劉小飛，于 波，任桂萍，余超然，劉 沖，孫映波，鐘榮輝，馮恩友

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.湛江市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江分院，廣東 湛江 524003；3.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500；4.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；5.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣東 廣州 510640）

【研究意義】非洲菊（Gerberahybrida）是菊科扶郎花屬多年生常綠草本植物，別名扶郎花、舞娘花、燈盞花［1］，原產(chǎn)于南非，在溫度適宜的條件下可周年開花，具有很高的觀賞價值，是世界十大切花之一［2-3］，園藝品種繁多，商品名稱易混淆，不利于種質(zhì)資源的收集與鑒評。因此，開發(fā)適用于非洲菊種質(zhì)資源鑒評的分子標記，可實現(xiàn)對非洲菊種質(zhì)資源的快速鑒評，為非洲菊新品種選育奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】目前，在三色堇［4］、桂花［5］、牡丹［6］、山茶［7］和三角梅［8］等花卉中均已開發(fā)出相應(yīng)的SSR 標記，但有關(guān)非洲菊SSR 標記開發(fā)的報道尚較少［9-10］。林發(fā)壯等［9］對非洲菊‘云南紅’轉(zhuǎn)錄組序列的SSR位點進行挖掘，發(fā)現(xiàn)其SSR 位點豐富，分布密度大，具有較高的多態(tài)性潛能，可作為開發(fā)SSR 標記的有效來源。在菊屬種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中，SSR 分子標記技術(shù)應(yīng)用廣泛。肖雨沙等［11］對南美蟛蜞菊轉(zhuǎn)錄組測序得到的23 338 個SSR 位點設(shè)計引物，隨機選擇200 對引物進行擴增實驗驗證，有效擴增55 對，其中6 對引物特異性高，重復(fù)性好。宋江琴等［12］基于表型性狀和SSR 標記的9 份萬壽菊種質(zhì)遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)9 個材料具有較高的遺傳多樣性，且兩種聚類結(jié)果總體上較為一致。丁紅旭［13］對菊花全長轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果開發(fā) 的SSR 標記進行綜合研究，發(fā)現(xiàn)這些標記在菊花全長轉(zhuǎn)錄組5'UTR 區(qū)擴增多態(tài)性最高，且部分SSR 與對應(yīng)性狀相關(guān)聯(lián)，菊花插穗再生植株和組培苗中SSR 標記的多態(tài)性受5-氮雜胞苷（5-Azacytidine，5-azaC）或甲基磺酸乙酯（Ethyl methane sulfonate，EMS）處理影響。Yuan 等［14］基于SSR 標記多態(tài)性對中國菊花品種進行鑒定和分類，為菊花種質(zhì)資源鑒評奠定了良好基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c】目前非洲菊SSR 標記的開發(fā)和應(yīng)用尚不多見，有關(guān)SSR 標記在非洲菊種質(zhì)資源鑒評和雜交后代快速鑒定中的應(yīng)用研究仍較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】綜上，本研究采用18 對SSR標記對12 份非洲菊種質(zhì)進行親緣關(guān)系分析，構(gòu)建其指紋圖譜，并對部分品種的雜交后代的真假雜種進行鑒定，篩選出可用于非洲菊分子育種的SSR 熒光標記引物，以期為非洲菊種質(zhì)資源鑒評及創(chuàng)新利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2021 年12 月25 日，于湛江市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院從云南寬霆生物科技有限公司購買11 份非洲菊種質(zhì)（表1）的種苗，7 d 后移栽至直徑5 cm 的黑色種植袋，放于大棚苗床上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25～30 ℃，45 d 后移栽至廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所上盆培養(yǎng)；同時從華南師范大學(xué)引種‘深圳5 號’（第12 份種質(zhì)），培養(yǎng)溫度同上。2022 年2 月14 日，取2 月苗齡的非洲菊幼嫩葉片為材料，-80℃保存?zhèn)溆?。受檢的雜交后代以紫水晶（Gerberahybrida‘Zishuijing’）為母本，以粉佳人（Gerberahybrida‘Fenjiaren’）為父本，獲得雜交F1代2 個單株（Gh-1 和Gh-4）；以粉佳人為母本，以紫水晶為父本，獲得雜交F1代1個單株（Gh-5），2023 年7 月13 日，取播種后6月苗齡雜交苗幼嫩葉片為材料，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試材料Table 1 Information of 12 G.hybrida germplasms 12 份非洲菊種質(zhì)信息

試驗用試劑：TaqPlus DNA 聚合酶（B600090，生工生物工程股份有限公司），POP-7TMPolymer〔4363785，ThermoFisher（Applied BiosystemsTM）〕，HiDiFormamide〔4311320，ThermoFisher（Applied BiosystemsTM）〕；其他常用試劑均由生工生物工程股份有限公司提供。

主要儀器：PCR 儀（VeritiTM96well，美國ABI），凝膠成像儀（FR-980A，上海復(fù)日科技有限公司），測序儀（3730XL，美國ABI），臺式高速離心機（TD5A-WS，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司），電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠），電泳槽（DYCP-32B，北京六一儀器廠），UVVis Spectrophotometer（SMA4000，Merinton）。

