石一凡，李曉彤，劉俊澤，李春梅，李延森

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院家畜環(huán)境控制與智慧生產(chǎn)研究中心，江蘇 南京 210095)

在生豬養(yǎng)殖業(yè)中，公豬發(fā)揮重要作用。為了提高優(yōu)質(zhì)公豬資源的利用率，降低飼養(yǎng)成本，同時(shí)降低動(dòng)物之間疾病的傳播風(fēng)險(xiǎn)，人工授精被廣泛用于養(yǎng)豬業(yè)。液體形式儲(chǔ)存的公豬精液在豬的人工授精中較為普遍，但精子對(duì)溫度變化比較敏感，多于15～17 ℃條件下保存運(yùn)輸，在稀釋液中可維持精子生育能力3～7 d[1-2]，當(dāng)溫度升高時(shí)精子活力明顯降低。

精液保存中最大的問(wèn)題是在保存過(guò)程中對(duì)精子結(jié)構(gòu)的損害，導(dǎo)致精子的生育能力差[3]。精子在保存過(guò)程中生育能力降低的機(jī)制尚不完全清楚。然而，最近人們對(duì)活性氧(reactive oxygen species，ROS)在保存過(guò)程中對(duì)精子功能和受精能力的作用越來(lái)越感興趣。適宜水平的ROS對(duì)于正常受精、獲能、運(yùn)動(dòng)和頂體反應(yīng)是必不可少的[4]。據(jù)報(bào)道，在精液保存和人工授精的各種過(guò)程中，由于過(guò)度或不適當(dāng)形成的ROS造成氧化損傷，精子活力和生育能力降低[5]。精子分化程度高，無(wú)DNA修復(fù)機(jī)制，細(xì)胞膜含較高水平的多不飽和脂肪酸，且本身細(xì)胞質(zhì)抗氧化酶少，更易受氧化應(yīng)激損傷[6]。精子功能障礙和ROS的過(guò)量產(chǎn)生之間存在關(guān)聯(lián)，高溫引起損傷的機(jī)制之一是氧化應(yīng)激。精子質(zhì)膜過(guò)氧化損傷被認(rèn)為是雄性不育的重要病理機(jī)制[7-8]。已知脂質(zhì)過(guò)氧化物可引起精子細(xì)胞的各種損傷，如膜損傷和運(yùn)動(dòng)性降低[9]。許多研究表明，膜脂質(zhì)過(guò)氧化是保存在4 ℃的液體精液[10]和冷凍保存的精液[11]中精子功能缺陷的原因之一。此外，熱應(yīng)激誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會(huì)促進(jìn)過(guò)早獲能，并增加獲能和頂體反應(yīng)精子的比例[12]。這種過(guò)早獲能的狀態(tài)會(huì)降低精子的壽命、受精和胚胎發(fā)育速度。精子細(xì)胞可能攜帶誘導(dǎo)卵母細(xì)胞損傷的代謝物，如脂質(zhì)過(guò)氧化和抗氧化劑的減少，損害胚胎發(fā)育[13]。因此，隨著保存時(shí)間和溫度的增加，精子產(chǎn)生過(guò)多的ROS可能會(huì)對(duì)精子造成損傷，進(jìn)而對(duì)精子質(zhì)量產(chǎn)生影響，影響母豬受孕率及產(chǎn)仔數(shù)[14]。

維甲酸(retinoic acid，RA)是維生素A進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后的活性代謝物，有調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原平衡的能力。研究表明，人類精子上有維甲酸受體α(retinoic acid receptor α，RARα)蛋白表達(dá)，且在精索靜脈曲張患者精子中表達(dá)降低，這暗示RA與精子活力有一定關(guān)系[15]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，RA能改善高溫對(duì)小鼠附睪精子活力產(chǎn)生的影響，提高小鼠睪丸抗氧化能力[16]。用濃度為100 nmol·L-1RA處理人精子，可使其存活率顯著升高，精子丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量降低，重新調(diào)整精子能量代謝水平，提示給予RA補(bǔ)充可能是治療男性不育的一種有前途的治療方法[17]?；谝陨涎芯?，本文首先確立體外熱損傷模型參數(shù)，其次篩選適宜RA處理劑量，并確定豬精子中是否表達(dá)RARα，探究體外高溫處理對(duì)豬精子的影響以及RA的保護(hù)作用，以期為延長(zhǎng)公豬精液體外保存期限提供策略。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

成年大約克夏種公豬精液(活力>70%)，購(gòu)自江蘇省南通市如東縣日昇畜牧養(yǎng)殖有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)試劑

