宋傳龍 焦紅杰 海力其古麗·努日丁 趙 莉 嚴(yán) 媚

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒內(nèi)一科，烏魯木齊 830054）

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種常見(jiàn)的獲得性自身免疫性疾病，其特征是抗血小板自身抗體介導(dǎo)的血小板生成減少和血小板破壞增加，導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)降低。ITP 患者出血表現(xiàn)出高度異質(zhì)性，皮膚黏膜出血是最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)內(nèi)臟或顱內(nèi)出血，危及患者生命［1-2］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外均對(duì)ITP 進(jìn)行了大量研究，但其發(fā)病機(jī)制和病理生理學(xué)過(guò)程仍未完全闡明，在一定程度上限制了ITP 治療方法的開(kāi)發(fā)。目前，大多數(shù)ITP 患者需要進(jìn)行脾切除術(shù)或長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素、血小板生成素以及免疫抑制劑等進(jìn)行治療，但一些患者治療無(wú)效、治療后復(fù)發(fā)等問(wèn)題使上述方法未取得理想效果［3］。因此，尋找新型安全的ITP有效療法或藥物是當(dāng)前研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

富馬酸二甲酯（dimethyl fumarate，DMF）是一種富馬酸甲酯，作為工業(yè)化學(xué)中常用的化合物，價(jià)格低廉且易于獲得，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)等特性，長(zhǎng)期攝入不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，已被批準(zhǔn)和注冊(cè)用于治療銀屑病和復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化［4-5］。此外，DMF已顯示出調(diào)控細(xì)胞多種生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用［6］。鑒于ITP 作為一種自身免疫性炎癥性疾病以及DMF 在治療免疫性疾病中的潛在作用，已有研究報(bào)道表明DMF 顯著抑制了抗血小板抗體誘導(dǎo)的血小板破壞，從而對(duì)ITP 小鼠起到了一定的改善作用，但該作用的具體機(jī)制尚未明確［7］。本研究通過(guò)誘導(dǎo)構(gòu)建ITP 小鼠模型，進(jìn)一步評(píng)估DMF 是否可以改善或抑制ITP 小鼠模型中血小板減少，測(cè)定血常規(guī)指標(biāo)、細(xì)胞因子水平、臟器指數(shù)、脾臟與股骨內(nèi)巨核細(xì)胞等變化情況，并探究ITP 小鼠巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)，較為綜合地探討DMF 對(duì)ITP 的效果及作用機(jī)制，為臨床合理用藥提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用BALB/c 小鼠共60 只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量18～20 g，豚鼠共6只，雌雄各半，體質(zhì)量220～250 g，均飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，室溫為22～26 ℃，相對(duì)濕度45%～55%，光照周期12 h/12 h 明暗交替，期間自由飲食飲水，所用飼料、水及墊料均經(jīng)高溫高壓消毒處理。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)（倫理審批號(hào)：20211215-07）。

1.1.2 主要試劑 DMF、完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17 及TGF-β1 ELISA 測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海瑞齊生物技術(shù)公司；HE 染色試劑盒購(gòu)于北京百奧萊博科技公司；免疫熒光染色試劑盒和DAPI 染液購(gòu)于上海碧云天生物研究所；鼠抗CD68 單克隆抗體、鼠抗F4/80-PE 單克隆抗體、鼠抗CD86-PE 單克隆抗體、鼠抗CD206-FITC單克隆抗體及生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 ITP 模型構(gòu)建 參考文獻(xiàn)［8］制備豚鼠抗BALB/c 小鼠血小板血清（GP-APS），通過(guò)腹腔注射GP-APS 建立ITP 小鼠模型。將BALB/c 小鼠置于含乙醚的環(huán)境中麻醉，摘眼球取血，以乙二胺四乙酸二鈉抗凝，離心分離出血小板，利用0.9%氯化鈉稀釋；將分離的血小板分別與等量完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑混合，以此作為抗原，注射開(kāi)始記為0 周，將含完全弗氏佐劑抗原注射于豚鼠足掌、背部、腹部及皮下，每次至少4 點(diǎn)，在第1、2、4 周，將含不完全弗氏佐劑抗原注射于相同部位，每次至少4 點(diǎn)。第5 周，通過(guò)豚鼠心臟采集全血，置于離心機(jī)以1 500 r/min 離心10 min，收集上清，即為GP-APS，檢測(cè)抗血清效價(jià)及最佳稀釋濃度，貯存于-20 ℃冰箱。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將GP-APS 置于56 ℃水浴鍋內(nèi)孵育30 min，用0.9%氯化鈉按照1∶4 的比例稀釋GP-APS，取需要構(gòu)建ITP模型的小鼠，于1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d，分別腹腔注射100 μl稀釋后的GP-APS，使小鼠血小板持續(xù)性降低。同時(shí)，對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積0.9%氯化鈉，造模第2、4、6、8、10、12、14 天，采集小鼠靜脈血，全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定血小板數(shù)目。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、ITP組、DMF 低劑量組和DMF 高劑量組，每組15 只小鼠。ITP 組、DMF 低劑量組和DMF 高劑量組的小鼠均構(gòu)建ITP 模型。建模成功后，DMF 低劑量組和DMF 高劑量組小鼠分別按10 mg/kg、20 mg/kg 劑量灌胃DMF 進(jìn)行處理，1 次/d，連續(xù)14 d。對(duì)照組和ITP 組同時(shí)以等量0.9%氯化鈉灌胃，1 次/d，連續(xù)14 d。

