丁靜，陳偉光，陳宇婷，何岸飛，姜晶，盛光遙

（蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009）

鎘具有很高的毒性，不僅會(huì)破壞生物機(jī)能，影響生態(tài)系統(tǒng)的正常功能[1]，還會(huì)通過食物鏈在生物以及人體內(nèi)富集，給人類健康帶來巨大風(fēng)險(xiǎn)[2]，因此對(duì)鎘污染水體進(jìn)行修復(fù)至關(guān)重要。生物炭是由富碳生物質(zhì)（如農(nóng)副產(chǎn)品）在缺氧條件下通過熱加工（如熱解）而獲得的物質(zhì)[3]，其孔隙和表面官能團(tuán)可與鎘發(fā)生物理化學(xué)作用[4]，是一種新興、低成本的吸附劑。然而，生物炭對(duì)鎘的固定效果較差，在廢水長期處理過程中可能發(fā)生解吸，造成二次污染[5]。枯草芽孢桿菌是一種廣泛分布于不同環(huán)境的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，是原位生態(tài)水體中的代表菌種[6]。它被認(rèn)為是一種良好的生物吸附劑，低成本及環(huán)境友好的特點(diǎn)更使其在鎘廢水修復(fù)領(lǐng)域具有不可替代的優(yōu)勢(shì)[7-9]。然而，利用微生物吸附劑處理含鎘廢水存在難以分離和回收、微生物活性在生長初期易受鎘毒性影響等缺點(diǎn)[10]，從而限制了微生物吸附劑的應(yīng)用。

有研究指出，生物炭是固定微生物的良好載體，不僅可以為微生物提供有利的生存環(huán)境，還能為微生物生長提供碳源、能源和礦物營養(yǎng)[11]。而微生物可以協(xié)助生物炭完成對(duì)污染物的長期固定，同時(shí)還可能將生物炭用作厭氧呼吸中的末端電子受體[12]。Yuan等[13]的研究也證實(shí)了生物炭可作為微生物的電子供體。因此，近年來有學(xué)者采用生物炭聯(lián)合枯草芽孢桿菌處理含鎘廢水[14-15]，該方法可以彌補(bǔ)單一生物炭和微生物處理時(shí)的缺陷，同時(shí)生物炭和枯草芽孢桿菌之間的相互作用可能會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)含鎘廢水的處理效果。然而，這些研究主要關(guān)注體系中鎘的吸附去除效果，并結(jié)合一系列的外在表征手段，從化學(xué)層面探索鎘、枯草芽孢桿菌和生物炭之間的相互作用過程，缺乏從微生物角度闡述其詳細(xì)的內(nèi)在分子機(jī)制[16]。明確枯草芽孢桿菌在生物炭添加及重金屬脅迫環(huán)境下的生理響應(yīng)和分子作用機(jī)制，對(duì)優(yōu)化生物炭-枯草芽孢桿菌復(fù)合技術(shù)處理重金屬廢水至關(guān)重要。

微生物對(duì)外在環(huán)境的生理適應(yīng)主要在轉(zhuǎn)錄水平上協(xié)調(diào)[17]，因此研究微生物在不同環(huán)境條件下基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的變化，可以理解環(huán)境條件對(duì)微生物的內(nèi)在影響機(jī)制[18-20]。Yu 等[21]通過轉(zhuǎn)錄組分析系統(tǒng)研究了溶解氧對(duì)枯草芽孢桿菌遺傳調(diào)控和代謝的影響。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，低氧供應(yīng)對(duì)代謝有3 個(gè)主要影響：增強(qiáng)碳代謝（葡萄糖代謝、丙酮酸代謝和碳溢出）、抑制氮源降解（谷氨酸族氨基酸和黃嘌呤）和嘌呤合成。此外，參與能量、細(xì)胞類型分化、蛋白質(zhì)合成的基因表達(dá)也受氧氣供應(yīng)的影響。Oomes 等[22]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究了鈣離子對(duì)枯草芽孢桿菌孢子形成的影響，結(jié)果顯示，孢子形成、鞭毛形成和生物膜基質(zhì)形成通路都受到了顯著影響，孢壁多糖生物合成基因以及生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)也被影響。此外，對(duì)于枯草芽孢桿菌暴露于多種營養(yǎng)和環(huán)境條件下平鋪陣列轉(zhuǎn)錄組的研究，為研究枯草芽孢桿菌與環(huán)境污染物的相互作用機(jī)制提供了強(qiáng)大的理論基礎(chǔ)[23]。