EBSS購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司；RA、Triton X-100購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；DMSO購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、PBS、RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；總膽固醇、甘油三酯、丙酮酸、MDA、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)和總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；RARα抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；Alexa flour 488、DAPI染液購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 建立高溫體外豬精子損傷模型

將相同來(lái)源的精液隨機(jī)分為5組：0、1、2、3和4 h組，每組3個(gè)重復(fù)，為了消除精液稀釋液中其他物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)的影響，將精液1 000g離心15 min，棄去上清，加入EBSS培養(yǎng)基重懸，分別于39 ℃中孵育0、1、2、3和4 h后，利用計(jì)算機(jī)輔助精子分析方法(computer-aided sperm analysis，CASA)測(cè)定不同組別精子活力，選出適合的孵育時(shí)間用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 篩選RA適宜添加濃度

將相同來(lái)源的精液隨機(jī)分為6組，用不含RA(CON組)和含不同濃度RA(10、50、100和1 000 nmol·L-1組)的EBSS重懸(RA用DMSO溶解)，DMSO組用含相應(yīng)劑量DMSO的EBSS重懸，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，39 ℃下孵育3 h，測(cè)定精子活力，篩選出RA的最適添加濃度用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 RA對(duì)體外高溫條件下豬精子活力的影響

將相同來(lái)源的精液隨機(jī)分為4組，分別為：37 ℃、37 ℃+RA、39 ℃、39 ℃+RA，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，精液1 000g離心后加入EBSS重懸，根據(jù)1.3.2中得出的RA濃度，37 ℃+RA組和39 ℃+RA組培養(yǎng)基中RA終濃度為100 nmol·L-1，37 ℃組和39 ℃組培養(yǎng)基中不含RA；37 ℃組和37 ℃+RA組于37 ℃下孵育3 h，39 ℃組和39 ℃+RA組于39 ℃下孵育3 h，測(cè)定精子活力。

1.4 樣品采集

將1.3.3中樣品處理完成后，精液1 000g離心15 min，精子用PBS洗滌2遍后儲(chǔ)存于200 μL離心管中，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.5.1 精子活力測(cè)定

將載玻片和蓋玻片置于37 ℃載物臺(tái)上預(yù)熱，用移液槍將樣品輕輕吹打混勻，吸取10 μL于預(yù)熱的載玻片上，加蓋蓋玻片，立即在400倍顯微鏡下觀察精子，每個(gè)樣品至少選取5個(gè)視野，利用CASA檢測(cè)精子活力。精子活力根據(jù)其運(yùn)動(dòng)特征劃分為：總活力、前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子比例、快速運(yùn)動(dòng)精子比例、慢速運(yùn)動(dòng)精子比例、原地運(yùn)動(dòng)精子比例和不運(yùn)動(dòng)精子比例。

1.5.2 精子代謝指標(biāo)測(cè)定

向精子樣品中加入RIPA裂解液，充分裂解后，10 000g離心5 min，收集上清液，按照試劑盒說(shuō)明書中步驟測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。采用比色法測(cè)定精子中丙酮酸含量：丙酮酸能與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)物在堿性溶液中顯紅棕色，顏色深淺與丙酮酸含量成正比。采用葡萄氧化酶法測(cè)定精子中葡萄糖含量。采用COD-PAP法測(cè)定精子中總膽固醇含量：反應(yīng)生成的醌類化合物顏色深淺與膽固醇的含量成正比。采用CPO-PAP法測(cè)定精子中甘油三酯含量：反應(yīng)生成的醌類化合物顏色深淺與甘油三酯的含量成正比。

1.5.3 精子抗氧化性能測(cè)定

向精子樣品中加入RIPA裂解液，充分裂解后，10 000g離心5 min，收集上清液，使用TBA法測(cè)定精子MDA含量，分別采用羥胺法、鉬酸銨法、比色法和FRAP法測(cè)定精子T-SOD、CAT、GSH-PX和T-AOC。步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5.4 精子RARα的定位

