李宏月，歐小云，劉 斌

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/廣西大學(xué)食用菌研究所，廣西 南寧 530004；2.廣東茂名農(nóng)林科技職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)系，廣東 茂名 525000）

【研究意義】香菇（Lentinulaedodes）又名香蕈、冬菇，在分類歸屬方面一直存在許多探討和爭(zhēng)論，曾先后被歸入過12 個(gè)不同的屬，1983年從韌傘屬Lentinus轉(zhuǎn)入香菇屬Lentinula，即擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales）光茸菌科（Omphalotaceae）香菇屬（Lentinula），延續(xù)至今。中國是香菇第一大生產(chǎn)國，也是最大的消費(fèi)國。據(jù)中國食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2020 年我國香菇的總產(chǎn)量為1 188.21 萬t，占食用菌總產(chǎn)量的29.25%，為我國食用菌年產(chǎn)量最大、創(chuàng)匯額較高的單品［1］。香菇野生種質(zhì)資源主要分布在澳大利亞、日本、韓國、馬來西亞、朝鮮、越南、泰國等國家，其中屬日本記載最多［2］。我國香菇屬的種類及分布較廣，主要分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，溫帶地區(qū)較少［3］；野生香菇的多樣性中心分布于西北和西南地區(qū)［2］。開展野生香菇種質(zhì)資源的收集、鑒定和評(píng)價(jià)利用，挖掘優(yōu)良野生香菇種質(zhì)可促進(jìn)香菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［4］。分析對(duì)比野生香菇和栽培香菇的生物學(xué)特性，可為香菇優(yōu)良品種的選育提供理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】我國香菇種質(zhì)資源豐富，但香菇栽培品種的命名比較混亂，出現(xiàn)不少同名異物、同物異名等現(xiàn)象，因此香菇菌株的準(zhǔn)確鑒定和命名極有必要。以往的香菇鑒定主要依賴形態(tài)學(xué)方法，但單純的形態(tài)鑒定無法提供準(zhǔn)確的物種信息［5］。目前認(rèn)為形態(tài)學(xué)在食用菌鑒定中可作為輔助手段，但不能作為唯一的鑒定方法［6］。近年來基于分子標(biāo)記的分子生物學(xué)鑒定方法應(yīng)用越來越廣泛［4,7］，由于此方法不易受外界環(huán)境的影響，具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、樣品需求量少等特點(diǎn)，可直接利用菌絲體或子實(shí)體提取DNA 進(jìn)行鑒定［8-10］。Song 等［11］研究表明，采用核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacers，ITS）序列分析是鑒定香菇的理想分子標(biāo)記。袁思明等［12］對(duì)采自云南的1 株野生香菇進(jìn)行了鑒定和菌絲生長(zhǎng)條件試驗(yàn)，其最適碳源為麥芽糖，最適氮源為牛肉膏。熊雪等［13］對(duì)分離自貴州馬桑樹的野生香菇進(jìn)行生物學(xué)研究，該菌菌絲生長(zhǎng)的最優(yōu)碳源為蔗糖，最優(yōu)氮源為蛋白胨，培養(yǎng)溫度以23～25 ℃最優(yōu)，最適pH 為7～10；方志榮等［14］研究了不同碳源、氮源、溫度以及pH 對(duì)分離自四川的2株野生香菇菌株菌絲生長(zhǎng)的影響，其最佳碳、氮源分別為玉米粉和酵母膏，最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，最適pH 為6.0；劉元濤等［15］通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的方法，研究中華小香菇生長(zhǎng)發(fā)育過程中所需碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)條件和溫度、pH 等環(huán)境條件，從而得出其菌絲體生長(zhǎng)的最佳條件?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】我國香菇種質(zhì)資源豐富，但功能性栽培品種較少，目前缺少適宜在南方高溫地區(qū)栽培的優(yōu)良香菇品種。利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定方法，對(duì)香菇野生種質(zhì)進(jìn)行鑒定。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在對(duì)采集自廣西的2 株野生香菇菌株進(jìn)行分離、鑒定，通過與香菇主要栽培菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行比較研究，探討分析影響香菇菌絲生長(zhǎng)的因素，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)不同菌株的綜合表現(xiàn)，以期篩選出適宜當(dāng)?shù)馗邷貧夂驐l件的香菇種質(zhì)資源和育種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試野生菌株林香18（LX18）、林香19（LX19），栽培菌株L12、L26 和L808，均由廣西大學(xué)食用菌研究所提供，其中LX18、LX19 由采集于廣西上林縣大明山的野生子實(shí)體分離獲得。申香34（SX34）、申香60（SX60）和浦香08（PX08）由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所陳明杰研究員惠贈(zèng)。