因此，本實(shí)驗(yàn)利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序，研究枯草芽孢桿菌在不同體系（正常、鎘脅迫、生物炭、生物炭-鎘脅迫）中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子機(jī)理，討論生物炭添加對(duì)枯草芽孢桿菌抵抗鎘脅迫壓力及鎘去除能力的影響機(jī)制。研究結(jié)果可為未來生物炭-微生物聯(lián)用處理重金屬廢水提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 生物炭制備

生物炭原料為玉米秸稈，產(chǎn)自江蘇東海。將收集的玉米秸稈用粉碎機(jī)打碎（2～5 cm）后裝入砂鍋，用錫紙包裹，置于馬弗爐中，在500 ℃條件下高溫?zé)峤? h。待自然降溫6 h 后取出，在研缽中研磨，過100 目篩。洗凈烘干，最后冷凍干燥24 h后收集備用。

1.2 細(xì)菌來源及培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)采用的枯草芽孢桿菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC 編號(hào)1.4255）。培養(yǎng)基包括氯化鈉5 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、牛肉膏3 g·L-1，pH 7.0。在30 ℃、170 r·min-1下培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)體系搭建

實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常培養(yǎng)（BS）、生物炭添加（BS_C）、鎘脅迫（BS_Cd）、生物炭-鎘脅迫（BS_C_Cd）4 組體系。將對(duì)數(shù)期保藏的枯草芽孢桿菌按7%（V/V）的比例先后兩次接種于新鮮培養(yǎng)基中，依次完成活化（2 h）和擴(kuò)大培養(yǎng)（8 h）?？紤]到枯草芽孢桿菌在生物炭添加和鎘脅迫環(huán)境中適宜的暴露時(shí)間并不一致，并且在BS_C_Cd體系中，需要將枯草芽孢桿菌和生物炭混合培養(yǎng)一段時(shí)間后再進(jìn)入鎘脅迫環(huán)境，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了兩組培養(yǎng)體系。將擴(kuò)大培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌等量（200 mL）分裝到兩組無菌錐形瓶中，選擇一組為BS體系，在另一組中加入生物炭（0.2 g），形成BS_C 體系。兩組體系均設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并將其置于30 ℃和170 r·min-1的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)3.5 h后，對(duì)兩組體系進(jìn)行取樣，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。取樣結(jié)束后，迅速在兩組體系中加入滅菌后的CdCl2溶液，控制每組體系中的鎘濃度為50 mg·L-1，形成BS_Cd 體系和BS_C_Cd 體系，反應(yīng)時(shí)間控制為20 min，用于分析鎘脅迫對(duì)枯草芽孢桿菌的即時(shí)壓力效應(yīng)。在此期間，分別在0、10、20 min 時(shí)對(duì)兩組體系進(jìn)行鎘濃度測(cè)定。反應(yīng)結(jié)束時(shí)（20 min），取樣用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.4 鎘濃度測(cè)定

采用原子吸收光譜儀PinAAcle900T（PerkinElmer，Waltham，MA，USA）測(cè)定溶液中的鎘濃度。標(biāo)準(zhǔn)鎘溶液（1000 μg·mL-1）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。樣品測(cè)定前使用0.45μm 濾膜過濾，并加入定量硝酸（1%）稀釋，以控制濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，同時(shí)也抑制溶液中的鎘水解。

1.5 樣品收集及RNA分離純化

BS 體系和BS_Cd 體系：樣品采集后，利用離心機(jī)在4 000 r·min-1下離心3 min 收集菌體，用液氮快速冷凍后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

BS_C體系和BS_C_Cd體系：樣品采集后，分兩次離心收集菌體。第一次以2 500 r·min-1的較低轉(zhuǎn)速離心，除去樣品中的生物炭。第二次以4 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心收集菌體，用液氮快速冷凍，放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行樣品總RNA 提取，通過瓊脂糖凝膠電泳分析RNA 完整性及是否存在DNA 污染，利用NanoPhotometer spectrophotometer（Implen，Munich，德國）檢測(cè)RNA的純度，通過Agilent 2100 bioanalyzer（Agilent，Palo Alto，CA，美國）精確檢測(cè)RNA 的完整性。