將精液樣本1 000g離心15 min，PBS洗滌2遍，使用2% PFA/PBS將精子固定30 min，取20 μL精液涂片，在超凈臺(tái)自然風(fēng)干。加100 μL含0.5% Triton X-100的PBS通透10 min，PBS洗滌3次，置于搖床上，每次5 min。用免疫組化筆在精子周圍畫圈，在圈內(nèi)滴加200 μL含10% BSA的PBS室溫封閉30 min。甩去封閉液，然后滴加RARα抗體(1∶200稀釋)作為一抗4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次，然后滴加Alexa flour 488(1∶200稀釋)作為二抗37 ℃孵育15 min。不滴加一抗的精子細(xì)胞作為陰性對(duì)照。PBS洗滌3次后，加DAPI染液避光孵育10 min。PBS洗滌3次后，滴加3滴抗淬滅劑，加蓋蓋玻片，立即在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel 2010進(jìn)行整理，用SPSS 25.0分別對(duì)處理時(shí)間篩選試驗(yàn)結(jié)果和濃度篩選試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan法進(jìn)行多重比較。對(duì)RA和溫度兩因子水平試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 高溫條件下不同處理時(shí)間對(duì)體外豬精子活力的影響

在39 ℃條件下孵育不同時(shí)間對(duì)精子活力的影響如圖1所示。與處理前相比，39 ℃處理2、3和4 h后精子總活力均顯著降低(P<0.05)；39 ℃處理4 h后前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子比例和快速運(yùn)動(dòng)精子比例顯著降低(P<0.05)；39 ℃處理2 h和3 h后慢速運(yùn)動(dòng)精子比例顯著增加(P<0.05)；39 ℃處理2 h和3 h后原地運(yùn)動(dòng)精子比例顯著升高(P<0.05)；39 ℃處理2、3和4 h后不運(yùn)動(dòng)精子比例顯著升高(P<0.05)。隨著孵育時(shí)間的增加，精子的運(yùn)動(dòng)性能逐漸變差。因此，本試驗(yàn)選擇39 ℃孵育3 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 高溫條件下不同濃度RA對(duì)體外豬精子活力的影響

不同濃度RA對(duì)高溫條件下豬精子活力的影響如圖2所示。培養(yǎng)基中添加DMSO不會(huì)對(duì)精子活力產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，培養(yǎng)基中含50 nmol·L-1和100 nmol·L-1RA能顯著提高精子總活力(P<0.05)，顯著降低不運(yùn)動(dòng)精子比例(P<0.05)，含10 nmol·L-1和100 nmol·L-1RA能顯著提高前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子比例，且濃度為100 nmol·L-1作用效果最好。更高的劑量1 000 nmol·L-1RA未對(duì)精子運(yùn)動(dòng)性能產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。因此，選用100 nmol·L-1濃度RA繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3 RA對(duì)體外高溫條件下豬精子運(yùn)動(dòng)能力的影響

培養(yǎng)基中含100 nmol·L-1RA對(duì)體外高溫條件下豬精子運(yùn)動(dòng)能力的影響如圖3所示。由圖3可知，與37 ℃相比，39 ℃培養(yǎng)3 h會(huì)顯著降低精子總活力及前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子比例(P<0.05)，顯著提高不運(yùn)動(dòng)精子比例(P<0.05)，培養(yǎng)基中含100 nmol·L-1RA能顯著降低原地運(yùn)動(dòng)精子比例(P<0.05)。與39 ℃相比，培養(yǎng)基中含100 nmol·L-1RA能顯著提高精子總活力、前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子比例以及快速運(yùn)動(dòng)精子比例(P<0.05)，顯著降低不運(yùn)動(dòng)精子比例(P<0.05)。說(shuō)明高溫能顯著降低體外培養(yǎng)精子運(yùn)動(dòng)能力，100 nmol·L-1RA能使熱處理精子運(yùn)動(dòng)能力得到顯著改善。

采用雙因素方差分析溫度和RA的互作效應(yīng)T*RA；*表示差異顯著(P<0.05)；孵育時(shí)間為3 h。

2.4 RA對(duì)體外高溫條件下豬精子抗氧化性能的影響

培養(yǎng)基中含100 nmol·L-1RA對(duì)高溫條件下體外豬精子抗氧化能力的影響如圖4所示。由圖可知，與37 ℃相比，39 ℃培養(yǎng)能顯著增加精子MDA水平(P<0.05)，降低精子T-SOD活力(P<0.05)；與39 ℃相比，培養(yǎng)基中含100 nmol·L-1RA能顯著降低精子MDA水平(P<0.05)，提高精子T-SOD活力(P<0.05)。

采用雙因素方差分析溫度和RA的互作效應(yīng)T*RA；*表示差異顯著(P<0.05)；孵育時(shí)間為3 h。

2.5 RA對(duì)體外高溫條件下豬精子脂質(zhì)和葡萄糖代謝的影響

培養(yǎng)基中含100 nmol·L-1RA對(duì)體外高溫條件下公豬精子代謝的影響如圖5所示。由圖可知，熱處理和RA處理對(duì)精子丙酮酸、葡萄糖、總膽固醇及甘油三酯含量無(wú)顯著影響。