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL。

基本培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.1%、瓊脂1.5%、水1 L、pH 自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)鑒定 香菇子實(shí)體由菌蓋、菌柄和菌褶組成。通過觀察子實(shí)體的外觀特征，如子實(shí)體大小、菌蓋表面平整度、菌蓋厚薄、菌柄長(zhǎng)度、菌蓋顏色、菌褶、菌環(huán)等進(jìn)行鑒定。

1.2.2 分子鑒定 采用CTAB 法提取DNA，隨后用兩對(duì)引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），LR0R（5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3'）和LR5（5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3'），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：總體系為25 μL，分別為GO Taq green master mix (2×) 13 μL；ITS1 和ITS4 或LR0R和LR5 (10 pmol/L) 各1 μL；DNA 模 板1 μl；Nucleasr-free water 9 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃5 min；變性94 ℃ 1 min，退火50 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，共35 個(gè)循環(huán)；補(bǔ)平72 ℃ 10 min，10 ℃ 30 min。擴(kuò)增完成后4 ℃保存并進(jìn)行電泳檢測(cè)，PCR 產(chǎn)物送生物公司進(jìn)行測(cè)序。所得序列于GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對(duì)，下載相關(guān)序列并用Clustal X 軟件進(jìn)行對(duì)比，并用MEGA 6.06 中的Maximum Likelihood 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 香菇生物學(xué)特性對(duì)比分析（1）菌種活化。取保藏菌種接入斜面PDA 培養(yǎng)基，于25 ℃下培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)好后再轉(zhuǎn)接到PDA 平板中心位置，25 ℃下培養(yǎng)，菌絲長(zhǎng)滿皿后備用。

（2）菌絲觀察測(cè)定。長(zhǎng)滿菌絲的PDA 平板，用直徑0.5 cm 的打孔器打孔取菌餅，接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板中央，每個(gè)菌株3 次重復(fù)，培養(yǎng)3 d后開始進(jìn)行觀察和測(cè)定。每個(gè)菌株取3 個(gè)平板，以接種中心點(diǎn)為起點(diǎn)，測(cè)量菌落半徑，計(jì)算平均值。長(zhǎng)勢(shì)以菌落圓整程度、菌絲濃密程度以及菌絲潔白程度來表示。

菌絲生長(zhǎng)速度（mm/d)=［(平均菌落半徑-5 mm)/2］/生長(zhǎng)天數(shù)

（3）溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。用直徑0.5 cm的打孔器打取菌餅，接入無菌PDA 培養(yǎng)皿中央，每個(gè)菌株3 個(gè)重復(fù)，分別放入15、20、25、30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記錄菌絲萌發(fā)、生長(zhǎng)時(shí)間及滿皿天數(shù)。

（4）碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對(duì)照，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖分別換成麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉等，觀察不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度及長(zhǎng)勢(shì)的影響。

（5）氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對(duì)照，將基礎(chǔ)培養(yǎng)中的蛋白胨分別換成尿素、牛肉膏、酵母膏、硝酸鉀等，觀察不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度及長(zhǎng)勢(shì)的影響。