1.6 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序及分析

從提取的總RNA 中去除rRNA，獲得mRNA。隨后加入碎片化緩沖液，將得到的mRNA隨機(jī)打斷成短片段，按照鏈特異性方式建庫[24]。文庫構(gòu)建完成后，使用Invitrogen Qubit 2.0 Fluorometer（ThermoFisher，Waltham，MA，美國）對(duì)其進(jìn)行初步定量，然后稀釋文庫至1.5 ng·μL-1。隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer（Agilent，Palo Alto，CA，美國）對(duì)文庫中的插入片段大小進(jìn)行檢測(cè)。插入片段大小符合預(yù)期后，利用qRTPCR對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫有效濃度高于2 nmol·L-1），并進(jìn)行Illumina測(cè)序。

測(cè)序完成后，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行原始數(shù)據(jù)過濾，去除帶接頭的序列、含N（N 表示無法確定堿基信息）序列和低質(zhì)量序列（Qphred≤20 的堿基數(shù)占整個(gè)序列長度50%以上），并進(jìn)行測(cè)序錯(cuò)誤率和C 含量分布檢查，最終獲得用于后續(xù)分析使用的高質(zhì)量序列。用Bowtie2軟件對(duì)過濾后的序列進(jìn)行基因組定位分析[25]。用Rockhopper軟件將測(cè)序結(jié)果根據(jù)參考基因組進(jìn)行組裝，并與已注釋的基因模型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本區(qū)域[26]。通過Blastx與Nr庫比對(duì)，對(duì)新預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄本區(qū)域進(jìn)行注釋。采用ClusterProfiler軟件對(duì)差異基因集進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析，找出與差異基因顯著性相關(guān)的生物學(xué)功能或通路[27]。

2 結(jié)果與討論

2.1 含鎘體系中的鎘去除情況

圖1 顯示，兩個(gè)含鎘體系（BS_Cd 和BS_C_Cd）均在0～10 min 階段即表現(xiàn)出明顯的鎘吸附，之后在10～20 min 階段吸附放緩。BS_C_Cd 體系中生物炭和細(xì)菌對(duì)鎘的復(fù)合吸附量遠(yuǎn)大于BS_Cd 體系中單一細(xì)菌的吸附量，這可能會(huì)在一定程度上緩解體系中枯草芽孢桿菌的鎘脅迫毒性。因此本實(shí)驗(yàn)將鎘脅迫的反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為20 min，盡量讓枯草芽孢桿菌在鎘脅迫環(huán)境中具有一定的暴露時(shí)間，同時(shí)控制兩個(gè)體系中的鎘濃度差，從而獲得較科學(xué)的鎘脅迫/生物炭添加對(duì)枯草芽孢桿菌生理代謝的影響機(jī)制。

