帶清晰明亮(圖2)。因此選擇組合4的反應(yīng)體系進(jìn)行后續(xù)多重PCR條件的優(yōu)化。

M:D2000 DNA marker;泳道1～8:不同引物濃度組合的擴(kuò)增結(jié)果;泳道9:健康樣品。

2.3 多重PCR條件的優(yōu)化

2.3.1退火時間

在多重PCR反應(yīng)中設(shè)計(jì)了不同的退火時間(30、35、40和45 s),結(jié)果表明6種病毒都能擴(kuò)增得到單一明亮的條帶,擴(kuò)增效果差異不大。從節(jié)省時間考慮,退火時間采用30 s(圖3)。

M:D2000 DNA marker;泳道1～4:退火時間分別為30、35、40和45 s;泳道5:健康樣品。

2.3.2延伸時間

在退火時間采用30 s的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)了不同的延伸時間(75、90、105、120、135和150 s),在這些延伸時間內(nèi),6種病毒都能良好擴(kuò)增,其中延伸時間為120 s的條帶亮度最好,擴(kuò)增效果最佳(圖4)。

M:D2000 DNA marker;泳道1～6:延伸時間分別為75、90、105、120、135和150 s;泳道7:健康樣品。

2.3.3退火溫度

在退火和延伸時間確定的前提下,本研究設(shè)計(jì)了一系列的退火溫度(50、53、55、58和60 ℃)。當(dāng)溫度在50～58 ℃時,6種病毒都能特異性擴(kuò)增。但是退火溫度在50 ℃時StrV-1條帶微弱,在58 ℃時SVBV和SMoV條帶微弱,其中53 ℃和55 ℃時6種病毒的擴(kuò)增效果都較好。從引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定性考慮,退火溫度采用53 ℃(圖5)。

M:D2000 DNA marker;泳道1～5:退火溫度分別為50、53、55、58和60 ℃;泳道6:健康樣品。

2.3.4延伸溫度

在上述研究基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)了一系列的延伸溫度梯度(68、70和72 ℃),在這個延伸溫度范圍內(nèi)6種病毒都能擴(kuò)增得到單一明亮的條帶,擴(kuò)增效果差異不大。從Taq酶的活性考慮,最終延伸溫度采用72 ℃(圖6)。

M:D2000 DNA marker;泳道1～3:延伸溫度分別為68、70和72 ℃;泳道4:健康樣品。

2.4 多重PCR的檢測靈敏度

當(dāng)重組質(zhì)粒稀釋至10-1ng/μL時,6種病毒仍能擴(kuò)增出清晰明亮的條帶(圖7)。通過體系中各病毒模板的終濃度和對應(yīng)的堿基數(shù)計(jì)算得出各病毒的最低檢出拷貝數(shù),SVBV為5.47×107copies/μL,SMoV為7.49×107copies/μL,SMYEV為3.42×107copies/μL,SPaV為5.71×107copies/μL,StrV-1為2.54×107copies/μL,BrYV為4.85×107copies/μL。因此該六重PCR的檢測下限約為107copies/μL。

M:D2000 DNA marker;泳道1～6:病毒質(zhì)粒分別為101～10-4 ng/μL;泳道7:健康樣品。

2.5 多重PCR檢測田間樣本

為驗(yàn)證多重PCR的可靠性和有效性,對已知感病情況的12株草莓植株進(jìn)行病毒檢測。不論是單一病毒侵染還是復(fù)合侵染,該反應(yīng)體系均可以檢測出相應(yīng)病毒,并且病毒特異性擴(kuò)增效果顯著(圖8),也證實(shí)了該多重PCR快速檢測方法的實(shí)用性。

M:D2000 DNA marker;泳道1～2:感染SVBV的草莓樣品;泳道3～4:感染SMoV的草莓樣品;泳道5～6:感染SMYEV的草莓樣品;泳道7:感染SVBV和SPaV的草莓樣品;泳道8:感染SVBV、SMoV和SPaV的草莓樣品;泳道9:感染SVBV和StrV-1的草莓樣品;泳道10:感染SMoV和StrV-1的草莓樣品;泳道11～12:感染BrYV的草莓樣品;泳道13:陽性對照;泳道14:陰性對照。