（6）C/N 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖用量固定為20 g，改變蛋白胨的用量，配制7 個(gè)培養(yǎng)基處理，使葡萄糖與蛋白胨比例依次為10/1、20/1、30/1、40/1、50/1、60/1、70/1。觀察不同C/N 對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度及長(zhǎng)勢(shì)的影響。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 軟件，應(yīng)用鄧肯氏新復(fù)極差法（Duncan）進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生香菇菌株的形態(tài)鑒定

林香18 野生子實(shí)體見圖1 A。子實(shí)體稍小，菌蓋直徑為3.0～3.5 cm，最大可達(dá)4.0 cm，扁平球形至稍平展，表面淺褐色，光滑無鱗片，無毛狀物；厚度1.1～1.5 cm，菌肉白色，細(xì)密；菌褶白色，彎生，不等長(zhǎng)；菌柄長(zhǎng)4.5～4.8 cm，粗0.6～1.0 cm，中生，白色，直立；菌環(huán)以下無纖毛狀鱗片，纖維質(zhì)，內(nèi)實(shí)，菌環(huán)易消失，白色。

圖1 野生香菇子實(shí)體Fig.1 Fruiting bodies of wild Lentinula edodes

林香19 子實(shí)體見圖1 B。子實(shí)體中等，菌蓋直徑為3.5～4.0 cm，最大可達(dá)4.5 cm，扁平球形至稍平展，表面深褐色、棕褐色，光滑無鱗片，無毛狀物，厚度0.9～1.5 cm；菌肉白色，細(xì)密；菌褶白色，彎生，不等長(zhǎng)；菌柄長(zhǎng)4.8～5.3 cm，粗0.7～1.2 cm，中生至偏生，白色，常彎曲；菌環(huán)以下無纖毛狀鱗片，纖維質(zhì)，內(nèi)實(shí)，菌環(huán)易消失。從形態(tài)學(xué)上可將野生食用菌初步鑒定為香菇屬。

2.2 分子序列分析

香菇野生菌株經(jīng)PCR 擴(kuò)增、測(cè)序后獲得的ITS 和LSU 序列，通過BLAST 在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性檢索和比對(duì)，下載其他香菇序列進(jìn)行對(duì)比，用MEGA 6.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。由圖2 可知，野生菌株林香18、林香19 與MH868346LentinulaedodesCBS225.51 和AF356159LentinulalateritiaTMI 1633 聚集在一個(gè)分支上，且該分支的最大似然引導(dǎo)支持率高達(dá)100%，因此把這兩個(gè)菌株鑒定為香菇Lentinula edodes。

圖2 基于ITSLSU 和序列采用極大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree generated from maximum likelihood based on ITS and LSU sequences

2.3 香菇生物學(xué)特性對(duì)比分析

2.3.1 不同溫度對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響 由表1 可知，8 株供試菌株在溫度15～30 ℃下均能生長(zhǎng)，但菌絲生長(zhǎng)速度存在較大差異。15 ℃時(shí)，L12 和L26 的菌絲生長(zhǎng)速度最快、表現(xiàn)出耐低溫的特性，而L808 和林香19 生長(zhǎng)最慢、對(duì)低溫比較敏感；20 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度居前3 位的分別為L(zhǎng)26、林香18 和L12；25 ℃為6 株栽培菌株的最適生長(zhǎng)溫度，其中L808 的菌絲生長(zhǎng)速度最快、達(dá)4.91 mm/d；而30 ℃下，野生菌株林香18 的菌絲生長(zhǎng)速度最快，其次為L(zhǎng)808 和林香19。綜上，L808、林香18 和林香19 具有較強(qiáng)的耐高溫特性，其他5 個(gè)菌株均不耐高溫。

表1 不同溫度對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)速率的影響Table 1 Effect of different temperature on mycelial growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