1.2 DNA 提取

使用Ezup 柱式植物組織基因組DNA 抽屜試劑盒（生工生物工程股份有限公司，B518261），參考劉小飛等［15］方法進行提取，提取DNA 后電泳檢測DNA 質(zhì)量，并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物合成

從非洲菊‘香檳’（Gerberahybrida‘Champagne’）轉(zhuǎn)錄組（SRA accession：PRJNA378315）測序得到的SSR 標記中隨機挑選出2 堿基和3堿基重復(fù)類型的SSR 標記，設(shè)計引物（表2），初篩后，選擇條帶清晰且多態(tài)性好的引物合成帶M13 標記（正向引物，序列為：5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'）的熒光引物，熒光標記6-FAM（藍色）、HEX（綠色）、TAMRA（黑色）和ROX（紅色）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 SSR 引物序列Table 2 SSR primer sequences

1.4 PCR 反應(yīng)體系及程序

PCR 反應(yīng)體系：10×TaqBuffer（含Mg2+）2.5 μL，20～50 ng/μL 模板DNA 1 μL，10 μmol/L 正向引物 0.5 μL，10 μmol/L 反向引物 0.5 μL，10 μmol/L dNTP（mix）0.5 μL，5 U/μLTaq酶0.2 μL，以ddH2O 補足25 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，2～4 個循環(huán)；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.5 毛細管電泳檢測SSR 標記熒光引物的多態(tài)性

參考白松等［16］方法，使用ABI 測序儀（3730 xl）對擴增結(jié)果進行檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Genemapper 軟件分析SSR 數(shù)據(jù)，使用Excel 進行常規(guī)分析。指紋圖譜編碼方法參見文獻［17］，UPGMA 聚類分析方法參見文獻［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 引物篩選結(jié)果

提取12 份非洲菊種質(zhì)的基因組DNA（圖1）后，基于非洲菊‘香檳’轉(zhuǎn)錄組中篩選出50 對SSR 標記（表2），以每對引物PCR 擴增4 個樣品進行初篩。電泳結(jié)果（圖2）顯示，GHSSR-1/6/9/10/13/14/16/17/18/20/21/24/25/30/36/38/39/43共計18 對引物的擴增條帶清晰，多態(tài)性較好，合成帶M13 標記（正向引物）的熒光引物（表3）用于后續(xù)試驗。

圖1 12 份非洲菊種質(zhì)基因組DNA 提取電泳檢測結(jié)果Fig.1 Genomic DNA extraction and electrophoresis detection results of 12 varieties of Gerbera hybrida

圖2 基于50 個SSR 標記設(shè)計引物的PCR 擴增電泳結(jié)果Fig.2 Result of PCR amplification electrophoresis based on 50 SSR markers designed primers

表3 用于毛細管電泳的SSR 引物連接M13 接頭情況Table 3 SSR primer connection M13 connector for capillary electrophoresis

2.2 18 對引物在12 份非洲菊種質(zhì)擴增后的毛細管電泳結(jié)果

使用Genemapper 軟件分析毛細管電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，18 對引物共擴增出74 個等位位點，平均每對引物擴增4.1 個（表4）。其中，GHSSR-1、GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21 多態(tài)性較好，分別擴增出9、7、7 和7 個等位位點，這4 對引物分別帶有HEX（綠色）、6-FAM（藍色）、6-FAM（藍色）和ROX（紅色）標記，SSR 標記類型均分別為AG（2*8）、TCT（3*5）、CA（2*6）和GT（2*6）。綜上，該4 個SSR 標記設(shè)計的引物可作為核心引物用于指紋圖譜構(gòu)建。

表4 18 對引物在12 份非洲菊種質(zhì)PCR 擴增后的毛細管電泳結(jié)果Table 4 Capillary electrophoresis results of 18 pairs of primers after PCR amplification in 12 varieties of Gerbera hybrida

2.3 12 份非洲菊種質(zhì)指紋圖譜構(gòu)建

將4 對核心引物（GHSSR-1、GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21）在12 個非洲菊品種中擴增的等位位點進行串聯(lián)排列，得出對應(yīng)的指紋圖譜編碼。結(jié)果表明，12 個非洲菊品種的編碼均不相同，可有效對不同非洲菊品種進行區(qū)分（表5）。

表5 12 份非洲菊種質(zhì)的DNA 指紋編碼Table 5 DNA fingerprint code of 12 varieties of Gerbera hybrida

2.4 12 份非洲菊種質(zhì)聚類分析

依據(jù)18 對引物在12 份非洲菊種質(zhì)中的毛細管電泳結(jié)果進行UPGMA 聚類，結(jié)果顯示，在遺傳系數(shù)為0.75 時，可將12 個非洲菊品種分為5組：Ⅰ組包含3 個品種，分別是‘云南紅’‘大088’和‘情人’；Ⅱ組包含4 個品種，分別是‘粉佳人’‘粉球’‘真愛’和‘福娃’；Ⅲ組包含3 個品種，分別是‘繡色’‘淑女’和‘黃球’；Ⅳ組包含1 個品種‘紫水晶’；Ⅴ組包含1 個品種‘深圳5 號’（圖3）。

