李秀秀，汪 琦

（1.德州市德城區(qū)疾病預(yù)防控制中心，山東德州 253000；2.樂(lè)陵市疾病預(yù)防控制中心，山東德州 253600）

沙門(mén)氏菌（Salmonella）是一類常見(jiàn)的食源性病原菌，為革蘭氏陰性桿菌，被認(rèn)為是食品和水源中最主要的致病菌之一[1]。全球每年有數(shù)百萬(wàn)人因攝入受污染的食物或水而感染沙門(mén)氏菌，導(dǎo)致食物中毒，對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2]。因此，對(duì)食品、水源的生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售過(guò)程中的沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)至關(guān)重要。

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、酶聯(lián)免疫法、恒溫?zé)晒夂怂釞z測(cè)法等各種快速檢測(cè)技術(shù)被應(yīng)用于沙門(mén)氏菌的檢測(cè)中。其中，PCR技術(shù)是最常用的方法之一[3]。但PCR技術(shù)也存在一定的局限性，其需要專門(mén)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和技術(shù)人員進(jìn)行操作，且對(duì)樣品預(yù)處理和提取DNA的要求較高[4]。選擇性培養(yǎng)基通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，使目標(biāo)微生物得以生長(zhǎng)和繁殖，同時(shí)限制其他微生物的生長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)高特異性的檢測(cè)，被廣泛應(yīng)用于分離、鑒定和定量目標(biāo)微生物[5]。

本研究通過(guò)比較不同選擇性培養(yǎng)基對(duì)沙門(mén)氏菌檢測(cè)效果的影響，篩選適用于沙門(mén)氏菌檢測(cè)的培養(yǎng)基，為沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)，為食品安全監(jiān)管和公共衛(wèi)生管理提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

目標(biāo)菌株：鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌CMCC（B）50093。干擾菌株：糞腸球菌ATCC29212、奇異變形桿菌CMCC（B）49005、大腸埃希氏菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基；沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基；HE瓊脂培養(yǎng)基；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（復(fù)蘇培養(yǎng)基）；即用型胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（參比培養(yǎng)基）；恒溫培養(yǎng)箱；酒精燈；無(wú)菌培養(yǎng)皿；純化水。

1.2 待測(cè)菌株的檢測(cè)

先進(jìn)行平板制備，分別取47.3 g亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基干粉、34.9 g沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基干粉、90.8 g HE瓊脂培養(yǎng)基產(chǎn)品干粉、57.0 g木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基產(chǎn)品顆粒制備培養(yǎng)基和32.0 g營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，將稱量好的樣品與1000 mL純化水混合加熱，不斷攪拌至完全溶解，冷卻至50 ℃后倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中（至少3 mm厚），置于平臺(tái)上半開(kāi)蓋至瓊脂凝固后蓋蓋備用。

將不同菌株接種在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上置于恒溫培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)1 d進(jìn)行菌株復(fù)蘇，再將不同菌株分別接種在亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基、沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基、HE瓊脂培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上，目標(biāo)菌株采用平均涂布，干擾菌株采用平板劃線（圖1），再次置于恒溫培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)2 d后進(jìn)行鑒定。

圖1 干擾菌株平板劃線示意圖（GB 4789.28—2013）

1.3 鑒定原理

亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的亞硫酸鹽可被沙門(mén)氏菌還原成硫化物，生成的硫化物與硫酸亞鐵反應(yīng)后可使菌落呈現(xiàn)黑色。

沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基中混合色素與沙門(mén)氏菌內(nèi)部特異性酶進(jìn)行反應(yīng)，使沙門(mén)氏菌群落呈紫紅色。

HE瓊脂培養(yǎng)基中的硫代硫酸鈉和檸檬酸鐵銨可與部分可發(fā)酵糖類的沙門(mén)氏菌產(chǎn)生的硫化氫反應(yīng)，該反應(yīng)可使菌落中心部位呈黑色，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)；同時(shí)培養(yǎng)基中的麝香草酚藍(lán)等酸堿指示劑也可將群落顯色為橘黃色群落和藍(lán)綠色群落，用于鑒定菌種。

木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基中的木糖經(jīng)沙門(mén)氏菌發(fā)酵后產(chǎn)生酸，酸性環(huán)境促進(jìn)沙門(mén)氏菌產(chǎn)生脫羧酶使XLD瓊脂培養(yǎng)基中的賴氨酸脫羧，導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)pH值不斷升高形成堿性環(huán)境，在堿性環(huán)境下硫代硫酸鈉和硫酸亞鐵銨與沙門(mén)氏菌產(chǎn)生的硫化氫反應(yīng)使群落呈黑色。