2.3.2 不同碳源對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響 從表2可以看出，當(dāng)碳源為葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖時(shí)，香菇L26、申香60 和申香34 的菌絲生長(zhǎng)速度無顯著差異，但當(dāng)碳源為乳糖時(shí)三者的菌絲生長(zhǎng)速度較慢。香菇L12 在含葡萄糖培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度最快、達(dá)4.17 mm/d，與其他碳源差異顯著，而在含麥芽糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉培養(yǎng)基中，乳糖的利用效果最差；香菇L808在含蔗糖的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快、為4.03 mm/d，其次是可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖，乳糖最慢、菌絲生長(zhǎng)速度僅2.42 mm/d；林香18 在不同碳源培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度差異顯著，以蔗糖利用效果最好、菌絲生長(zhǎng)速度達(dá)3.43 mm/d，乳糖利用效果最差、菌絲生長(zhǎng)速度僅2.19 mm/d；林香19 在所有碳源中，對(duì)可溶性淀粉的利用效果最好、菌絲生長(zhǎng)速度最快、為3.75 mm/d，乳糖利用效果最差、菌絲生長(zhǎng)速度最慢、僅3.18 mm/d；浦香08 在所有碳源中，以麥芽糖培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快、約為乳糖的2 倍。

表2 不同碳源對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)速率的影響Table 2 Effect of different carbon source on mycelial growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

從表3 可以看出，不同碳源條件下，L26、L808、申香34、申香60、林香18 和林香19 的菌絲長(zhǎng)勢(shì)無顯著差異，只有L12 和浦香08 的菌絲長(zhǎng)勢(shì)存在差異。在碳源為葡萄糖、乳糖和可溶性淀粉時(shí)，L12 菌落圓整、菌絲較濃密、潔白，且在乳糖培養(yǎng)基上菌絲最為濃密；在可溶性淀粉培養(yǎng)基上菌絲濃密但老化快，存活時(shí)間較短。浦香08 在乳糖和可溶性淀粉培養(yǎng)基上，菌絲極濃密，菌落圓整、潔白；在葡萄糖、蔗糖和麥芽糖培養(yǎng)基上菌絲較濃密，菌落圓整、淺白色。L26 在5種碳源培養(yǎng)基上菌絲長(zhǎng)勢(shì)均表現(xiàn)極濃密，除了乳糖以外，其他4 種碳源菌絲長(zhǎng)勢(shì)均為圓整、潔白。L808 菌絲生長(zhǎng)速度快，菌絲老化速度也較快，菌絲長(zhǎng)勢(shì)無顯著差異，均為稀疏、灰白色、菌落完整。申香34 菌絲長(zhǎng)勢(shì)均為濃密、菌落圓整，在葡萄糖、乳糖培養(yǎng)基上菌絲呈灰白色，在可溶性糖和蔗糖上菌絲顏色更為潔白。申香60 菌絲長(zhǎng)勢(shì)無顯著差異，菌絲長(zhǎng)勢(shì)較濃密、菌落圓整、淺白色。相比其他菌株，林香18 在不同碳源培養(yǎng)基上的菌絲萌發(fā)及生長(zhǎng)速度慢，但菌絲長(zhǎng)勢(shì)濃密、潔白、菌落圓整。林香19 菌絲長(zhǎng)勢(shì)均表現(xiàn)稀疏圓整、淺白色，在5 個(gè)碳源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)無顯著差異。

表3 不同碳源對(duì)香菇菌絲長(zhǎng)勢(shì)的影響Table 3 Effect of different carbon source on mycelial growth density of Lentinula edodes