采用雙因素方差分析溫度和RA的互作效應(yīng)T*RA。

2.6 豬精子RARα的定位及其與RA關(guān)系

豬精子RARα的免疫熒光定位結(jié)果如圖6所示。豬精子RARα蛋白表達(dá)主要集中在精子尾部的主段和末段，頭部和富含線粒體的中段有較弱表達(dá)，但不明顯。如圖可見，培養(yǎng)基中添加100 nmol·L-1RA未發(fā)現(xiàn)與未添加RA組精子RARα表達(dá)位置的明顯變化。

3 討論

當(dāng)環(huán)境溫度超過(guò)其熱中性區(qū)的上限時(shí)，豬就會(huì)發(fā)生熱應(yīng)激。熱應(yīng)激會(huì)影響所有類型的睪丸細(xì)胞，其中精子發(fā)生過(guò)程較易受到熱應(yīng)激的影響[18]。精子形成后對(duì)環(huán)境變化同樣敏感，睪丸溫度升高對(duì)精子活力、形態(tài)和受精能力都會(huì)產(chǎn)生有害影響。當(dāng)睪丸受熱的雄性精子被用來(lái)繁殖胚胎時(shí)，胚胎死亡率增加，發(fā)育通常會(huì)受阻。使用暴露在高溫下的雄性精子進(jìn)行體外受精時(shí)，精子穿透率、受精率和原核形成率都會(huì)下降，早期胚胎發(fā)育異常也會(huì)增加[18]。從陰囊隔離的公牛身上采集的精子進(jìn)行體外受精后，胚胎發(fā)育率降低，這是因?yàn)樾螒B(tài)異常的精子比例很高[19]。精子細(xì)胞離開睪丸后，也很容易受到環(huán)境變化的影響。研究表明，精子細(xì)胞在受精前暴露于熱應(yīng)激雌性生殖道中的高溫環(huán)境條件，對(duì)精子功能的影響可以在一年中的溫暖月份持續(xù)存在[20-21]。精子運(yùn)動(dòng)性能與公豬繁殖性能顯著相關(guān)，運(yùn)動(dòng)性能的降低也意味著繁殖性能變差[22]。

本試驗(yàn)為探究RA對(duì)高溫下體外豬精子活力的影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究，試驗(yàn)選擇首先將精子置于39 ℃培養(yǎng)箱中孵育不同時(shí)間，測(cè)定精子運(yùn)動(dòng)性能，發(fā)現(xiàn)在39 ℃條件下，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，精子活力隨之降低，不運(yùn)動(dòng)精子比例隨之升高，孵育4 h時(shí)活力下降最多，最終選擇3 h孵育時(shí)間。然后為篩選RA適宜添加濃度，在39 ℃條件下添加不同濃度RA孵育3 h，測(cè)定精子活力。我們選擇了Perrotta等[15]和Malivindi等[17]試驗(yàn)中對(duì)人精子的處理劑量：10、50和100 nmol·L-1，并在此基礎(chǔ)上增加了濃度1 000 nmol·L-1，以明確高劑量RA是否對(duì)精子有毒害作用。結(jié)果顯示在10 ～ 100 nmol·L-1之間隨著RA添加劑量的升高，精子活力逐漸改善，且100 nmol·L-1添加劑量效果最好。之前未有試驗(yàn)探究100 nmol·L-1以上RA對(duì)精子活力的影響，在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度增加到1 000 nmol·L-1時(shí)RA對(duì)精子活力的改善作用消失，但并無(wú)有害影響，說(shuō)明在100 ～ 1 000 nmol·L-1之間可能存在更加適宜的濃度。本文研究結(jié)果表明，100 nmol·L-1RA能顯著提高體外高溫條件下的精子總活力、前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子比例以及快速運(yùn)動(dòng)精子比例，顯著降低不運(yùn)動(dòng)精子比例，表明精液稀釋液中添加適宜劑量的RA可通過(guò)改變精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，來(lái)提高精液品質(zhì)，而RA具體添加量還需進(jìn)一步試驗(yàn)確定。

評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)精子影響的一個(gè)簡(jiǎn)單指標(biāo)是精子和精漿MDA的測(cè)定，MDA是一種穩(wěn)定的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物[23]。而評(píng)估精子抗氧化性能的指標(biāo)一般有T-SOD、CAT和T-AOC等。SOD是一種高度特異性的超氧陰離子自由基清除酶，催化超氧化物歧化為氧和過(guò)氧化氫，其活性的變化可能導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生不平衡。本試驗(yàn)結(jié)果表明，39 ℃熱處理后精子MDA水平顯著升高，T-SOD活力顯著降低。RA處理后能顯著降低熱處理精子的MDA水平，顯著提高精子T-SOD活力。Malivindi等[17]研究也表明，RA能降低精子的MDA水平，提高精子SOD和GST活力。