圖1 BS_Cd和BS_C_Cd體系中的鎘去除情況Figure 1 Cadmium removal in BS_Cd and BS_C_Cd systems

2.2 枯草芽孢桿菌在不同體系中的基因表達(dá)差異

由于本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了兩組培養(yǎng)體系（每個(gè)體系又分為兩個(gè)階段），為了更好地認(rèn)識(shí)枯草芽孢桿菌受生物炭刺激活性后，其對(duì)鎘脅迫壓力的生理響應(yīng)，本研究對(duì)BS_C_Cd 和BS_Cd 的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比分析。從圖2 中可以發(fā)現(xiàn)，生物炭和鎘的加入均會(huì)導(dǎo)致枯草芽孢桿菌基因表達(dá)差異。BS_CdvsBS 組共有1 932 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因967 個(gè)，下調(diào)基因965 個(gè)；BS_CvsBS 組有312 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因133 個(gè)，下調(diào)基因179 個(gè)；BS_C_CdvsBS_C組有1 722 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因834 個(gè)，下調(diào)基因888 個(gè)。除此之外，在對(duì)BS_C_Cd 和BS_Cd 樣品進(jìn)行對(duì)比分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，其存在1 541 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因691 個(gè)，下調(diào)基因850 個(gè)，差異基因數(shù)目遠(yuǎn)高于BS_CvsBS 組，說明在鎘脅迫壓力下，生物炭對(duì)枯草芽孢桿菌生理代謝的影響要遠(yuǎn)大于正常生長條件。BS_C_CdvsBS_C 組差異基因數(shù)目少于BS_CdvsBS 組，這進(jìn)一步證明枯草芽孢桿菌受到生物炭的積極作用，緩解了外界鎘脅迫對(duì)其造成的壓力和影響。這可能是因?yàn)樯锾看植诘谋砻婵椎?、較大的比表面積和孔隙容量為枯草芽孢桿菌提供了良好的生存環(huán)境，幫助枯草芽孢桿菌在一定程度上規(guī)避了鎘毒性[28]。同時(shí)在生物炭-鎘脅迫體系中，生物炭的存在為枯草芽孢桿菌的生長提供了營養(yǎng)[29]。Tao 等[30]以棉稈為原料制備生物炭作為枯草芽孢桿菌的高效接種載體，也發(fā)現(xiàn)與未添加生物炭的體系相比，細(xì)菌在生物炭體系中生長較快，細(xì)菌的最高濃度也較高。火山圖直觀展示了每個(gè)組合的差異基因分布情況（圖2b～圖2f）。相比BS_CvsBS 組，其余有鎘添加的實(shí)驗(yàn)組都表現(xiàn)出較高的基因表達(dá)差異及顯著性水平。這進(jìn)一步說明當(dāng)暴露在鎘脅迫壓力下時(shí)，枯草芽孢桿菌的生理代謝會(huì)受到明顯抑制。然而如前所述，可能由于生物炭能幫助枯草芽孢桿菌規(guī)避鎘毒性，并可為細(xì)菌生長提供營養(yǎng)，因此在細(xì)菌應(yīng)對(duì)鎘脅迫的生理響應(yīng)上產(chǎn)生明顯影響，從而導(dǎo)致其基因表達(dá)差異顯著。

圖2 各實(shí)驗(yàn)/對(duì)照組間的差異表達(dá)基因數(shù)量（a）及其差異表達(dá)基因火山圖分布（P＜0.05，|log2差異倍數(shù)|＞0）（b）～（f）Figure 2 Numbers of differentially expressed genes（a）and volcano plot of the differentially expressed genes in the experimental/control groups（P＜0.05，|log2 Fold Change|＞0）（b）～（f）

2.3 枯草芽孢桿菌在不同體系中的GO功能富集

2.3.1 鎘脅迫/生物炭添加前后枯草芽孢桿菌重要功能條目表達(dá)變化

GO 功能富集揭示了各實(shí)驗(yàn)/對(duì)照組重要功能條目相關(guān)基因的上/下調(diào)情況。BS_CdvsBS組的差異基因GO 功能富集分析結(jié)果如圖3（a）所示，BS_CdvsBS以BS_Cd 為實(shí)驗(yàn)組、BS 為對(duì)照組。圖3（a）顯示，在鎘脅迫下，上調(diào)的差異表達(dá)基因主要?dú)w類為蛋白質(zhì)復(fù)合物（Protein-containing complex）、離子轉(zhuǎn)運(yùn)（Ion transport）、細(xì)胞器（Organelle）、陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（Cation transmembrane transporter activity）、運(yùn)動(dòng)（Locomotion）。這表明在鎘壓力下，枯草芽孢桿菌通過調(diào)控陽離子運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)來加快溶液中鎘的去除。此外，差異基因在蛋白質(zhì)復(fù)合物方面也出現(xiàn)了正向調(diào)控，特別是CotA基因表達(dá)上調(diào)。CotA 是枯草芽孢桿菌的芽孢外壁蛋白，可以保護(hù)細(xì)菌免受紫外線輻射和過氧化物的損害[31]，因此該生物功能的正向調(diào)控可能有助于細(xì)菌隔絕溶液中鎘的直接毒害。下調(diào)的差異基因主要?dú)w類為氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity）、肽酶活性（Peptidase activity，acting on L-amino acid peptides）、維生素生物合成過程（Vitamin biosynthetic process）。整體來看，GO 富集分析在細(xì)胞組分分類中的上調(diào)基因數(shù)量均多于下調(diào)基因，同時(shí)在生物學(xué)過程分類中的離子轉(zhuǎn)運(yùn)和運(yùn)動(dòng)功能條目、分子功能中的陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性功能條目中，上調(diào)基因數(shù)量也多于下調(diào)基因。而在生物學(xué)過程分類中的維生素合成功能條目、分子功能分類中的氧化還原酶和水解酶活性功能條目中，下調(diào)基因數(shù)量要多于上調(diào)基因。此外，值得一提的是運(yùn)動(dòng)功能條目，其差異基因表達(dá)全部為上調(diào)，這意味著鎘壓力明顯增強(qiáng)了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能。盡管枯草芽孢桿菌面對(duì)鎘毒性會(huì)產(chǎn)生上述自衛(wèi)反應(yīng)，但鎘脅迫對(duì)枯草芽孢桿菌的侵害仍然是直接且不可避免的，在鎘毒性下，枯草芽孢桿菌的部分生理代謝功能仍然受到了明顯抑制。

