張雅麗 周 芬 （唐山市工人醫(yī)院呼吸內科，唐山 063000）

肺癌的病死率居惡性腫瘤首位，其中非小細胞肺癌約占肺癌總數的80%，是肺癌最常見的病理類型［1］。由于肺癌的復發(fā)性和轉移性，患者五年生存率僅為18%［2］。腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的主要組成，與腫瘤浸潤和患者不良預后密切相關［3］。TAMs 能夠分化為兩種不同的表型。經典激活途徑產生M1 型TAMs（M1-TAMs），M1-TAMs 能夠分泌干擾素-γ（interferon γ，IFN-γ）和促炎細胞因子，通過抗原呈遞促進腫瘤溶解［4］。旁路激活途徑產生M2型TAMs（M2-TAMs），M2-TAMs 通過促進癌細胞增殖、侵襲、轉移及血管形成等加快腫瘤進展［5］。酪氨酸蛋白激酶/信號轉導及轉錄激活因子（janus protein tyrosine protein kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信號通路在M1/M2型巨噬細胞極化中起關鍵作用，STAT6 是M2-TAMs激活過程中IL-4 介導免疫反應的關鍵因素；抑制STAT6 信號通路能夠誘導M2-TAMs 轉變?yōu)镸1-TAMs［6］。此外STAT6 能夠調節(jié)M2-TAMs 相關特異基因如精氨酸酶-1（arginase 1，Arg1）、甘露糖受體C型-1（mannose receptor C1，Mrc1）、抵抗素樣α（resistin like α，Retnla）（Fizz1）和幾丁質酶樣3（chitinase like 3，chil3）（Ym1）的表達［7-8］。研究發(fā)現阻斷IL-4和IL-13 介導的STAT6 磷酸化，能夠降低巨噬細胞的M2 型極化，從而提高乳腺癌細胞的放射敏感性，并降低細胞耐藥性［9］。研究表明miR-373 在肺癌組織中表達下調，發(fā)揮抑癌基因作用［10］。上調miR-373 表達能夠促進肺癌A549 細胞凋亡，抑制細胞遷移［11］。然 而miR-373 與JAK3/STAT6 信 號 通 路 及M2-TAMs的關系未見報道。

因此，本研究通過A549、H1299 細胞和肺癌移植瘤裸鼠模型，探究miR-373調控JAK3/STAT6 信號通路抑制TAMs向M2極化對肺癌細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6 周齡體質量20～22 g 的SPF 級雄性BALB/c 裸鼠30 只［北京唯尚立德生物科技有限公司，SCXK（京）2021-0010］。飼養(yǎng)于室溫22～25 ℃、標準濕度50%～60%、每天12 h 光照環(huán)境中，正常飲水飲食。本研究經過唐山市工人醫(yī)院倫理委員會批準（20210512）。

1.1.2 主要試劑和儀器 螢火蟲熒光素酶標記的肺癌細胞A549、H1299（中國科學院上海細胞生物學研究所）；人單核細胞THP-1（武漢普諾賽生命科技有限公司）；佛波酯、脂多糖、IL-4、IFN-γ（美國Sigma 公司）；JAK3、p-JAK3、STAT6、p-STAT6（英國Abcam 公司）；CD68、CD206、IL-10 抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；miR-373、Mrc1、Arg1、Fizz1、Ym1、IL-10、CCL2 引物（上海華大基因科技有限公司）；組織切片機（德國Leica 公司）；酶標儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；Bio-Rad蛋白電泳儀、轉膜儀（美國伯樂公司）。

1.2 方法

1.2.1 M1/M2-TAMs 的誘導分化 THP-1 細胞加入佛波酯（100 ng/ml）培養(yǎng)24 h，誘導為M0-M。加入脂多糖（100 ng/ml）和IFN-γ（20 ng/ml）培養(yǎng)24 h，誘導為M1-M。加入IL-4（100 ng/ml）培養(yǎng)24 h，誘導為M2-M。細胞共培養(yǎng)：利用Transwell 系統，將M0-M、M1-M、M2-M 接種于Transwell 小室中，將小室置于接種A549 細胞的6 孔板中共培養(yǎng)48 h，獲得M0-TAMs、M1-TAMs、M2-TAMs。