1.2.3 外周血血常規(guī)測(cè)定 給藥結(jié)束后，各組小鼠均通過(guò)腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉后，剪尾收集外周血，采用全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀檢

測(cè)小鼠血小板（PLT）、紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）以及血紅蛋白（Hb）水平。

1.2.4 ELISA 法 心臟采血法收集各組小鼠外周血，室溫靜置2 h，4 000 r/min 離心5 min，收集上清，ELISA 法測(cè)定血清內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17及TGF-β1的水平變化，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各細(xì)胞因子含量。

1.2.5 臟器指數(shù)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)后，電子天平稱取各組小鼠體質(zhì)量，取血結(jié)束后處死小鼠，無(wú)菌環(huán)境下剝離胸腺組織和脾臟組織，稱量胸腺組織與脾臟組織的質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)。計(jì)算公式為：胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.2.6 HE 染色 處死各組小鼠，剝離脾臟組織與右側(cè)股骨組織，清洗干凈后，4%多聚甲醛固定。將股骨組織置于10%硝酸中脫鈣處理2 h。將固定好的脾臟組織與脫鈣固定的骨髓組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切成厚度約為4 μm的組織切片，脫蠟脫水，蘇木精染液染色5 min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，伊紅染液染色30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察組織內(nèi)巨核細(xì)胞，攝取圖像，計(jì)數(shù)每個(gè)載玻片的5 個(gè)隨機(jī)不同區(qū)域內(nèi)巨核細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算平均值。

1.2.7 免疫熒光染色 取制備的對(duì)照組、ITP 組和DMF 高劑量組小鼠脾臟組織石蠟切片，通過(guò)二甲苯脫蠟與梯度乙醇脫水后，浸入檸檬酸溶液中置于微波爐高溫加熱修復(fù)抗原12 min，冷卻后用PBS洗滌，加入0.3% TritonX-100 置于37°C 下孵育15 min，使用5%山羊血清室溫封閉1 h，將稀釋后的CD68 和CD86或CD206（1∶500）滴在切片上進(jìn)行標(biāo)記，4 ℃孵育過(guò)夜；第2 天，PBS 洗滌切片后，加入稀釋后的TRITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶500），室溫避光孵育1 h，PBS 洗滌后，加入DAPI 復(fù)染細(xì)胞核10 min，使用抗猝滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選擇5 個(gè)不同視野攝取圖像，計(jì)數(shù)標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞與總細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)水平，結(jié)果取平均值。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù) 將對(duì)照組、ITP組和DMF高劑量組小鼠的外周血置于經(jīng)抗凝處理的試管內(nèi)，在離心機(jī)中以4 000 r/min 離心10 min，留沉淀，并加入PBS 稀釋混勻，根據(jù)單核細(xì)胞分離液試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，分離獲得單核細(xì)胞，接種于6 孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，收集培養(yǎng)1 周的細(xì)胞。取培養(yǎng)的單核細(xì)胞，PBS 洗滌，加入PE 標(biāo)記的流式抗體F4/80、CD86 或FITC 標(biāo)記的流式抗體CD206，混合均勻，置于4 ℃孵育30 min，PBS 洗滌后離心，加入適量的PBS 重懸，將獲得的細(xì)胞懸液上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄各標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以GraphPad Prism 8.30 軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)量資料均以±s表示。兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩數(shù)據(jù)比較采用LSD-t法，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠外周血血常規(guī)比較 造模開(kāi)始后，統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和ITP 組不同時(shí)間點(diǎn)外周血PLT 數(shù)量，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，ITP 組小鼠PLT 數(shù)量呈下降趨勢(shì)，同一時(shí)間點(diǎn)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明造模成功，見(jiàn)圖1。各組小鼠外周血PLT、RBC、WBC 及Hb 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，ITP 組小鼠PLT、RBC 及Hb 明顯下降，WBC 明顯升高（P＜0.05）；與ITP 組比較，DMF 低劑量組小鼠PLT 明顯升高，WBC 明顯下降（P＜0.05），而RBC 與Hb 變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與ITP 組比較，DMF高劑量組小鼠PLT、RBC及Hb均明顯升高，WBC明顯下降（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠外周血血常規(guī)比較（±s，n=15）Tab.1 Comparison of peripheral blood routine of mice in each group （±s， n=15）

