劉紫晨

石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院,新疆石河子市 832000

膿毒癥心肌病是繼發(fā)于膿毒癥的嚴重器官功能障礙,其發(fā)病機制復雜多樣,包括炎癥反應失衡、線粒體功能損傷、氧化應激、鈣調節(jié)障礙、自噬調節(jié)紊亂和內皮功能障礙等[1]。組織器官遭受急性感染或損傷時,中性粒細胞作為先天性免疫的重要組成部分,早期會大量聚集在病灶處發(fā)揮獨特的免疫作用[2]。中性粒細胞參與感染所致的機體損傷時,所涉及的機制多種多樣,除吞噬、脫顆粒,誘導ROS產生外,還介導形成誘捕網,該網狀結構被稱為中性粒細胞外誘捕網 (Neutrophil extracellular traps,NETs),已有研究表明細菌釋放的內毒素和機體產生炎癥細胞因子在膿毒癥心肌抑制期間起著關鍵作用[3-5],NETs作為一種潛在的抗菌機制,在膿毒癥心肌病中的作用值得深入探討及研究。

硫化氫(H2S)是一種氣體生物介質,具有調節(jié)心血管、神經、免疫等系統(tǒng)的重要功能[6-7]。NaHS是一種外源性H2S供體,可以提高內源性H2S水平。既往研究表明,在大鼠膿毒癥模型中,腹腔注射NaHS可以增加內源性H2S的合成,可通過抑制內質網應激相關自噬改善膿毒癥引起的心功能障礙[8-9],但是體內H2S氣體信號能否通過調控NETS影響膿毒癥心肌病尚未明確。因此,本研究擬通過給予外源性H2S(NaHS)對CLP誘導的膿毒癥大鼠進行干預處理,進一步展開心肌損傷相關酶CK-MB和LDH檢測、心肌病理組織學染色、血清H2S含量測定和中性粒細胞外誘捕網形成相關因子(Gasdermin D, GSDMD)、髓過氧化物酶 (Myeloperoxidase, MPO)、瓜氨酸化組蛋白3 (Citrulline, CitH3)指標變化情況檢測,基于NETs進一步探究H2S在膿毒癥心肌損傷中作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物。清潔級雄性SD大鼠48只,6～8周齡,體質量(200±25)g,購自新疆恒朝生物科技有限公司,實驗動物生產許可證編號:SCXK(豫)2020-0005,實驗大鼠在我院動物中心進行飼養(yǎng),由專人添加食物與水,飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～25℃,環(huán)境濕度為50%～70%,室內通風良好,進食、飲水及籠內活動不設限。本實驗的動物實驗方案均得到石河子大學動物保護與使用委員會(中國石河子)的批準。

1.1.2 藥物與試劑。NaHS購自宏昌生物科技有限公司,批號:240-778-0;GSDMD抗體(貨號:TA4012 )來自上海Abmart公司、MPO抗體(貨號:22225-1-AP1)、CitH3(貨號:13754-1-AP)來自武漢三鷹公司; RIPA組織裂解液(貨號:R0010)、Alexa Fluor 594標記的羊抗兔IgG熒光二抗(貨號:K1034G-AF594)購自北京索萊寶生物技術公司;HRP標記山羊抗兔二抗(貨號:GB23303)、抗β-actin抗體(貨號:GB11001)購自武漢賽維爾生物技術有限公司;高敏型ECL化學發(fā)光檢測試劑盒(貨號:E412-01/02)購自南京諾唯贊公司;石蠟、蘇木素、伊紅購自國藥集團;LDH乳酸脫氫酶試劑盒(貨號:A0202-2)、CK-MB試劑盒(貨號:H197-1-2)、內源性硫化氫檢測(H2S)試劑盒(貨號:BC2050)購自北京索萊寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型。將48只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周,1周后按照體質量隨機分為假手術組、 膿毒癥模型組(模型組)、H2S給藥組、H2S抑制劑組。模型組、H2S給藥組、H2S抑制劑組采用盲腸結扎穿孔法制作大鼠膿毒癥心肌病模型[10],具體方法如下:大鼠術前半天不予飼喂飼料,但不限制飲水。通過腹腔內注射10%的戊巴比妥鈉(350mg/kg)進行麻醉,待大鼠麻醉后開腹暴露盲腸,在距離盲腸遠端1/3處用4.0縫線結扎盲腸,用14號針對盲腸進行穿孔,并從穿孔處擠出少量糞便。然后將盲腸放回腹腔,逐層關腹。術后立即通過皮下注射生理鹽水 (50ml/kg) 進行液體復蘇。假手術組行盲腸結扎術,不進行穿孔,余操作與模型組一致。為保持實驗的一致性,所有CLP手術均由具有手術執(zhí)業(yè)資格的個體醫(yī)生進行。