1.2.2 M0/M2-TAMs 的轉染與分組 根據LipofectamineTM3000 說明書分別將pHRi-miR-NC、pHRimiR-373 轉 染M0/M2-TAMs，記 作M0+miR-NC 組、M0+miR-373 組、M2+miR-NC 組、M2+miR-373 組。轉染4 h 后更換培養(yǎng)基，24 h 后通過RT-qPCR 檢測是否轉染成功。

1.2.3 免疫熒光染色檢測TAMs CD68 水平 取各組TAMs，經4%多聚甲醛固定、0.3%TritonX-100 的5%BSA 封閉、CD68 一抗（1∶400） 4 ℃孵育過夜、次日二抗孵育1 h、DAPI染色、熒光淬滅、中性膠封片，顯微鏡下觀察熒光染色的細胞。

1.2.4 流式細胞儀檢測TAMs CD86、CD206水平取各組TAMs，PBS 洗滌3 次，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS 洗滌3 次，加入0.1%Triton 通透10 min，PBS 洗滌3 次，加入CD86、CD206 抗體，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌3次，重懸細胞，用流式細胞儀檢測CD86、CD206表達。

1.2.5 靶標預測及雙熒光素酶實驗 使用Targetscan 數據庫預測miR-373和JAK3的結合位點，分別構建野生型質粒psi-CHECK-JAK3-WT 和突變型質粒psi-CHECK-JAK3-MUT。利用LipofectamineTM3000分別將兩種質粒與miR-373 mimic、mimic NC混合物轉染至A549、H1299 細胞，轉染48 h 后檢測熒光素酶活性。

1.2.6 RT-qPCR檢測TAMs miR-373、IL-1β、TNF-α、iNOS、COX2、Mrc1、Arg1、Ym1、Fizz1、IL-10 mRNA 及A549、H1299 細胞JAK3、STAT6 mRNA 水平 采用Trizol 試劑從TAMs 和A549、H1299 細胞中提取總RNA 并反轉錄為cDNA，使用SYBR Green 法進行擴增，U6、GAPDH 作內參。使用2-ΔΔCt公式計算miR-373、IL-1β、TNF-α、iNOS、COX2、Mrc1、Arg1、Ym1、Fizz1、IL-10、JAK3、STAT6 mRNA 相對表達水平。PCR 引物序列：miR-373-F：5'-TGCGGGACATTCAGA-3'，miR-373-R：5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；IL-1β-F：5'-AGATCATTTACACAATGC-3'，IL-1β-R：5'-TAAAGTCACCAAAAGGCT-3'；TNF-α-F：5'-GGACCTGCCCTTTGCTGACA-3'，TNF-α-R：5'-AGGCTGATTCTTCCGTTCTTCTTG-3'；iNOS-F：5'-GAAGGGAGAGGAGAGGAGCATCTG-3'，iNOS-R：5'-GTGGTGTGGCTGGGTAAGGAAATAG-3'；COX2-F：5'-GGGTTGCTGGTGGTAGGAATGTTC-3'，COX2-R：5'-CTGGTATTTCATCTGCCTGCTCTGG-3'；Mrc1-F：5'-TGGAAGGGGACATGTCTAGC-3'，Mrc1-R：5'-GCCTTGTTGCTTGGCGTGT-3'；Arg1-F：5'-TGCGGGACATTCAGA-3'，Arg1-R：5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；Ym1-F：5'-TGGAAGGGGACATGTCTAGC-3'，Ym1-R：5'-GCCTTGTTGCTTGGCGTGT-3'；Fizz1-F：5'-TGCGGGACATTCAGA-3'，Fizz1-R：5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；IL-10-F：5'-TGGAAGGGGACATGTCTAGC-3'，IL-10-R：5'-GCCTTGTTGCTTGGCGTGT-3'。