圖3 BS_Cd vs BS組（a）和BS_C vs BS組（b）的差異基因GO功能富集分析Figure 3 GO function enrichment analysis of differentially expressed genes in BS_Cd vs BS（a）and BS_C vs BS（b）groups

BS_CvsBS以BS_C為處理組、BS為對(duì)照組。圖3（b）顯示，添加生物炭后，GO 富集分析在細(xì)胞組分分類中上調(diào)基因數(shù)量均多于下調(diào)基因。上調(diào)的差異表達(dá)基因主要?dú)w類為細(xì)胞（Cell）、胞內(nèi)（Intracellular）、水解酶活性（Hydrolase activity，hydrolyzing O-glycosyl compounds）、催化復(fù)合體（Catalytic complex）、核糖核蛋白復(fù)合物的生物合成（Ribonucleoprotein complex biogenesis）。下調(diào)的差異基因主要?dú)w類為各種生物大分子合成及代謝調(diào)控，包括RNA 合成和DNA 的轉(zhuǎn)錄過程，以及各種轉(zhuǎn)移酶活性。從增強(qiáng)的基因功能條目來看，生物炭的添加對(duì)枯草芽孢桿菌的細(xì)胞組分相關(guān)功能產(chǎn)生了積極影響，但對(duì)其生物合成和各種轉(zhuǎn)移酶活性產(chǎn)生了負(fù)面影響。

2.3.2 生物炭-鎘脅迫體系中枯草芽孢桿菌重要功能條目表達(dá)變化

BS_C_CdvsBS_C 是以BS_C_Cd 為處理組、BS_C為對(duì)照組。圖4（a）顯示，上調(diào)的差異基因包括細(xì)胞組分的各功能條目和分子功能下的各種底物/離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能條目，特別是轉(zhuǎn)運(yùn)活性（Transporter activity）。此外，在生物學(xué)過程分類下的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（Cell motility）、趨化性（Chemotaxis）、纖毛或鞭毛依賴的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（Cilium or flagellum-dependent cell motility）、運(yùn)動(dòng)（Locomotion）、細(xì)胞或亞細(xì)胞組分的移動(dòng)（Movement of cell or subcellular component）和趨避性（Taxis）功能條目中，差異基因表達(dá)全部為上調(diào)。下調(diào)的差異基因主要為維生素的生物合成和代謝過程，以及內(nèi)肽酶活性。這表明相對(duì)于BS_C 體系，BS_C_Cd 體系中的枯草芽孢桿菌受到鎘脅迫時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)部的一些生物合成和代謝過程會(huì)受到抑制，但是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)明顯增強(qiáng)（或許會(huì)向生物炭表面和內(nèi)部運(yùn)動(dòng)），從而使其有效規(guī)避鎘毒性壓力。并且，細(xì)菌的離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能也得到明顯增強(qiáng)，這可能提高了枯草芽孢桿菌的鎘轉(zhuǎn)移能力。

圖4 BS_C_Cd vs BS_C組（a）和BS_C_Cd vs BS_Cd組（b）的差異基因GO功能富集分析Figure 4 GO function enrichment analysis of differentially expressed genes in BS_C_Cd vs BS_C（a）and BS_C_Cd vs BS_Cd（b）groups