2.3.3 不同氮源對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)速度的影響 由表4 可知，L26 在不同氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率的表現(xiàn)依次為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏＞硝酸鉀＞尿素，在蛋白胨、牛肉膏、酵母膏上菌絲生長(zhǎng)速度最快、達(dá)3.75 mm/d；L12 在不同氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率的表現(xiàn)依次為蛋白胨、牛肉膏＞酵母膏＞硝酸鉀＞尿素，在蛋白胨、牛肉膏上菌絲生長(zhǎng)速度最快、達(dá)4.17 mm/d；L808、林香18、林香19 和浦香08 在不同氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率的表現(xiàn)依次為牛肉膏＞酵母膏＞蛋白胨＞硝酸鉀＞尿素，以上4 種菌株在牛肉膏培養(yǎng)基上利用效果相對(duì)最好，生長(zhǎng)速度分別為4.17、3.34、3.74、4.14 mm/d；申香34 和申香60 在不同氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率的表現(xiàn)依次為牛肉膏、酵母膏＞蛋白胨＞硝酸鉀＞尿素，兩菌株對(duì)牛肉膏、酵母膏的利用效果較好，菌絲生長(zhǎng)速度分別為3.75、3.8 mm/d。

表4 不同氮源對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)速率的影響Table 4 Effect of different nitrogen source on mycelial growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

總體來看，8 個(gè)菌株在尿素培養(yǎng)基上均無法生長(zhǎng)，在牛肉膏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，在硝酸鉀培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最慢，L12 菌株菌絲生長(zhǎng)速度最快，林香18 生長(zhǎng)速度明顯低于其他7 個(gè)菌株。

從表5 可以看出，8 個(gè)菌株在尿素培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)，在硝酸鉀培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)無明顯差異，均表現(xiàn)為菌落較圓整，菌絲稀疏、淺白色。L26、L12、L808、申香34 和林香18 等5 個(gè)菌株在其他3 種氮源培養(yǎng)基上表現(xiàn)一致，菌絲均極為濃密、潔白，菌落圓整；申香60 在蛋白胨、牛肉膏、酵母膏培養(yǎng)基上菌絲長(zhǎng)勢(shì)較濃密，無明顯差異；林香19 和浦香08 在5 種氮源培養(yǎng)基上表現(xiàn)一致，均在蛋白胨和牛肉膏上表現(xiàn)菌絲較濃密、潔白、菌落完整，在酵母膏上表現(xiàn)菌絲極濃密。綜上，在酵母膏培養(yǎng)基上除申香60 外其他7 個(gè)菌株長(zhǎng)勢(shì)均為菌絲濃密、潔白、菌落圓整。

表5 不同氮源對(duì)香菇菌絲長(zhǎng)勢(shì)的影響Table 5 Effect of different nitrogen source on mycelial growth density of Lentinula edodes

2.3.4 不同C/N 對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響 不同C/N 條件下，香菇菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯差異。由表6 可看出，香菇菌絲可以在7 個(gè)不同的C/N 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)情況各有不同。香菇L26 在C/N 為10/1、20/1、50/1、60/1、70/1 條件下菌絲生長(zhǎng)速度相同，為3.75 mm/d；L12 在C/N 為30/1條件下，菌絲生長(zhǎng)速度最快，為4.08 mm/d；L808在C/N 為50/1 時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，為3.97 mm/d；申香34 在C/N 為30/1 時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，為3.8 mm/d；申香60 在C/N 為10/1 和50/1 生長(zhǎng)速度相對(duì)較快，為3.8 mm/d；林香18 在10/1 時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，為3.7 mm/d，林香18 的總體生長(zhǎng)速度低于其他7 個(gè)品種；林香19 在70/1-10/1 的C/N 條件下，菌絲生長(zhǎng)范圍在3.48～3.8 mm/d，10/1 時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，50/1 速度最慢；浦香08 在C/N為40/1 時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，為4.15 mm/d。

表6 不同碳氮比對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)速率的影響Table 6 Effect of different carbon to nitrogen ratios on mycelial growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

