李 蘭 張浩明 楊 利 程海衛(wèi) 侯立婷 張?jiān)i 侯繼波 陳 瑾 鄭其升,2,3*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫工程研究所,南京 210014;2.江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,南京 210014;3.獸用生物制品(泰州)國(guó)泰技術(shù)創(chuàng)新中心,泰州 225300)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的仔豬腹瀉是一種困擾養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病,現(xiàn)階段疫苗免疫是預(yù)防和控制 PED 的主要手段[1]。抗原是構(gòu)成疫苗的關(guān)鍵要素,提高有效抗原含量即抗原純化就顯得尤為重要?，F(xiàn)階段層析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于人類疫苗的純化,該方法雖然雜蛋白去除率較高,但是由于操作中使用的純化材料和設(shè)備造價(jià)較高[2],一定程度上阻礙了其在附加值低的獸用疫苗中的使用。所以開(kāi)發(fā)新型高效、低成本的 PEDV 抗原純化方法具有重要意義。

刀豆蛋白 A 是一種來(lái)源于豆科植物種子的凝集素[3],已被證實(shí)能夠特異性結(jié)合甘露糖和葡萄糖[4],利用其識(shí)別并結(jié)合糖基的高度特異性及可逆性,已廣泛應(yīng)用于糖蛋白的純化,如已用Con A分離純化乙型肝炎表面抗原亞基、絨毛膜促性腺激素、堿性磷酸酶和茶樹(shù)葉糖蛋白等[5-7]。也有利用Con A純化病毒的相關(guān)報(bào)道,早期研究表明Con A有2個(gè)糖基結(jié)合位點(diǎn),一個(gè)高親合力結(jié)合位點(diǎn),稱之為主要結(jié)合位點(diǎn)(pS),一個(gè)低親和力結(jié)合位點(diǎn),稱之為次要結(jié)合位點(diǎn)(sS),當(dāng)糖蛋白的糖鏈中同時(shí)具有pS和sS 時(shí),可以與Con A結(jié)合并產(chǎn)生沉淀[8-9],基于此研究人員嘗試?yán)?Con A 沉淀囊膜病毒,通過(guò)離心,去除雜蛋白,然后于沉淀中添加含有甲基-α-D-吡喃甘露糖苷的解離液去競(jìng)爭(zhēng)Con A的2個(gè)糖基結(jié)合位點(diǎn),使病毒從Con A上解離下來(lái),釋放到介質(zhì)中,以實(shí)現(xiàn)純化的目的,結(jié)果顯示該方法可以收獲純化的病毒[10]。另有研究人員嘗試將偶聯(lián) Con A的親和層析柱應(yīng)用于桿狀病毒的純化,表明 Con A可通過(guò)特異性結(jié)合病毒表面的 GP64 糖蛋白而實(shí)現(xiàn)桿狀病毒的純化[11]。

在前人研究的基礎(chǔ)上,本研究利用 Con A 與 PEDV 的特異性結(jié)合,形成 Con A-PEDV 不溶性復(fù)合物,通過(guò)離心和競(jìng)爭(zhēng)性洗脫即可實(shí)現(xiàn)病毒的純化,即解析 Con A 高效純化 PEDV 的關(guān)鍵因素,獲得復(fù)合物形成、分離及解離3個(gè)階段的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù),提高雜蛋白去除率和病毒回收率,為大規(guī)模純化 PEDV 疫苗毒提供一種參考方法,也為高質(zhì)量 PEDV 滅活疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

PEDV 細(xì)胞培養(yǎng)液由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫工程研究所提供,其滴度為106.9TCID50/mL;Vero 細(xì)胞由本課題組保存。刀豆蛋白A購(gòu)自Sigma公司;甲基-α-D-吡喃甘露糖苷、N-乙酰葡萄糖胺均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;PEDV 抗原檢測(cè)的雙抗夾心 ELISA 試劑盒由本研究團(tuán)隊(duì)研制;HRP 標(biāo)記的羊抗鼠抗 IgG 抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

該研究中所采用的豬流行性腹瀉病毒純化方法,主要包括3個(gè)階段:1)結(jié)合階段:于PEDV病毒培養(yǎng)液中加入適量Con A,作用一定時(shí)間;2)分離階段:離心,取沉淀;3)解離階段:于上述沉淀中加入解離液進(jìn)行解離,得到純化后的病毒液。