1.2.7 CCK-8檢測細胞增殖能力 將A549、H1299細胞接種于96 孔板，細胞貼壁后更換為TAMs 條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 d、2 d、3 d 后，更換成含10% CCK-8溶液的新鮮培養(yǎng)基，37 ℃下孵育1 h。檢測450 nm處的吸光度。

1.2.8 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將A549、H1299細胞接種于6孔板，其中放置含各組TAMs的Transwell小室，當細胞單壁生長時劃痕，用PBS去除劃掉的細胞，記錄劃痕寬度，培養(yǎng)24 h 后再次記錄劃痕寬度，計算劃痕愈合率。

1.2.9 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 Transwell 小室平鋪一層基質膠，上室加入A549、H1299細胞，下室加入各組TAMs條件培養(yǎng)基，37 ℃下孵育24 h。經甲醛固定、結晶紫染色后，顯微鏡下對穿膜細胞進行觀察和統計。

1.2.10 Western blot 檢 測 細 胞Ki67、MMP-2/9、JAK3、p-JAK3、STAT6、p-STAT6 水 平 取 各 組A549、H1299 細胞，提取、測定并分離蛋白，轉至PVDF 膜，用脫脂牛奶封閉2 h，分別加入Ki67、MMP-2/9、JAK3、p-JAK3、STAT6、p-STAT6 一抗（1∶2 000）4 ℃過夜，二抗（1∶10 000）4 ℃孵育2 h，ECL 顯色劑顯色，凝膠成像儀拍照，分析各組蛋白相對表達量。

1.2.11 動物實驗 30 只裸鼠隨機分為miR-NC 組（轉染pHRi-miR-NC 的A549 細胞）、miR-373 組（轉染pHRi-miR-373 的A549 細胞），每組各15 只。尾靜脈注射已轉染慢病毒的A549 細胞懸液（0.2 ml 1×107個/ml）。1 次/3 d，共10 次。30 d 后處死裸鼠。①裸鼠經異氟烷麻醉后，腹腔注射D 熒光素（30 mg/kg），10 min 后用體內成像系統監(jiān)測裸鼠熒光。②各組隨機取5 只裸鼠肺組織，制作石蠟切片，HE 染色觀察肺組織病理變化。③免疫組化檢測肺組織CD31、VEGFA 表達。④免疫熒光染色檢測CD31、VEGFA、F4/80、CD206 表達。⑤各組取5 只裸鼠肺組織，RT-qPCR 檢測肺組織miR-373、JAK3、STAT6 mRNA 水平。⑥各組取5 只裸鼠肺組織，Western blot 檢 測CD31、VEGFA、Arg1、Mrc1、Ym1、Fizz1、IL-10、CCL2、JAK3、p-JAK3、STAT6、p-STAT6水平。

1.3 統計學分析 數據分析應用軟件SPSS16.0，計量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 M1/M2-TAMs 的誘導分化 免疫熒光染色結果顯示，CD68 表達增加，M1-TAMs 細胞伸長，M2-TAMs 細 胞 呈 圓 形，證 實THP-1 向TAMs 分 化（圖1A）。流式細胞術結果顯示，M1-TAMs 標志物CD86 表達增加，M2-TAMs 標志物CD206 表達增加（圖1B）。RT-qPCR結果顯示，M1-TAMs特征性基因IL-1β、TNF-α、iNOS 和COX2 mRNA 表達明顯升高（P＜0.05）；M2-TAMs 特征性基因IL-10、Mrc1、Arg1、Ym1、Fizz1 mRNA 表 達 明 顯 升 高（P＜0.05）；M2-TAMs中miR-373表達明顯降低（圖1C～E）。