表1 各組小鼠外周血血常規(guī)比較（±s，n=15）Tab.1 Comparison of peripheral blood routine of mice in each group （±s， n=15）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with ITP group， 2）P＜0.05.

Groups Control ITP DMF-low dose DMF-high dose PLT/（×109 L-1）897.08±62.91 425.72±34.161）613.49±42.832）RBC/（×1012 L-1）9.70±0.51 6.01±0.481）Hb/（g·L-1）156.38±12.23 99.32±8.161）6.40±0.52 WBC/（×109 L-1）6.13±0.54 11.22±0.861）9.76±0.812）99.68±8.02 735.96±52.022）8.84±0.672）8.94±0.642）114.69±10.152）

圖1 造模后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠外周血PLT計(jì)數(shù)情況Fig.1 PLT counts in peripheral blood of mice at different time points after modeling

2.2 各組小鼠血清細(xì)胞因子水平比較 ELISA 測(cè)定各組小鼠血清細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17 及TGF-β1 水平，檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，ITP 組血清中IFN-γ、IL-2 與IL-17 均明顯升高，TGF-β1、IL-4 與IL-10 則明顯下降（P＜0.05）；相較于ITP 組，DMF 低劑量組和DMF 高劑量組的血清中IFN-γ、IL-2 與IL-17 均明顯下降，TGF-β1、IL-4 以及IL-10明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠血清細(xì)胞因子水平比較Fig.2 Comparison of serum cytokine levels of mice in each group

2.3 各組小鼠臟器指數(shù)比較 在實(shí)驗(yàn)后測(cè)定各組小鼠脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)，檢測(cè)結(jié)果顯示，ITP 組脾臟指數(shù)較對(duì)照組脾臟指數(shù)明顯升高（P＜0.05）；與ITP 組比較，DMF 低、高劑量組脾臟指數(shù)均明顯降低（P＜0.05）。而各組小鼠的胸腺指數(shù)之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)比較Fig.3 Comparison of spleen index and thymus index of mice in each group

2.4 各組小鼠脾臟組織和股骨組織HE 染色結(jié)果HE 染色觀察各組小鼠脾臟組織和股骨組織內(nèi)巨核細(xì)胞數(shù)目變化，結(jié)果如圖4所示，對(duì)照組脾臟組織和股骨組織結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯異常；ITP 組小鼠脾臟組織形態(tài)紊亂，股骨和脾臟紅髓中巨核細(xì)胞數(shù)目明顯增多，且胞體異常增大，形態(tài)不規(guī)則；DMF 低、高劑量組小鼠中巨核細(xì)胞增多現(xiàn)象較ITP 組小鼠有所改善，形態(tài)結(jié)構(gòu)也趨于正常。

圖4 HE 染色觀察各組小鼠脾臟與股骨內(nèi)巨核細(xì)胞數(shù)目Fig.4 HE staining to observe numbers of megakaryocytes in spleen and femur tissues of mice in each group

2.5 各組小鼠脾臟組織內(nèi)巨噬細(xì)胞極化情況比較 免疫熒光染色檢測(cè)各組小鼠脾臟組織內(nèi)巨噬細(xì)胞表型表達(dá)，結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組比較，ITP組脾臟組織內(nèi)CD68+CD86+陽(yáng)性表達(dá)率升高，CD68+CD206+陽(yáng)性表達(dá)率降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與ITP 組比較，DMF 組脾臟組織內(nèi)CD68+CD86+陽(yáng)性表達(dá)率降低，CD68+CD206+陽(yáng)性表達(dá)率升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.6 各組小鼠外周血巨噬細(xì)胞極化情況比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，ITP 組外周血F4/80+CD86+標(biāo)記細(xì)胞比例明顯升高，F(xiàn)4/80+CD206+標(biāo)記細(xì)胞比例則明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P＜0.05）；而相 較于ITP 組，DMF 組F4/80+CD86+標(biāo)記細(xì)胞比例明顯降低，F(xiàn)4/80+CD206+標(biāo)記細(xì)胞比例則明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠外周血巨噬細(xì)胞極化情況Fig.6 Flow cytometry to detect polarization of peripheral blood macrophages in mice in each group