精子細(xì)胞可以獨(dú)立調(diào)節(jié)自身的代謝[24]，根據(jù)其能量需求自主調(diào)節(jié)能量底物的利用[25]。在體細(xì)胞中已觀察到RA在脂質(zhì)代謝中的作用，能調(diào)節(jié)成年動(dòng)物的能量平衡和肥胖[26]。已有研究表明，RA能重新調(diào)整精子的代謝，以提高精子的存活率和獲能能力[17]。誘導(dǎo)獲能的物質(zhì)具有降低甘油三酯含量的作用，同時(shí)伴隨著與能量消耗有關(guān)的一些酶活性的增加[27]。獲能的精子表現(xiàn)出更高的代謝率和總體能量消耗。因此，可以概括地說(shuō)，在獲能過(guò)程中，能量需求增加，總體能量消耗，與分解代謝有關(guān)。從這個(gè)角度出發(fā)，我們研究了RA對(duì)高溫引起的精子運(yùn)動(dòng)能力改變的保護(hù)作用是否會(huì)涉及葡萄糖和脂質(zhì)代謝的具體變化。膽固醇是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的重要組成部分，它在促進(jìn)膜穩(wěn)定性的同時(shí)保證了膜的流動(dòng)性，在確保精子的正常代謝方面起了重要作用。有氧糖酵解是許多哺乳動(dòng)物精子運(yùn)動(dòng)和獲能的主要ATP來(lái)源[28]。糖酵解底物對(duì)于運(yùn)動(dòng)[29]、與獲能相關(guān)的蛋白酪氨酸磷酸化和過(guò)度激活[30]以及受精[31]都是必不可少的。乳酸脫氫酶催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，同時(shí)伴隨NADH氧化為NAD+，這是糖酵解持續(xù)產(chǎn)生ATP所必須的。因此，丙酮酸含量也反應(yīng)了糖代謝水平[32]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，39 ℃熱處理及RA處理對(duì)精子中丙酮酸、葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇無(wú)顯著影響?？赡苁翘幚頃r(shí)間還未引起代謝發(fā)生顯著變化。

RA是精子發(fā)育和成熟所必需的維生素A的主要生物活性形式[33]。RA的生物學(xué)效應(yīng)是通過(guò)特定的核受體RAR介導(dǎo)的，RARα是一個(gè)具有轉(zhuǎn)錄因子作用的核受體，它與視黃酸X受體形成異二聚體后，可以與許多基因啟動(dòng)子中的RA反應(yīng)元件結(jié)合，控制基因表達(dá)，現(xiàn)已證明其可在支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞中表達(dá)[34-35]。RA通過(guò)其受體在雄性生殖過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)小鼠遺傳學(xué)研究證明了RARα在睪丸和附睪中起關(guān)鍵作用，在這些研究中，RARα基因的破壞導(dǎo)致了許多精子發(fā)生和不育的缺陷[36-37]。另外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)不同活力的人精子中RARα的蛋白表達(dá)水平不同，利用RA處理精子，可提高精子存活率和抗氧化力[15，17]。在本試驗(yàn)中，通過(guò)免疫熒光測(cè)定發(fā)現(xiàn)，RARα蛋白主要在豬精子的頸部和尾部主段表達(dá)，這為通過(guò)精液稀釋液中添加RA提高精子活力提供理論支持。但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加RA未明顯改變精子富含線粒體部位的RARα蛋白的表達(dá)，說(shuō)明RA并不是通過(guò)改變RARα蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

綜上所述，39 ℃熱處理會(huì)降低精子總活力、前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子比例和快速運(yùn)動(dòng)精子比例，提高慢速運(yùn)動(dòng)和不運(yùn)動(dòng)精子比例，且隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)影響增加。當(dāng)培養(yǎng)液中添加RA時(shí)，熱處理精子的丙酮酸、葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇含量無(wú)顯著改變，但精子MDA含量顯著降低，T-SOD活性顯著提高，精子運(yùn)動(dòng)能力顯著改善，表明RA能維持高溫條件下精子抗氧化能力和精子活力。本試驗(yàn)中添加100 nmol·L-1RA效果最好，為RA作為精液稀釋液中提高精子活力、保護(hù)精子免受氧化應(yīng)激損傷的有效成分提供理論依據(jù)。