如前所述，除上述3 組樣品間的差異基因分析外，本研究對(duì)BS_C_Cd 和BS_Cd 的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果也進(jìn)行了對(duì)比分析，用以參考性地認(rèn)識(shí)生物炭刺激枯草芽孢桿菌活性后，枯草芽孢桿菌對(duì)鎘脅迫壓力的生理響應(yīng)是否與正常狀態(tài)下的鎘應(yīng)對(duì)措施有所不同。圖4（b）顯示，GO 富集分析在大部分功能條目中的上調(diào)基因數(shù)量都多于下調(diào)基因。上調(diào)的差異基因主要有小分子結(jié)合（Small molecule binding）、核苷酸結(jié)合（Nucleotide binding）、核苷磷酸結(jié)合（Nucleoside phosphate binding）、裂解酶活性（Lyase activity）、氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity，acting on CH-OH group of donors）、膜的內(nèi)在組分（Intrinsic component of membrane）、膜的必需組分（Integral component of membrane）、細(xì)胞（Cell）、細(xì)胞組分（Cell part）、細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm）、胞內(nèi)（Intracellular）、輔因子生物合成過程（Cofactor biosynthetic process）、輔因子代謝過程（Cofactor metabolic process）、單羧酸生物合成過程（Monocarboxylic acid biosynthetic process）、單羧酸代謝過程（Monocarboxylic acid metabolic process）、有機(jī)磷生物合成過程（Organophosphate biosynthetic process）、有機(jī)磷代謝過程（Organophosphate metabolic process）、含磷化合物代謝過程（Phosphate-containing compound metabolic process）、磷代謝過程（Phosphorus metabolic process）、四吡咯生物合成過程（Tetrapyrrole biosynthetic process）、四吡咯代謝過程（Tetrapyrrole metabolic process）。下調(diào)的差異基因有細(xì)胞外圍（Cell periphery）、質(zhì)膜（Plasma membrane）和激酶活性（Kinase activity）。可以看到，相比于單一含鎘體系，生物炭的存在增強(qiáng)了枯草芽孢桿菌體內(nèi)各種生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能基因的表達(dá)，這與前文生物炭為枯草芽孢桿菌提供營養(yǎng)的說法相一致。張秋等[32]探究了生物炭對(duì)鎘污染土壤團(tuán)聚體酶活性的影響，結(jié)果顯示，生物炭顯著提升了鎘污染土壤團(tuán)聚體的酶活性，尤其是在碳循環(huán)酶中的蛋白酶和氧化還原酶中的過氧化氫酶處理上表現(xiàn)明顯。本研究認(rèn)為，這可能是因?yàn)樯锾扛牧己吞岣吡藞F(tuán)聚體的結(jié)構(gòu)和性能，形成了對(duì)微生物更有利的生存環(huán)境，同時(shí)對(duì)土壤中重金屬有效態(tài)的鈍化作用也促進(jìn)了作物根系的生長，但對(duì)酶活性變化機(jī)理并未進(jìn)行深入討論。生物炭也促進(jìn)了細(xì)菌在鎘環(huán)境下對(duì)含磷化合物的合成和代謝。有研究指出[33]，微生物分泌的有機(jī)酸會(huì)在生物炭表面形成弱酸性的微環(huán)境，促進(jìn)生物炭中磷的釋放，使重金屬與其形成穩(wěn)定的磷化合物進(jìn)而被長期固定在生物炭表面。此外值得注意的是，陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因czcD和重金屬外流泵蛋白相關(guān)基因cadA在BS_CdvsBS 組的表達(dá)均表現(xiàn)為下調(diào)，而在BS_C_Cd 和BS_Cd 的對(duì)比結(jié)果中則呈現(xiàn)為上調(diào)。czcD基因已被證明是金屬抗性基因[34]。并且研究發(fā)現(xiàn)，鎘的抗性基因系統(tǒng)主要有czc 和cad 兩種，cadA基因存在于包括葡萄球菌屬、微球菌屬及鹽芽孢桿菌屬等多種細(xì)菌基因組中，菌株通過該基因所編碼的酶將鎘泵出菌體外，從而起到解毒作用[35]。因此，czcD和cadA基因在BS_C_Cd 和BS_Cd 組中的表達(dá)上調(diào)，意味著生物炭可能激活了枯草芽孢桿菌體內(nèi)鎘抗性基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)了其對(duì)鎘脅迫的抵抗能力。并且膜相關(guān)功能條目的差異基因以上調(diào)為主。已有研究通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在生物炭-鎘脅迫體系中確實(shí)形成了生物膜[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)中膜相關(guān)功能條目差異基因的上調(diào)，也進(jìn)一步驗(yàn)證了以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，預(yù)示著體系中早期生物膜發(fā)育跡象。