3 討論與結(jié)論

在草莓長期的營養(yǎng)繁殖中,病毒會通過匍匐莖和介體昆蟲傳播擴(kuò)散,導(dǎo)致草莓病毒病發(fā)生越來越嚴(yán)重。SVBV、SMoV和SMYEV是世界高發(fā)的3種草莓病毒,SPaV、StrV-1和BrYV是中國近幾年新出現(xiàn)的草莓病毒,對SPaV、StrV-1和BrYV的分布區(qū)域有待進(jìn)一步的檢測。

單一病毒侵染在多數(shù)草莓品種中沒有明顯癥狀,但是病毒復(fù)合侵染會引起嚴(yán)重的癥狀,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[15]。僅僅根據(jù)癥狀難以區(qū)分病毒種類,快速、可靠且低成本的多重PCR檢測方法在病毒鑒定上具有重要的應(yīng)用價值。朱海生等[16]成功建立了4種草莓病毒的多重PCR體系,最終引物比例為SVBV∶SMoV∶SMYEV∶SCV=5∶7∶3∶5;韓曉玉等[17]成功建立了5種草莓病毒的多重PCR體系,引物比例為SVBV、SMoV、SMYEV、SPaV和SNSV等量混合。參考前人的研究結(jié)果,本研究首次在檢測SVBV、SMoV、SMYEV和SPaV的同時實(shí)現(xiàn)了StrV-1和BrYV這2種新病毒的檢測,目前還沒有報道同時檢測6種草莓病毒的多重PCR方法。本研究建立的多重PCR方法能夠同時檢測高發(fā)的草莓病毒和新出現(xiàn)的草莓病毒,提高了病毒檢測的全面性。

在多重PCR的建立過程中,引物組合和比例對于實(shí)現(xiàn)PCR模板的同步擴(kuò)增具有決定性作用[18-22]。本研究在朱海生等[16]和何成勇等[23]的基礎(chǔ)上,針對SVBV、SMoV、SMYEV、SPaV、StrV-1和BrYV設(shè)計(jì)了多對引物,并進(jìn)行了篩選。首先將所有引物組合中的引物濃度都設(shè)定為0.125 μmol/L,PCR擴(kuò)增程序與單重PCR一致,篩選出了能同時檢測6種病毒的引物組合。當(dāng)6種引物濃度均為0.125 μmol/L時,SVBV條帶清晰,SMYEV條帶最寬最亮,SPaV條帶很亮,而SMoV、BrYV和StrV-1條帶微弱。通過增加SMoV、BrYV和StrV-1的引物量,減少SMYEV和SPaV的引物量,尋找合適的引物比例,最終選擇引物比例為SVBV∶SMoV∶SMYEV∶SPaV∶BrYV∶StrV-1=5∶10∶2∶3∶10∶10。

在多重PCR中,優(yōu)化退火溫度、退火時間、延伸溫度和延伸時間可以減弱引物之間的相互干擾[24-25]。本研究中退火時間(30～45 s)和延伸溫度(68～72 ℃)對多重反應(yīng)的影響不大,退火溫度(50～60 ℃)和延伸時間(75～120 s)對于所建立的反應(yīng)體系至關(guān)重要。退火溫度太高會導(dǎo)致某些病毒擴(kuò)增失敗,推測與引物的退火溫度、引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定性等有關(guān)[26]。延伸時間過短或過長都不利于6種病毒的同步擴(kuò)增,過短會降低產(chǎn)物量,過長會增加非特異擴(kuò)增的概率。

本研究建立的多重PCR可以在一個反應(yīng)中鑒定SVBV、SMoV、SMYEV、SPaV、StrV-1和BrYV,節(jié)省了檢測成本和時間。該方法為進(jìn)一步明確草莓病毒的發(fā)生分布奠定了基礎(chǔ),具有廣闊的應(yīng)用前景。