1.2.1離心條件的優(yōu)化

于3 mL PEDV細(xì)胞培養(yǎng)液中添加終濃度為60 μg/mL的Con A,室溫孵育1.5 h,接著按照不同的速度離心25 min,離心速度分別是1 000、2 000、4 000、5 000、6 000、8 000和10 000 r/min,收獲沉淀,加入1.5 mL含有甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(100 mmol/L)的PBS溶液作為解離液,室溫解離10 min,即得純化后的病毒,同時(shí)收獲離心后上清,利用PEDV雙抗夾心ELISA試劑盒檢測(cè)解離液OD450,以確定合適的離心速度;接著設(shè)定最佳離心速度,其他步驟同上,考察不同的離心時(shí)間(1、2、5、10、15、20、25和30 min)對(duì)純化效果的影響,另外以Vero細(xì)胞破碎液替代病毒培養(yǎng)液,作為對(duì)照組。

1.2.2Con A與PEDV病毒液作用條件的優(yōu)化

于3 mL PEDV細(xì)胞培養(yǎng)液中分別添加不同量的 Con A和PHA,使其終濃度分別為 0、10、20、40、60、80、100和120 μg/mL,室溫震蕩孵育1.5 h,4 000 r/min離心25 min,收獲沉淀。按上述方法進(jìn)行解離,收獲純化病毒液,利用 PEDV 雙抗夾心 ELISA試劑盒檢測(cè)解離液 OD450,以確定Con A添加量;然后于 PEDV 細(xì)胞培養(yǎng)液中添加適量Con A,其他步驟同上,考察不同作用時(shí)間(0.5、1、1.5、2和2.5 h)對(duì)純化效果的影響,另外以Vero細(xì)胞破碎液作為對(duì)照組。

1.2.3解離液的篩選及優(yōu)化

競(jìng)爭(zhēng)性糖的篩選及其濃度確定:于PBS中添加不同種類的競(jìng)爭(zhēng)性糖:100 mmol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(M)、100 mmol/L N-乙酰葡萄糖胺(G)或其混合物(50 mmol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷和50 mmol/L N-乙酰葡萄糖胺,MG);解離液中甲基-α-D-吡喃甘露糖苷濃度分別設(shè)為0、50、100、150、200、250和300 mmol/L,以確定糖的最適使用濃度。離子強(qiáng)度的優(yōu)化:比較2種緩沖液成分的解離效果:一種是Na2HPO4-NaH2PO4磷酸鹽緩沖液(PB):pH 7.5,0.01 mol/L PB,500 mmol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷,0～80 mmol/L NaCl;另外一種是Tris-HCl緩沖液:pH 7.0,0.01 mol/L Tris,500 mmol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷,0～80 mmol/L NaCl,解離液中NaCl濃度分別設(shè)置為0、10、30、50、60和80 mmol/L。

1.2.4病毒回收率的測(cè)定

以采用細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)準(zhǔn)確定量的PEDV細(xì)胞培養(yǎng)液為標(biāo)準(zhǔn)品,利用雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD450值,建立標(biāo)準(zhǔn)品的滴度與OD450值之間線性回歸關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后用雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)純化前病毒液(體積記為V1)、純化后病毒液(體積記為V2)的OD450值,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得純化前病毒液TCID50和純化后病毒液的TCID50,研究中純化前病毒液體積為3 mL,回收的病毒液體積為2.5 mL,病毒回收率按照如下公式進(jìn)行計(jì)算:

病毒回收率=(T2×V2)÷(T1×V1)×100%

(1)

式中:T1為純化前病毒液的病毒量,TCID50/mL;V1為純化前病毒液體積,mL;T2為純化后病毒液的病毒量,TCID50/mL;V2為回收的病毒液體積,mL。

同時(shí)為確定病毒被純化下來(lái),還需Western Blot鑒定,PEDV病毒培養(yǎng)液與Con A作用完畢,經(jīng)離心收集沉淀,PBS洗滌3次,去除非特異性吸附,按病毒液1/40體積加入PBS并重懸,進(jìn)行Western Blot鑒定。