1.4 生長(zhǎng)率和選擇性測(cè)定

采用生長(zhǎng)率評(píng)價(jià)目標(biāo)菌的檢測(cè)結(jié)果，生長(zhǎng)率的計(jì)算公式為

式中：Pr為生長(zhǎng)率；Ns為待測(cè)培養(yǎng)基平板上的菌落總數(shù)，CFU；N0為和參比培養(yǎng)基平板上的菌落總數(shù)，CFU。

采用生長(zhǎng)指數(shù)（G）作為干擾菌檢測(cè)結(jié)果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)每條劃線上菌落的生長(zhǎng)情況計(jì)算生長(zhǎng)指數(shù)（0≤G≤6），其評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 生長(zhǎng)指數(shù)（G）的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長(zhǎng)情況

如表2所示，在亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基中，鼠傷寒沙門(mén)氏菌易于被檢出，菌落顏色呈黑色并帶金屬光澤，而甲型副傷寒沙門(mén)氏菌相對(duì)較難檢出，其菌落顏色呈現(xiàn)暗綠色，易與其他綠色系菌落混淆（如銅綠假單胞菌），這與甲型副傷寒沙門(mén)氏菌不發(fā)酵糖類產(chǎn)生硫化氫有關(guān)。沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基中鼠傷寒沙門(mén)氏菌和甲型副傷寒沙門(mén)氏菌均有特異性反應(yīng)。HE瓊脂培養(yǎng)基中鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌落中心呈黑色，相較于甲型副傷寒沙門(mén)氏菌更易被檢出。木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基中鼠傷寒沙門(mén)氏菌和甲型副傷寒沙門(mén)氏菌均呈淺紅色菌落且中心呈黑色，檢測(cè)效果較好。

表2 目標(biāo)菌的菌落生長(zhǎng)情況

2.2 不同培養(yǎng)基上干擾菌的生長(zhǎng)情況

如表3所示，4種培養(yǎng)基中，糞腸球菌均受到明顯的抑制，奇異變形桿菌在沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基被抑制。除木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基中的奇異變形桿菌難與鼠傷寒沙門(mén)氏菌相區(qū)分外，其他條件下均可與沙門(mén)氏菌區(qū)分。

表3 干擾菌的菌落生長(zhǎng)情況

2.3 不同培養(yǎng)基目標(biāo)菌的生長(zhǎng)率

如表4所示，4種培養(yǎng)基中，鼠傷寒沙門(mén)氏菌和甲型副傷寒沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)率均較高（＞0.70）。其中，亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基中的2種沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)率最高；沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基中的2種沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)率最低。

表4 不同培養(yǎng)基目標(biāo)菌的生長(zhǎng)率

2.4 不同培養(yǎng)基干擾菌的選擇性

如表5所示，糞腸球菌在4個(gè)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)指數(shù)均小于3，說(shuō)明4個(gè)培養(yǎng)基對(duì)以糞腸球菌為代表的革蘭氏陽(yáng)性菌有明顯的抑制作用；而由于培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)不同，沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基對(duì)奇異變形桿菌、亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基對(duì)大腸埃希氏菌也表現(xiàn)出了明顯的抑制作用。奇異變形桿菌和大腸埃希氏菌在HE瓊脂培養(yǎng)基以及銅綠假單胞菌在4種培養(yǎng)基中均表現(xiàn)出了一定程度的生長(zhǎng)，但其菌落特點(diǎn)與沙門(mén)氏菌存在一定差異，故這些培養(yǎng)基也可作為這些干擾菌的選擇性培養(yǎng)基。

表5 不同培養(yǎng)基干擾菌的生長(zhǎng)指數(shù)

3 結(jié)論

本研究通過(guò)比較4種不同選擇性培養(yǎng)基對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)效果發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌在亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基、沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)、HE瓊脂培養(yǎng)基和木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基中較易分辨；而甲型副傷寒沙門(mén)氏菌因不產(chǎn)硫化氫，在亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基和HE瓊脂培養(yǎng)基中較難區(qū)分。4種干擾菌中，除木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基中的奇異變形桿菌，其他條件下均可與沙門(mén)氏菌區(qū)分；4種培養(yǎng)基中，鼠傷寒沙門(mén)氏菌和甲型副傷寒沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)率均較高（＞0.70）；4種培養(yǎng)基對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有明顯的抑制作用。