由表7 可知，在不同C/N 的7 個(gè)處理中，申香34、林香18 與林香19 無顯著差異，申香34和林香18 菌絲極為濃密、潔白，菌落圓整，而林香19 菌絲較濃密、淺白色，菌落圓整；L808 在C/N 為30/1 時(shí)菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)濃密潔白，菌落圓整，其他6 個(gè)處理菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)稀疏，為淺白色，菌落圓整；L12 只在C/N 為70/1 時(shí)菌絲長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)稀疏、灰白色、菌落圓整，其他處理中菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)差異不大，表現(xiàn)為濃密、淺白色，菌落圓整；L26 在C/N 為10/1 時(shí)菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲潔白、極為濃密，菌落圓整，其他6 個(gè)處理菌絲較濃密、潔白、菌落圓整；浦香08 在C/N 為10/1 和30/1時(shí)菌絲極濃密、菌絲潔白、菌落圓整；申香60 在C/N 為20/1 和40/1 時(shí)菌絲稀疏、淺白色、菌落圓整，當(dāng)C/N 為10/1、50/1、60/1、70/1 時(shí)菌絲均較濃密且潔白，菌落圓整，當(dāng)C/N 為30/1 時(shí)菌絲極濃密、潔白、菌落圓整。綜合看來，申香34、林香18、林香19 菌絲長(zhǎng)勢(shì)不受C/N 的影響，其他5 個(gè)菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)受C/N 的影響。

表7 不同碳氮比對(duì)香菇菌絲長(zhǎng)勢(shì)的影響Table 7 Effect of different carbon to nitrogen ratios on mycelial growth density of Lentinula edodes

3 討論

本研究對(duì)采自廣西大明山的2 份野生食用菌標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)特征觀察和分子序列分析，發(fā)現(xiàn)從野生標(biāo)本分離的菌株林香18 和林香19 與香菇Lentinulaedodes相似度最高，在ITS 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上聚集在一起，因此將其鑒定為香菇Lentinulaedodes。兩份材料的子實(shí)體外觀形態(tài)差異不大，區(qū)別為林香18 菌蓋顏色為淺褐色，而林香19 菌蓋顏色為深褐色。廣西野生香菇的研究報(bào)道較少，陳麗新［16］等曾對(duì)十萬大山的野生香菇進(jìn)行組織分離，認(rèn)為分離部位不同，菌絲的生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)有差異。