圖1 M1/M2-TAMs的誘導分化Fig.1 Induced differentiation of M1/M2-TAMs

2.2 miR-373 抑制TAMs 向M2 型極化 流式細胞術結果顯示，miR-373 降低了M2-TAMs 標志物CD206 表達，而對M1-TAMs 標志物CD86 表達無影響（圖2A）。免疫熒光染色結果顯示，miR-373 降低了Arg1 表達（圖2B）。與M0+miR-NC 組相比，M0+miR-373 組miR-373 水 平 明 顯 升 高，M2+miR-NC 組miR-373水平明顯降低；與M2+miR-NC 組相比，M2+miR-373 組miR-373 水平明顯升高（P＜0.05，圖2C）。RT-qPCR 結果顯示，miR-373 降低了M2-TAMs 特征性基因IL-10、Mrc1、Arg1、Ym1、Fizz1、CCL2 mRNA表達（P＜0.05），而對M1-TAMs 特征性基因IL-1β、TNF-α、iNOS 和COX2 mRNA 表達無影響（P＞0.05，圖2D～E）。

2.3 miR-373 抑制體外肺癌細胞增殖、侵襲和轉移 CCK-8、劃痕實驗及Transwell 實驗結果顯示，與M0+miR-NC 組相比，M2+miR-NC 組細胞培養(yǎng)3 d 后的OD 值明顯升高，劃痕愈合率及細胞侵襲數明顯增加（P＜0.05）；與M2+miR-NC 組相比，M2+miR-373組細胞3 d 后的OD 值明顯降低，劃痕愈合率及細胞侵襲數明顯減少（P＜0.05，圖3A～E）。Western blot結果顯示，與M0+miR-NC 組相比，M2+miR-NC 組細胞Ki67、MMP-2/9 表達水平明顯升高（P＜0.05）；與M2+miR-NC 組 相 比，M2+miR-373 組 細 胞Ki67、MMP-2/9表達水平明顯降低（P＜0.05，圖3F～G）。

圖3 miR-373體外抑制肺癌細胞增殖、侵襲和轉移Fig.3 miR-373 inhibits proliferation， invasion and metastasis of lung cancer cells in vitro

2.4 miR-373 抑制體內肺癌進展 各組移植瘤隨時間推移不斷生長，光子強度不斷增強。第10 天，miR-373 組與miR-NC 組熒光值無明顯差異，第20、30 天，miR-373組熒光值明顯降低（圖4A）。miR-NC組肺組織顏色發(fā)白，質地較硬，體積大，結節(jié)多；與miR-NC 組相比，miR-373 組肺組織體積明顯變小，結節(jié)變少（P＜0.05，圖4B～C）。HE 染色結果顯示，腫瘤細胞多呈圓形、核分裂相且核深染（圖4D）。免疫組化染色、免疫熒光染色和Western blot 結果顯示，與miR-NC 組 相 比，miR-373 組 肺 組 織CD31、VEGFA蛋白水平明顯降低（P＜0.05，圖4E～H）。

Note：A.Flow cytometry result； B.Immunofluorescence staining； C～E.The expression of characteristic genes of M1/M2-TAMs and miR-373 level.Compared with M0+miR-NC group， *. P＜0.05； compared with M2+miR-NC group， #.P＜0.05.

圖4 miR-373體內抑制肺癌進展Fig.4 miR-373 inhibits lung cancer progression in vivo

2.5 miR-373 抑制肺組織TAMs 向M2 型極化 免疫組化染色和免疫熒光染色結果顯示，與miR-NC組相比，miR-373 組肺組織M2-TAMs 標志物CD206表達明顯減少，而TAMs 標志物F4/80 表達無明顯差異（圖5A、B）。Western blot 結果顯示，與miR-NC 組相比，miR-373 組肺組織M2-TAMs 特征性基因IL-10、Mrc1、Arg1、Ym1、Fizz1、CCL2 蛋白水平明顯降低（P＜0.05，圖5C、D）。

圖5 miR-373抑制肺組織TAMs向M2型極化Fig.5 miR-373 inhibits M2 polarization of TAMs in lung tissue