1.2.5雜蛋白去除效果測(cè)定

為分析雜蛋白去除情況,收集純化后上清和病毒液,進(jìn)行SDS-PAGE鑒定;利用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定純化前病毒液及純化后病毒液中總蛋白含量?？偟鞍兹コ拾慈缦鹿竭M(jìn)行計(jì)算:純化前病毒液中總蛋白濃度記為C1,體積為V1,純化后病毒液中總蛋白濃度記為C3,體積為V3。

總蛋白去除率=

1-[(C3×V3)÷(C1×V1)]×100%

(2)

式中:C1為純化前病毒液中總蛋白濃度,μg/mL;V1為純化前病毒液體積,mL;C3為純化后病毒液中總蛋白濃度,μg/mL;V3為純化后病毒液體積,mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬流行性腹瀉病毒純化離心條件的優(yōu)化

利用雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)純化后病毒液及經(jīng)Con A處理后Vero細(xì)胞破碎液的OD450值,圖1(a)表明:當(dāng)離心速度較大時(shí),試驗(yàn)組和對(duì)照組解離液OD450均較高;當(dāng)離心速度較小時(shí),試驗(yàn)組和對(duì)照組解離液OD450均較低;因此只有當(dāng)試驗(yàn)組解離液OD450較高,對(duì)照組解離液OD450維持在空白水平時(shí),此時(shí)離心力最佳,為4 000 r/min。

(a)速度;(b)時(shí)間

同時(shí)隨著離心時(shí)間的延長(zhǎng),解離液OD450逐漸升高,當(dāng)離心時(shí)間≥15 min時(shí),解離液OD450值保持相對(duì)穩(wěn)定,說(shuō)明最佳離心時(shí)間是15 min(圖1(b))。

2.2 豬流行性腹瀉病毒純化中Con A用量及作用時(shí)間的優(yōu)化

經(jīng)PHA處理的PEDV病毒液的OD450值均處于空白水平,說(shuō)明PHA不能與PEDV病毒粒子結(jié)合,而Con A可以與PEDV病毒粒子發(fā)生特異性結(jié)合,由圖2(a)可知:當(dāng)添加量小于40 μg/mL時(shí),OD450值增加緩慢;當(dāng)Con A添加量為40～80 μg/mL時(shí),OD450值急劇上升;當(dāng)Con A添加量大于80 μg/mL時(shí),OD450值維持在最高值不變,故Con A用于PEDV純化的最佳添加濃度為80 μg/mL。另外Con A與PEDV病毒液的最佳作用時(shí)間為2 h(圖2(b))。

(a)Con A 使用濃度;(b)作用時(shí)間

2.3 豬流行性腹瀉病毒純化解離液的篩選

解離液是提高病毒回收率的關(guān)鍵因素之一,與 N-乙酰葡萄糖胺相比,甲基-α-D-吡喃甘露糖苷有著更高的解離效率,且其洗脫效率呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,圖3(b)結(jié)果顯示甲基-α-D-吡喃甘露糖苷的最佳使用濃度為200 mmol/L,另外,圖4表明增加解離液中的離子強(qiáng)度,可以降低Con A與病毒的親和力,有利于解離,當(dāng)NaCl最佳濃度為50 mmol/L時(shí),Tris緩沖液優(yōu)于磷酸鹽緩沖液。

(a)解離液中競(jìng)爭(zhēng)性糖的比較;(b)甲基-α-D-甘露糖甘濃度優(yōu)化

圖4 解離液緩沖體系的篩選及NaCl濃度的優(yōu)化

2.4 豬流行性腹瀉病毒純化后回收率檢測(cè)

以表1中準(zhǔn)確定量的PEDV細(xì)胞培養(yǎng)液為標(biāo)準(zhǔn)品,建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.493 9x+5.587 8,y為log(PEDV滴度),x為OD450值。病毒滴度在5×105～7.9×106TCID50/mL范圍時(shí),R2>0.99,CV<10%,表明雙抗夾心ELISA方法重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高,能夠穩(wěn)定、快速地測(cè)定PEDV含量,可用于病毒回收率的測(cè)定。本試驗(yàn)的病毒回收率=(106.88×2.5)÷(106.9×3)×100%=79.4%。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品OD450值及l(fā)ogTCID50的對(duì)應(yīng)關(guān)系