3 討論

ITP 的發(fā)生發(fā)展和發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多種因素，一方面，自身抗體免疫球蛋白G以血小板糖蛋白為靶標(biāo)形成抗原抗體復(fù)合物時(shí)，通過(guò)Fc受體被脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞所吞噬；另一方面，除血小板自身抗體外，細(xì)胞免疫功能障礙也在ITP的發(fā)病中起關(guān)鍵作用，包括T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞，作為免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)細(xì)胞，T 細(xì)胞或相關(guān)細(xì)胞因子的分化以及功能障礙均與ITP 密切相關(guān)［9］。嚴(yán)重的ITP 及其并發(fā)癥也是引起患者死亡的主要原因，此外，ITP 患者通常表現(xiàn)為預(yù)后不良［3］。盡管血小板輸注是一種常用的臨床治療方法，但該方式并不是ITP 的有效治療方法，此外，手術(shù)切除脾、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用于ITP 均未獲得理想效果。

DMF 作為富馬酸酯組合而成的藥物，其臨床特點(diǎn)是副作用相當(dāng)輕微，這使得其成為一種潛在的耐受性良好藥物，目前，已有大量研究指出DMF 在多種疾病中發(fā)揮調(diào)控作用，例如，DMF 通過(guò)抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中NOS、IL-1β和IL-6等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗炎作用［10］；DMF 不僅能誘導(dǎo)結(jié)腸癌的細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡［11］，還能夠通過(guò)激活SOCS3/JAK1/STAT3信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、血管生成以及自噬，從而起到一定的抗腫瘤作用［12］；此外，DMF 還被廣泛用作抗氧化劑和抗炎劑，用于治療多種自身免疫性疾病，例如，DMF 通過(guò)激活多發(fā)性硬化中的核因子Nrf2 通路發(fā)揮抗炎作用，還可以通過(guò)抑制NF-κB 通路調(diào)節(jié)固有性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)［13］。考慮到ITP 也是一種自身免疫性疾病，而國(guó)內(nèi)外關(guān)于DMF 在ITP 中的作用研究報(bào)道相對(duì)較少。因此，本研究通過(guò)腹腔注射GP-APS 構(gòu)建ITP 小鼠模型后給予DMF，以評(píng)估DMF 對(duì)ITP 小鼠模型的改善效果及作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)GPAPS 誘導(dǎo)后小鼠外周血血小板數(shù)量明顯降低，而DMF 治療后顯著抑制了GP-APS 誘導(dǎo)的小血小板減少與RBC、Hb 水平降低，并抑制了WBC 水平升高，提示DMF可能是一種治療ITP的新方法。

ITP 是由細(xì)胞免疫和體液免疫共同參與的免疫功能異常所引發(fā)的，迄今為止，研究者普遍認(rèn)識(shí)到自身反應(yīng)性B 淋巴細(xì)胞功能失調(diào)在ITP 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，輔助性T（Th）細(xì)胞及其分泌性細(xì)胞因子也在ITP的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［14］。Th細(xì)胞可分為T(mén)h1、Th2 和Th17 細(xì)胞，Th1 細(xì)胞主要通過(guò)產(chǎn)生IFN-γ、IL-2與IL-17誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，這些促炎細(xì)胞因子通過(guò)激活巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)；相比之下，Th2 細(xì)胞通過(guò)分泌抗炎細(xì)胞因子，如TGF-β1、IL-4 以及IL-10，參與巨噬細(xì)胞失活和體液免疫反應(yīng)的調(diào)控作用［15-16］。已知DMF通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能從而對(duì)多種自身免疫性疾病具有治療作用。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示，ITP 小鼠血清中IFN-γ、IL-2與IL-17均明顯升高，TGF-β1、IL-4與IL-10 則明顯下降，而經(jīng)過(guò)DMF 低、高劑量作用的ITP 小鼠，其血清中IFN-γ、IL-2 與IL-17 均明顯下降，TGF-β1、IL-4 以及IL-10 明顯升高。骨髓巨核細(xì)胞異常增生伴成熟障礙也是ITP 的主要特點(diǎn)之一，巨核細(xì)胞作為血小板的前體細(xì)胞，從骨髓的骨內(nèi)壁龕向脈管系統(tǒng)遷移，將前血小板延伸到血竇，通過(guò)循環(huán)血液逐漸將其分解為血小板［17］。本研究結(jié)果也顯示，ITP 小鼠股骨組織和脾臟組織中巨核細(xì)胞數(shù)目異常增多且形態(tài)不規(guī)則，而DMF 作用后能夠改善這種異?，F(xiàn)象。