2.4 枯草芽孢桿菌在不同體系中的KEGG通路富集

2.4.1 鎘脅迫/生物炭添加前后枯草芽孢桿菌代謝通路表達(dá)變化

KEGG 富集分析結(jié)果表明（表1），體系中加入鎘后，枯草芽孢桿菌的鞭毛組裝和細(xì)菌趨化性通路都明顯增強(qiáng)。這兩條通路的增強(qiáng)是枯草芽孢桿菌在鎘脅迫下產(chǎn)生應(yīng)激自衛(wèi)反應(yīng)的直接表現(xiàn)。鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，同時(shí)也在細(xì)菌的表面黏附上起到一定作用[36]。鎘的存在激活了枯草芽孢桿菌鞭毛運(yùn)動(dòng)的開關(guān)FliM，鞭毛組裝通路的增強(qiáng)說明在鎘環(huán)境中，枯草芽孢桿菌通過加快自身運(yùn)動(dòng)來躲避鎘毒性[37]。此外，氧化磷酸化通路也被增強(qiáng)。氧化磷酸化是細(xì)菌生成ATP 的重要途徑之一。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，氧化磷酸化參與了細(xì)胞的抗毒害活動(dòng)，通過促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)能和提高能量轉(zhuǎn)化效率來解毒，證實(shí)了能量衰竭可能是造成毒害的原因[38]。而核黃素代謝和硫傳遞系統(tǒng)相關(guān)通路都受到了明顯抑制，說明細(xì)菌在鎘毒性壓力下部分物質(zhì)代謝能力減弱，進(jìn)一步體現(xiàn)了鎘毒性對(duì)枯草芽孢桿菌代謝活性的抑制。BS_CvsBS處理組的KEGG通路富集分析中，只有淀粉和蔗糖代謝通路表現(xiàn)出顯著富集，說明生物炭的添加顯著增強(qiáng)了枯草芽孢桿菌對(duì)能源物質(zhì)的代謝功能。

表1 各處理/對(duì)照組KEGG顯著富集通路中的差異基因表達(dá)情況Table 1 Expression of the differential genes in KEGG enrichment pathways in the experimental/control groups

2.4.2 生物炭-鎘脅迫體系中枯草芽孢桿菌代謝通路表達(dá)變化

BS_C_CdvsBS_C 處理組的差異基因顯著富集通路情況與BS_CdvsBS 組相似，部分代謝相關(guān)通路（核黃素代謝、硫代謝、不同環(huán)境中的微生物代謝）的基因表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)，但與鞭毛組裝及細(xì)菌趨化性通路相關(guān)的基因表達(dá)則呈現(xiàn)上調(diào)。此外，核糖體和纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸生物合成通路的差異基因表達(dá)也表現(xiàn)出明顯上調(diào)?？梢婃k添加確實(shí)對(duì)細(xì)菌的代謝產(chǎn)生了部分抑制，但是會(huì)明顯增強(qiáng)細(xì)胞躲避壓力和毒性的運(yùn)動(dòng)行為。

而對(duì)BS_C_Cd 和BS_Cd 的差異基因進(jìn)行顯著富集代謝通路分析時(shí)發(fā)現(xiàn)（表2），枯草芽孢桿菌物質(zhì)和能源代謝相關(guān)通路的基因表達(dá)均呈現(xiàn)上調(diào)，包括氨基糖和核苷酸糖代謝、不同環(huán)境中的微生物代謝、碳代謝、糖酵解和糖異生以及磷酸戊糖途徑。這說明生物炭的存在可以緩解鎘脅迫對(duì)枯草芽孢桿菌的毒性效應(yīng)，且可能為細(xì)菌提供了能源，繼而刺激了枯草芽孢桿菌的生命代謝活動(dòng)。這也與周鳳等[39]的研究結(jié)果類似。