1.2.2 藥物處理與取樣。選取造模成功大鼠納入實驗,膿毒癥模型組:采用盲腸結扎穿孔法(CLP)制備SIC大鼠模型;H2S給藥組:CLP術后1h予以腹腔注射NaHS(8.9μmol/kg),按2ml/kg給藥;H2S抑制劑組:CLP術前30min腹腔注射PAG(40mg/kg),按2ml/kg給藥,術后1h予以腹腔注射NaHS(8.9μmol/kg);假手術組:予以同等劑量的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。待術后各組大鼠實驗觀察點結束,即術后12h后麻醉取腹主動脈血4ml,使用離心機離心后取上清液,分裝后置于-80℃冰箱,用于后續(xù)檢測。各組大鼠采用三倍劑量的戊巴比妥鈉安樂死后,留取心臟標本,用于制作染色病理切片及后續(xù)檢測。取5ml中性粒細胞分離液加入15ml離心管中,然后緩慢加入4ml大鼠外周血,室溫500g離心30min?？梢婋x心管中兩層環(huán)形盤狀白色懸浮細胞層,下層為中性粒細胞層,緩慢吸出中性粒細胞懸液分裝冷藏備用。

1.2.3 心肌組織HE染色。將包埋好的心肌石蠟包塊使用切片機將組織切至5μm厚度,60℃烤片30min進行脫蠟,采用雙蒸水水洗后行蘇木素—伊紅染色,梯度酒精脫水,透明,滴加適量中性樹膠后加蓋玻片封片,待切片干燥后在光學顯微鏡下觀察并拍照保存。

1.2.4 心肌酶生化指標檢測。取已經分裝好的血清,操作步驟均按照對應試劑盒說明書方法操作。分別檢測乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的變化水平。

1.2.5 內源性H2S水平檢測。按照試劑盒中試劑標序分別加入各組,室溫下混勻,隨后靜置30min,使用酶標儀檢測各孔665nm波長下的吸光度,進一步計算得出H2S水平。

1.2.6 免疫熒光檢測MPO含量。將已切好的切片60℃烘烤30min后進行脫蠟處理,使用枸櫞酸鈉緩沖液體系進行抗原修復,再用0.1% Triton X-100孵育20min破膜滲透,之后在10%山羊血清孵育20min,減少非特異性抗體結合位點,接著在室溫下使用兔抗MPO室溫下孵育4h,最后在暗盒中用羊抗兔IgG抗體孵育30min,DAPI封片,在熒光顯微鏡下觀察和拍攝圖像。

1.2.7 Western blot檢測血清GSDMD、MPO、CitH3蛋白表達。取出中性粒細胞懸液,加入RIPA組織裂解液裂解30min,12 000r/min離心取上清液,測定蛋白濃度。蛋白加loading buffer后煮沸上樣,進行凝膠電泳,使用濕轉法轉膜后,BSA封閉液封閉2h,使用GSDMD、MPO、CitH3(1∶10 00)抗體孵育置于4℃冰箱過夜處理,第2天回收洗凈一抗后使用對應二抗室溫孵育1h,隨后滴加ECL發(fā)光液與膜作用后進行顯影。

2 結果

2.1 HE染色 大鼠心肌HE病理染色結果顯示,12h后假手術組所有大鼠心肌細胞排列整齊,長軸與心肌纖維方向一致;模型組可見心肌間質纖維結構紊亂,伴有不同程度的水腫、變性;與模型組相比,H2S給藥組心肌纖維未見明顯受損,病理損傷程度明顯減輕;而H2S抑制劑組大鼠心肌的損傷程度較H2S給藥組明顯加重。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌HE染色結果(400×)

2.2 CK-MB、LDH檢測 血清CK-MB和LDH是評價心肌損傷的重要指標。通過試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)與假手術組相比,模型組CK-MB和LDH明顯上升,予以腹腔注射NaHS后,二者的含量有所下降,同時,在補充H2S抑制劑后CK-MB和LDH含量較H2S給藥組上升(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠血清LDH、CK-MB水平

2.3 H2S水平檢測 經過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),與假手術組相比,模型組大鼠血清H2S水平顯著下降,與模型組對比,H2S給藥組大鼠H2S含量有所升高,在予以補充H2S抑制劑PAG后,H2S含量下降(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠血清H2S水平

2.4 MPO熒光定量 在大鼠心肌組織切片的MPO熒光切片中,筆者發(fā)現(xiàn)與假手術組相比,模型組MPO熒光密度增強,表達量明顯上升,但給予外源性H2S補充劑NaHS后,發(fā)現(xiàn)MPO表達量明顯下降,最后,在給予PAG抑制H2S含量后MPO熒光強度提升。見圖4。

圖4 各組大鼠心肌MPO熒光染色結果(400×)