圖3 12 份非洲菊種質(zhì)UPGMA 聚類分析Fig.3 UPGMA cluster analysis of 12 varieties of Gerbera hybrida

2.5 部分非洲菊品種真假雜種鑒定

使 用GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21 3對引物對‘紫水晶’和‘粉佳人’的雜交F1后代進行PCR 擴增，毛細管電泳檢測結(jié)果顯示，上述3 對引物鑒定出兼具雙親特異位點的單株分別是Gh-5、Gh-4 和Gh-1（表6、圖4），單獨1 對引物的鑒定率為33%。綜合3 對引物的鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)受檢的3 個單株均為真雜種，真雜種率為100%。

圖4 3 株雜交F1 實生苗的擴增圖譜Fig.4 Amplification maps of three hybrid F1 seedings

表6 不同 SSR 位點在雜交 F1 實生苗中的分布情況Table 6 Distribution of different SSR loci in hybrid F1 seedings

3 討論

非洲菊具有較高的觀賞價值，在盆栽方面亦有很大的發(fā)展?jié)摿Γ谖覈y以獲得種子，常規(guī)雜交育種時間長［19］，急需可縮短育種周期的技術(shù)體系。同時，從市場上收集的品種因無法有效了解其來源，為育種帶來較大困擾。SSR 分子標記以其穩(wěn)定、高效及多態(tài)性好的優(yōu)點成為種質(zhì)資源鑒評的重要手段［20-21］。王繼華等［10］對來源于Plant genome Network 的非洲菊EST 序列SSR進行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)SSR 重復(fù)單元中，富含A/T核苷酸的重復(fù)單元占據(jù)優(yōu)勢地位，而富含G/C 的重復(fù)單元在基因編碼區(qū)中含量較低。冗余與非冗余的SSR 分布頻率與密度相似，僅存在較小距差，說明可從現(xiàn)有的EST 數(shù)據(jù)中篩選出有效的微衛(wèi)星標記。林發(fā)壯等［9］對非洲菊‘云南紅’轉(zhuǎn)錄組序列的SSR 位點進行挖掘，發(fā)現(xiàn)14 928 個SSR 位點由73 種重復(fù)基序構(gòu)成，（A/T）、（AG/CT、AC/GT）、（AAT/ ATT、AAG/CTT)分別是單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸優(yōu)勢重復(fù)基元，分別占總SSR 重復(fù)類型的62.31%、18.13%和6.93%。類似地，本研究所選用的50 對引物（表2）的SSR 重復(fù)單元中，富含A/T 核苷酸的重復(fù)單元也高于富含G/C 的重復(fù)單元。

非洲菊已有的SSR 分子標記研究中，多集中在SSR 位點信息［9］、SSR 頻率和分布特點分析［10］等方面，在資源鑒評與創(chuàng)新利用方面的研究較少。本研究利用18 對擴增效果穩(wěn)定的SSR 引物檢測了12 份非洲菊種質(zhì)，結(jié)果顯示可以將其分為5組，其中，‘紫水晶’和‘深圳5 號’單獨為一組，與‘粉佳人’親緣關(guān)系較遠，后續(xù)的雜交育種中將首先選用親緣關(guān)系較遠且觀賞性狀優(yōu)良的‘紫水晶’和‘粉佳人’開展試驗，也將選擇‘紫水晶’和‘深圳5 號’為親本開展不同的雜交組合，探索不同品種間的雜交親和性及結(jié)實情況。同 時，以GHSSR-1、GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21 4 對引物為核心，成功構(gòu)建12 份非洲菊種質(zhì)的指紋圖譜，為非洲菊種質(zhì)資源鑒評提供了可靠的SSR 熒光標記引物。在此基礎(chǔ)上，利用GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21 3 對引物對‘粉佳人’和‘紫水晶’的3 個雜交F1后代進行真假雜種鑒定，綜合得出3 個雜交F1后代實生苗均為真雜種，初步建立了非洲菊雜交后代快速鑒定技術(shù)，為縮短非洲菊育種周期奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從云南寬霆生物科技有限公司和華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院共收集了12 份非洲菊種質(zhì)，通過預(yù)實驗篩選出18 對多態(tài)性較好的引物，合成帶M13 接頭的熒光引物。利用其檢測12 份非洲菊材料，經(jīng)毛細管電泳檢測獲得對應(yīng)的多態(tài)性結(jié)果，聚類分析將其分為5 組。同時，借助GHSSR-1、GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21等4 對核心引物構(gòu)建了12 個非洲菊品種的指紋圖譜。利用后3 對引物對‘粉佳人’和‘紫水晶’的雜交F1后代進行真假雜種檢測，綜合3 對引物的結(jié)果判斷3 個單株均為真雜種。本研究為非洲菊種質(zhì)資源鑒評和創(chuàng)新利用提供了可靠的SSR 熒光標記引物，同時，也為非洲菊雜交后代的快速鑒定提供了可用的技術(shù)體系。