巨噬細(xì)胞作為一種免疫細(xì)胞，以促炎經(jīng)典激活巨噬細(xì)胞（M1型）或抗炎替代激活巨噬細(xì)胞（M2型）的兩種形式存在，M1 型巨噬細(xì)胞發(fā)揮促炎、抗腫瘤和抗微生物功能，釋放高水平的促炎細(xì)胞因子，如IL-1β、TNF-α、IL-6 和iNOS；M2 型巨噬細(xì)胞通過(guò)釋放抗炎細(xì)胞因子，如TGF-β、IL-10 發(fā)揮抗炎及免疫抑制作用，具有促血管生成和促纖維化特性，并能夠促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［18］。既往研究表明，巨噬細(xì)胞在ITP 中起著關(guān)鍵作用，既可以作為效應(yīng)細(xì)胞吞噬血小板，也可以作為抗原呈遞細(xì)胞，刺激自身抗體對(duì)抗血小板的產(chǎn)生，并且已在ITP 中檢測(cè)到M1/M2 比例失衡，M1型巨噬細(xì)胞的大量存在導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的釋放增加［19］。此外，CHANG 等［20］研究表明抑制miR-155-5p 的表達(dá)可以促進(jìn)PD1/PDL1 通路介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M2 型極化，從而達(dá)到緩解ITP 的作用。因此，抑制巨噬細(xì)胞向M1 型極化和促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型極化可能是治療ITP 的途徑之一。以往研究表明，DMF 可以通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的異常激活減輕炎癥反應(yīng)［21］。脾臟不僅是由血源性病原體、死亡或凋亡細(xì)胞等外來(lái)或自身抗原刺激機(jī)體引起免疫應(yīng)答的淋巴器官，還是重要的巨噬細(xì)胞儲(chǔ)存器官，脾臟內(nèi)巨噬細(xì)胞主要包括紅髓內(nèi)的紅髓巨噬細(xì)胞、邊緣區(qū)嗜金屬巨噬細(xì)胞、邊緣區(qū)巨噬細(xì)胞以及白髓內(nèi)著色小體巨噬細(xì)胞，均是脾臟內(nèi)主要的吞噬細(xì)胞和功能細(xì)胞［22］。此外，外周血中的細(xì)胞是參與機(jī)體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和骨代謝的重要組成，其中，單核細(xì)胞來(lái)源于骨髓干細(xì)胞，在骨髓中經(jīng)前單核細(xì)胞分化發(fā)育為單核細(xì)胞，然后釋放到外周血中，經(jīng)過(guò)血液循環(huán)移行到各個(gè)組織中，進(jìn)而分化成為巨噬細(xì)胞［23］。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示，ITP 小鼠脾臟組織內(nèi)以CD68+CD86+標(biāo)記的M1 型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率升高，以CD68+CD206+標(biāo)記的M2 型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率降低，外周血F4/80+CD86+比例明顯升高，F(xiàn)4/80+CD206+細(xì)胞比例明顯降低，說(shuō)明ITP 小鼠發(fā)生了M1 型巨噬細(xì)胞與M2 型巨噬細(xì)胞比率失衡的現(xiàn)象，而DMF 作用的ITP 小鼠脾臟組織內(nèi)CD68+CD86+陽(yáng)性表達(dá)率降低，CD68+CD206+陽(yáng)性表達(dá)率升高，此外，外周血F4/80+CD86+細(xì)胞比例也降低，而F4/80+CD206+細(xì)胞比例也表現(xiàn)出明顯的升高現(xiàn)象，由此推測(cè)，DMF 可能通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化從而改善ITP。

綜上所述，DMF 能夠抑制ITP 小鼠血小板數(shù)量的降低，調(diào)節(jié)血常規(guī)指標(biāo)，降低脾臟指數(shù)和骨髓巨核細(xì)胞異常的現(xiàn)象，從而改善ITP，研究結(jié)果提示該作用機(jī)制可能與抑制巨噬細(xì)胞向M1 型極化并促進(jìn)向M2 型極化相關(guān)，為進(jìn)一步了解ITP 發(fā)病機(jī)制及DMF治療ITP的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。