使用豬 PEDV陽(yáng)性血清作為一抗,進(jìn)行 Western Blot鑒定,圖5 結(jié)果顯示于55 ku 大小處出現(xiàn) PEDV N 蛋白特異性條帶,再次證明Con A可以實(shí)現(xiàn)預(yù)期的純化目的。

M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1:純化前PEDV培養(yǎng)液;2:上清;3:純化后PEDV病毒液。

2.5 總蛋白去除效率檢測(cè)

病毒純化通過(guò)一步低速離心即可實(shí)現(xiàn),如圖6所示,在25 ku左右處呈現(xiàn)較弱的蛋白條帶,并未出現(xiàn)培養(yǎng)基、宿主細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的蛋白,由此可以確定病毒液中大部分雜蛋白已被去除,進(jìn)一步經(jīng)BCA測(cè)定純化前總蛋白濃度為1.59 mg/mL,體積為3 mL,純化后總蛋白濃度為114.9 μg/mL,體積為2.5 mL,其總蛋白去除率為1-[(114.9×2.5)÷(1 590×3)]×100%=93.9%。

M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1:純化前PEDV培養(yǎng)液;2:上清;3:純化后PEDV病毒液。

3 討 論

當(dāng)今疫苗免疫仍是控制病毒感染最常用的方法,隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展,對(duì)安全、高效的高質(zhì)量疫苗的需求日益增加,而雜質(zhì)是影響疫苗安全性和有效性的主要因素之一,所以病毒的純化對(duì)于疫苗的開(kāi)發(fā)越來(lái)越重要,故本研究意在建立一種PEDV純化方法。

本研究嘗試使用凝集素Con A對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的PEDV進(jìn)行純化,較前人使用Con A沉淀純化弗里德氏病毒時(shí)[10],回收率有較大提升,可達(dá)到80%左右,這可能與2種病毒表面糖蛋白的糖鏈組成不同有關(guān),PEDV表面糖蛋白與Con A有較高的親和力;研究還發(fā)現(xiàn)離心速度是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù),4 000 r/min對(duì)于PEDV的純化是最佳的,當(dāng)離心速度較大時(shí),非特異性的雜質(zhì)也被沉降下來(lái),影響除雜效率;當(dāng)離心速度較小時(shí),Con A-PEDV復(fù)合物沒(méi)有沉降下來(lái),影響回收率;另外在Tris-HCl緩沖體系下,當(dāng)NaCl濃度為50 mmol/L時(shí),洗脫效果最佳,可能在此條件下,Con A的糖基結(jié)合域與糖基之間的氫鍵和疏水作用力減弱[12],更易解離。

囊膜病毒表面蛋白發(fā)生糖基化的現(xiàn)象十分普遍,至今仍在世界大流行的新型冠狀病毒表面的 S 蛋白呈現(xiàn)高度糖基化,其N-連接糖基化位點(diǎn)高達(dá)66個(gè)。目前動(dòng)物病毒的糖基化研究相對(duì)滯后,同為冠狀病毒的 PEDV 纖突 S 蛋白具有較高程度的糖基化修飾,但其糖鏈類型及結(jié)構(gòu)尚未見(jiàn)報(bào)道,也未見(jiàn)Con A與PEDV表面糖基是否能夠發(fā)生特異性反應(yīng)的相關(guān)研究。SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果初步表明Con A能夠特異性結(jié)合PEDV,而不跟培養(yǎng)基和宿主細(xì)胞中的蛋白結(jié)合,這為該方法具有較高的總蛋白除雜率提供了保障。后續(xù)試驗(yàn)將使用 PNGase F和Endo Hf 糖苷酶對(duì)PEDV進(jìn)行處理,以考察Con A能否與去糖基化PEDV結(jié)合,進(jìn)一步說(shuō)明Con A與PEDV的結(jié)合具有糖基依賴性。

綜上所述,本研究在前人研究基礎(chǔ)上,一方面發(fā)現(xiàn)使用Con A純化PEDV病毒液是可行的,另一方面確定并優(yōu)化了關(guān)鍵技術(shù)參數(shù),后續(xù)將對(duì)純化病毒進(jìn)行感染活性鑒定及免疫原性評(píng)估,為高質(zhì)量 PEDV滅活疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。