2.5 Western blot實驗結果 通過Western blot檢測中性粒細胞外線粒體誘捕網關鍵蛋白GSDMD、MPO、CitH3表達。結果發(fā)現(xiàn),與假手術組比較,模型組大鼠外周血中性粒細胞上清中GSDMD、MPO、CitH3蛋白表達量顯著升高。與模型組比較,H2S給藥組能顯著降低GSDMD、MPO、CitH3蛋白表達水平。在使用PAG之后,GSDMD、MPO、CitH3蛋白表達水平明顯提升(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠外周血中性粒細胞GSDMD、MPO和CitH3表達水平

3 討論

中性粒細胞在感染性疾病中發(fā)揮著重要的作用。它可通過吞噬、釋放溶菌酶和形成NETs,依靠自身網狀結構在活化時破膜釋放未聚集的染色質,進而殺滅感染的細菌、真菌,但也有研究證實,在機體感染時,NETs自身具備免疫原性,可促發(fā)機體炎癥反應,與細胞毒性、促血栓、細胞死亡調控形成等不良事件密切相關[11-12],可見中性粒細胞在感染性疾病中的作用值得深入研究。H2S作為一種氣體信號分子,其促炎或抗炎作用仍有待進一步研究與探討,既往研究表明在不同模型中H2S的給藥溫度、劑量、時間和首選給藥途徑,吸入氣態(tài)或注射液態(tài)都是造成H2S不同作用的潛在因素[13-16]。本研究中,筆者發(fā)現(xiàn)在膿毒癥大鼠心肌損傷模型中,外源性給予H2S供體NaHS具有抗炎作用,其主要機制是通過抑制中性粒細胞外誘捕網的形成,繼而改善膿毒癥誘導的心肌損傷。

CK-MB和LDH是廣泛被認可的心肌損傷標志物,這兩項作為心肌損傷的診斷和檢測指標,具有一定的特異性和實用性[17]。本研究結果顯示,膿毒癥模型組與假手術組心肌酶學指標CK-MB、LDH相比明顯升高,具有統(tǒng)計學差異。同時心肌病理組織學染色結果也顯示,假手術組心肌細胞排列整齊呈規(guī)律梭形,膿毒癥大鼠心肌細胞排列無序,心肌橫線模糊或缺失,同時伴炎細胞浸潤,這是心肌損傷的標志。筆者通過人為處理分別促進和抑制大鼠體內H2S的表達水平,發(fā)現(xiàn)與膿毒癥心肌損傷模型相比,促進H2S表達降低了CK-MB和LDH含量,而通過PAG抑制大鼠體內H2S含量發(fā)現(xiàn)心肌損傷并未得到明顯改善。以上結果表明,在膿毒癥大鼠心肌損傷模型中,外源性給予H2S供體NaHS起到了一定程度的心肌保護作用。

中性粒細胞外誘捕網是由DNA、組蛋白和抗菌蛋白組成的網狀結構,它是以DNA為骨架,其間鑲嵌有組蛋白CitH3、中性粒細胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase, NE)、MPO、抗菌肽(IL-37)、絲氨酸蛋白酶等,因此,關于NETs的檢測也都是圍繞這些主要組成成分展開[18]。NETs可以捕獲、中和和殺死病原體,防止細菌傳播,而過量的NETs形成也可以誘導心肌細胞和心血管內皮細胞損傷。在膿毒癥相關的心肌損傷中,NETs刺激中性粒細胞浸潤到心肌,并通過分泌促炎細胞因子引起組織損傷。抑制NETs形成可減輕膿毒癥心肌病[19-20]。NETs在膿毒癥發(fā)展過程中表現(xiàn)出促炎作用,加重了心肌損傷和炎細胞的浸潤,抑制CLP誘導產生的中性粒細胞外誘捕網形成可減輕膿毒癥相關的心肌損傷。MPO作為NETs形成的主要組分之一,免疫熒光結果顯示,NaHS可降低膿毒癥大鼠心肌MPO表達水平。此外,Western blot結果顯示,H2S的過表達也降低了膿毒癥大鼠心肌組織GSDMD的表達水平,正常細胞條件下,GSDMD 蛋白在細胞內呈現(xiàn)無活性狀態(tài),當細胞受到炎癥刺激因素,GSDMD可由細胞內的半胱氨酸蛋白酶或中性粒細胞彈性蛋白進行剪切修飾,經剪切修飾的 GSDMD的N端能在細胞膜處發(fā)生寡聚反應,形成裂解孔,從而靶向和溶解中性粒細胞顆粒膜,釋放出MPO和NETs。

綜上所述,本研究結果表明H2S具有一定的抗炎作用,可通過下調GSDMD信號通路減少NETs的釋放和形成,從而改善膿毒性心肌病。