2.6 miR-373 抑 制JAK3/STAT6 信 號 通 路 TargetScan 結 果 顯 示，miR-373 與JAK3 存 在 結 合 位 點（圖6A）。熒光素酶報告基因實驗顯示，與miR-NC組相比，miR-373 組野生型JAK3 熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而突變型JAK3 熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05，圖6B、C）。RT-qPCR 和Western blot 結果顯示，在A549、H1299 細胞中，與M0+miRNC 組相比，M2+miR-NC 組細胞JAK3、STAT6 mRNA和p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6 蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；與M2+miR-NC 組相比，M2+miR-373組 細 胞JAK3、STAT6 mRNA 和p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6 蛋 白 水 平 明 顯 降 低（P＜0.05，圖6D～G）。在肺組織中，與miR-NC 組相比，miR-373組肺組織JAK3、STAT6 mRNA 和p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6 蛋 白 水 平 明 顯 降 低（P＜0.05，圖6H～J）。

圖6 miR-373抑制JAK3/STAT6信號通路Fig.6 miR-373 inhibits JAK3/STAT6 signal pathway

3 討論

腫瘤微環(huán)境中，M2-TAMs 能夠促進腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲及血管生成，從而加快癌癥進展。越來越多的研究表明miRNA 在肺癌中發(fā)揮重要作用。如miR-21-5p 能夠促進小鼠體內TAMs 向M2型極化，增強體內腫瘤生長、癌細胞增殖及腫瘤內血管 生 成［12］。M2-TAMs 通 過 提 高miR-155 和miR-196a-5p 水平，促進肺癌轉移［13］。本研究顯示，miR-373 在M2-TAMs 中水平降低；在A549 和H1299 細胞中，過表達miR-373能夠抑制TAMs向M2型極化；過表達miR-373 后，細胞增殖、侵襲和遷移能力降低。同時在移植瘤裸鼠模型中也發(fā)現miR-373能夠抑制TAMs 向M2 型極化；同時能夠抑制腫瘤血管生成。說明miR-373通過抑制TAMs向M2型極化對肺癌細胞發(fā)揮作用。

M2-TAMs 與腫瘤的浸潤轉移密切相關。Ki67是一種增殖相關的核抗原，可以反映細胞增殖活性［14］。MMP-2/9 能夠降解細胞外基質，直接影響癌細胞的遷移和侵襲能力［15］。腫瘤微環(huán)境中的TAMs通過分泌促血管生成因子（如CD31和VEGFA）促進血管生成［16］。研究發(fā)現M2-TAMs 能夠上調Ki67 水平，促進H292 細胞和裸鼠移植瘤的生長［17］。人參皂苷Rh2能夠降低TAMs向M2型極化，抑制MMP-2/9的表達，從而抑制肺癌細胞的遷移和侵襲［18］。本研究發(fā)現與普通TAMs 相比，M2-TAMs 處理的A549 和H1299細胞1 d、2 d、3 d的OD值、劃痕愈合率及細胞侵襲數增加，Ki67、MMP-2/9 水平升高；而過表達miR-373 能夠減弱M2-TAMs 對癌細胞的部分影響。說明miR-373能夠抑制肺癌細胞的增殖和轉移。腫瘤血管生成促進腫瘤轉移，本研究分析miR-373 對血管密度和成熟度的影響，發(fā)現過表達miR-373 能夠抑制肺癌組織CD31 和VEGFA 蛋白表達。說明miR-373能夠抑制肺癌血管生成。

TAMs 向M2 型極化受多種信號通路調控。JAK3激活后，磷酸化的STAT6進入細胞核從而調控基因的表達［19］。研究發(fā)現IL-4 通過激活JAK3/STAT6 信號通路將TAMs 活化為M2-TAMs，同時提高Mrc1、Arg1、Ym1、Fizz1 等特征性基因的表達［20］。阻斷JAK3/STAT6 信號通路能夠抑制TAMs 向M2 型極化，從而抑制肺癌的轉移［21］。本研究中miR-373靶向調控JAK3，過表達miR-373 能夠降低JAK3、STAT6 mRNA 及p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6 蛋白水平；降低M2-TAMs 特征 性 基因CD206、IL-10、Mrc1、Arg1、Ym1、Fizz1、CCL2水平。說明miR-373通過抑制JAK3/STAT6信號通路抑制TAMs向M2極化。

綜上所述，miR-373 通過抑制JAK3/STAT6 信號通路抑制TAMs 向M2 極化，從而抑制肺癌細胞增殖、侵襲轉移和血管生成。