表2 BS_C_Cd和BS_Cd差異基因的KEGG顯著富集通路情況Table 2 KEGG enrichment pathway of differentially expressed genes between BS_C_Cd and BS_Cd

差異基因在氨基糖和核苷酸糖代謝、糖酵解和糖異生、磷酸戊糖途徑通路的顯著富集，也揭示了生物膜的早期發(fā)育現(xiàn)象。有研究指出，生物膜發(fā)育過程中，大多數(shù)被測(cè)的代謝途徑都發(fā)生了顯著的動(dòng)態(tài)變化，包括TCA 循環(huán)、糖酵解、核苷酸和氨基酸生物合成等[40]。并且差異基因在細(xì)胞組分顯著富集的功能條目也與膜組成有關(guān)。而在BS_CdvsBS 組中，則沒有表現(xiàn)出任何生物膜形成跡象。已有研究發(fā)現(xiàn)，在生物炭協(xié)同體系中，枯草芽孢桿菌可以附著在生物炭表面及孔道內(nèi)生長，形成復(fù)合體；并且菌體分泌出更多的胞外聚合物，使得細(xì)菌間粘連現(xiàn)象更明顯，這可能是形成生物膜的重要標(biāo)志[15]。生物膜附著在固體載體上，對(duì)機(jī)械應(yīng)力和生物量具有一定的保護(hù)作用，是一種有潛力的工業(yè)廢水處理方法[41]。因此生物膜的形成可以對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生保護(hù)作用，這對(duì)于提高枯草芽孢桿菌對(duì)含鎘廢水的處理能力具有重要意義。

此外，在不顯著富集通路中，與谷胱甘肽代謝相關(guān)的差異基因表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)，但在BS_CdvsBS 組中，相關(guān)的差異基因表達(dá)則呈現(xiàn)下調(diào)。谷胱甘肽具有抗氧化和解毒功能，可防止活性氧物質(zhì)如自由基、過氧化物等對(duì)細(xì)胞造成損害[42]。并且有研究指出，谷胱甘肽在金屬結(jié)合肽的合成中至關(guān)重要，金屬結(jié)合肽可通過形成細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的金屬絡(luò)合物來螯合重金屬[43-44]。因此，該差異基因上調(diào)說明生物炭的存在提高了谷胱甘肽代謝活性，在提高細(xì)菌抗氧化和解毒能力的同時(shí)，可能也對(duì)鎘的去除起到了積極作用。嘌呤代謝、蛋白質(zhì)輸出、細(xì)菌分泌系統(tǒng)這幾個(gè)通路的基因表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)，這可能是由于在BS_Cd 體系中，枯草芽孢桿菌直接暴露于鎘脅迫壓力下，需要更多刺激自身的免疫和保護(hù)功能。而在BS_C_Cd 體系中，受到生物炭的外在物理性保護(hù)和內(nèi)在代謝促進(jìn)，枯草芽孢桿菌受到的鎘脅迫壓力相對(duì)較小，因此對(duì)這些通路的基因表達(dá)刺激較小。

3 結(jié)論

（1）生物炭添加和鎘脅迫均會(huì)導(dǎo)致枯草芽孢桿菌基因表達(dá)差異，但生物炭可以緩解鎘脅迫對(duì)枯草芽孢桿菌的壓力和影響。

（2）在鎘脅迫壓力下，枯草芽孢桿菌的生理代謝功能受到了明顯抑制，但細(xì)菌通過上調(diào)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及鎘轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)來規(guī)避鎘毒性，其鞭毛組裝和細(xì)菌趨化性通路都明顯增強(qiáng)。

（3）生物炭添加對(duì)枯草芽孢桿菌的細(xì)胞組分相關(guān)功能產(chǎn)生了積極影響，并且增強(qiáng)了細(xì)菌對(duì)能源物質(zhì)的代謝功能。

（4）生物炭-鎘脅迫體系中，生物炭增強(qiáng)了枯草芽孢桿菌在鎘脅迫壓力下各種生物過程、細(xì)胞組分和分子功能基因的表達(dá)，包括細(xì)菌對(duì)含磷化合物的合成和代謝，以及細(xì)菌體內(nèi)鎘抗性基因的表達(dá)。