野生菌的馴化栽培通常有賴于其菌種的生物學(xué)特性研究。本研究以香菇的2 株野生菌株和6 株栽培菌株為試材，測(cè)定不同溫度、氮源、氮源、C/N 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示，供試的8 株香菇菌絲在15～30 ℃條件下均可以生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度具有一定規(guī)律，多數(shù)菌株的菌絲生長(zhǎng)速度在15～25 ℃呈上升趨勢(shì)，25～30 ℃菌絲生長(zhǎng)速度緩慢，6 株栽培菌株生長(zhǎng)的最適合溫度均為25 ℃，而2 株野生菌株在30℃時(shí)的菌絲生長(zhǎng)速率最高。同時(shí)得出供試8 個(gè)菌株菌絲生長(zhǎng)的最適營(yíng)養(yǎng)條件，其中L26 最適碳源為葡萄糖，最適氮源為蛋白胨、牛肉膏或酵母膏，在7 種不同C/N 中無顯著差別；L12 最適碳源為葡萄糖，最適氮源是蛋白胨或牛肉膏，最佳C/N 是30/1；L808 最適碳源為蔗糖，最適氮源為牛肉膏，最適C/N 為50/1；申香34 最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為酵母膏或牛肉膏，最適C/N 為30/1；申香60 最適碳源是可溶性淀粉、麥芽糖或蔗糖，最適氮源為酵母膏或牛肉膏，最適C/N 為10/1、50/1；林香18 最適碳源是蔗糖，最適氮源為牛肉膏，最適C/N 為10/1；林香19 最適碳源是可溶性淀粉，最適氮源為牛肉膏，最適C/N 為10/1；浦香08 最適碳源為麥芽糖，最適氮源為牛肉膏，最適C/N 為40/1。本研究結(jié)果與已往的文獻(xiàn)報(bào)道相似，如袁思明等［12］對(duì)野生香菇菌絲最佳生長(zhǎng)條件進(jìn)行研究，菌絲在牛肉膏上生長(zhǎng)最好。熊雪等［13］指出，野生馬桑香菇菌絲的最優(yōu)碳源為蔗糖，最優(yōu)氮源為蛋白胨，培養(yǎng)溫度以23～25 ℃最優(yōu)。方志榮等［14］認(rèn)為，香菇屬的最佳碳源為玉米粉，最佳氮源為酵母膏，最適培養(yǎng)溫度為25 ℃；伍燕等［17］研究發(fā)現(xiàn)，香菇菌絲在葡萄糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)更好，而在尿素上不能生長(zhǎng)。推測(cè)多數(shù)食用菌菌絲均無法直接利用尿素，可能是因?yàn)槟蛩卦诟邏簻缇鷷r(shí)發(fā)生了縮合反應(yīng)，生成的縮二脲、縮三脲等無法被菌絲吸收利用，導(dǎo)致菌絲無法生長(zhǎng)。曾茜等［18］發(fā)現(xiàn)，野生香菇黔香篩5 號(hào)母種培養(yǎng)基的最佳碳氮源為葡萄糖和硫酸銨，最適培養(yǎng)溫度 25～30 ℃。廖真等［19］研究表明，野生香菇菌絲生長(zhǎng)的最適碳源為果糖，最適氮源為牛肉膏，最適生長(zhǎng)溫度25 ℃，而在尿素培養(yǎng)基上菌絲無法生長(zhǎng)。本研究結(jié)果野生香菇林香18 和林香19 菌絲生長(zhǎng)的最適氮源是牛肉膏，這與袁思明等［12］、廖真等［19］的研究結(jié)果一致。由此推測(cè)在蛋白胨和牛肉膏為氮源的處理下，菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好，可能是因?yàn)檫@種復(fù)合氮源中營(yíng)養(yǎng)較為豐富，能夠滿足菌絲生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求。溫度方面，本研究試材野生香菇林香18、林香19 與曾茜等［18］研究的“野生香菇黔香篩5 號(hào)”均為耐高溫野生香菇，與熊雪等［13］研究的野生馬桑香菇、方志榮等［14］研究的野生微香菇屬 (Lentinula)真菌存在差異。

本研究中，8 株香菇在7 種不同C/N 培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度沒有任何規(guī)律，但多數(shù)菌株在C/N 為10/1 時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，而張權(quán)［20］研究發(fā)現(xiàn)5 種香菇（931-9，靈仙一號(hào)，南山一號(hào)，9608，L808）的最適C/N 為20/1，由此推測(cè)不同品種的香菇在碳源、氮源需求上差異較小，但在C/N 需求上存在較大差異，同一菌種不同菌株之間利用碳氮的能力也有所不同。

4 結(jié)論

本研究通過形態(tài)學(xué)和分子學(xué)相結(jié)合的方法，將來自廣西上林縣大明山的兩份野生食用菌鑒定為香菇。通過與6 個(gè)主要栽培菌株進(jìn)行生物學(xué)特性的比較分析，結(jié)果表明，兩株野生菌株在30 ℃條件下的菌絲生長(zhǎng)速度均高于25 ℃，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐高溫特性，說明野生菌株為耐高溫菌株，其他菌株為中溫性品種，生長(zhǎng)最適合溫度在25 ℃。本試驗(yàn)篩選出適宜當(dāng)?shù)馗邷貧夂驐l件的香菇種質(zhì)資源為林香18 和林香19，為野生香菇種質(zhì)資源的應(yīng)用，特別是耐高溫香菇新品種的選育提供了新材料及重要參考依據(jù)。